用於診斷阿爾茨海默氏病的快速檢測方法
2023-07-04 08:27:56 1
專利名稱:用於診斷阿爾茨海默氏病的快速檢測方法
技術領域:
本發明涉及一種診斷阿爾茨海默氏病或該疾病早期或傾向的方法,該方法是基於可外周獲得的細胞,例如皮膚細胞或淋巴細胞在(a)促有絲分裂刺激之前和(b)促有絲分裂刺激之後的促有絲分裂的可表達表面標記,優選CD 69的定量分析,特定的刺激指數ab為阿爾茨海默氏病或該疾病早期或者傾向的信號。本發明也涉及適於實施本發明診斷方法的試劑盒。
阿爾茨海默氏病不能通過臨床方法和可利用的臨床旁學(paraclinical)方法以及基於器械和技術的方法最終確診。其總是需要屍體解剖的驗證。常常很難進行相對於其它痴呆病因的診斷區分,尤其是在疾病的早期。然而,在疾病的這些極早期階段,由於兩個原因,確診是很重要的。一方面,可以診斷區分痴呆病的潛在可治療形式從而可對受試者進行有效的治療,另一方面,這些階段是對阿爾茨海默氏病在神經退行性過程中給予任何形式的治療性幹預的先決條件,這種治療性幹預只有在這些早期階段才能獲得成功。這種確診僅僅可由阿爾茨海默氏病的生物學標記來保證,即通過適用於該疾病的易測定的敏感性和特異性的生物學變化。
因此阿爾茨海默氏病的生物學標記具有診斷價值且尤其有助於安全鑑定處於潛伏期和臨床早期的危險人群和病人。生物學標記也用於後續檢查以及預後和對治療性幹預應答的監控。模式生物學標記應符合特定的理論和實踐要求。它們尤其包括高特異性和敏感性,鑑定潛伏期的能力,以及高陽性和陰性的指示值。生物學標記應該是可測定的,如有可能,應以一種非-侵入的方式測定且既不會給患者帶來負擔又不會使其驚恐。這種分析應是低成本的並且易於操作且,如有可能,可由家庭醫生操作。不幸地是,當前已知的阿爾茨海默氏病生物學標記沒有一種符合上述的要求。尤其是由於已知生物學標記敏感性和特異性較低,因此不合適用於診斷方法。其它具有較高敏感性和特異性的診斷檢驗需要複雜的技術先決作為條件,因此不適於對大部分病人進行局部使用。
因此,本發明實質上是基於提供用於阿爾茨海默氏病診斷的簡單方法的技術問題,因此可進行阿爾茨海默氏病的診斷,潛伏期的檢測以及阿爾茨海默氏病與其它痴呆病高度敏感性和特異性的診斷區分。
通過提供權利要求中描述的實施方案解決了這些技術問題。很可能開發一種診斷方法,所述方法是基於利用可外周獲得的患者細胞諸如皮膚細胞或血液淋巴細胞在存在和不存在有絲分裂刺激的條件下,例如在免疫磁性細胞分離之後對促有絲分裂指數(活化指數)的測定。這些細胞的激活伴隨可被定量檢測的在表面上存在的激活標記,所述定量檢測優選通過抗原-抗體相互作用進行,磁性粒子優選包被有所使用的抗體,從而可使磁性細胞分離並隨後在促有絲分裂刺激前後對具有這種表面標記的細胞數目進行定量分析。這種特徵能夠表明與正常狀態相區別的特異性的疾病狀態。因此本發明的方法可用於阿爾茨海默氏病的診斷,潛伏期的檢測以及阿爾茨海默氏病與其它痴呆病的診斷鑑別。
因此,本發明涉及一種利用患者樣品診斷阿爾茨海默氏病或這種疾病的早期階段或傾向的方法,該方法包括如下步驟(a)對樣品中可外周獲得的細胞進行促有絲分裂刺激;(b)利用促有絲分裂刺激後表達的一種或多種表面標記定量分析步驟(a)之前和之後細胞群體內促有絲分裂刺激的細胞,利用直接針對所述表面標記的抗體將具有表面標記的細胞與不具有表面標記的細胞分離;以及
(c)測定刺激指數,此指數表明步驟(a)之前和之後具有表面標記的細胞數目之間的關係,刺激指數達到未刺激的對照樣品的至少10倍,最大100倍是阿爾茨海默氏病或該疾病早期階段或傾向的病徵。
本領域技術人員知曉用於獲得適於本發明方法的患者樣品的合適方法,所述樣品含有充足的促有絲分裂刺激的細胞。例如,合適的樣品為皮組織樣品,優選來自靜脈血的血樣,來自腦脊髓液的細胞以及來自尿液的細胞。
在本發明診斷方法的優選實施方案中,例如,當使用血樣時,在其它方法步驟之前添加抗凝血的化合物,例如檸檬酸鈉或肝素,可以起到穩定樣品的目的。
在這裡使用的術語「阿爾茨海默氏病的診斷」也包括後續檢查,因此包括預後,治療性幹預效果的監控以及該疾病與其它痴呆病的診斷鑑別。
在這裡使用的術語「可外周獲得的細胞」是指不用手術或以(最低限度地)侵入的方式可從人的組織取得的細胞,它們包含例如,皮膚細胞和外周血的淋巴細胞,後者優選用於本發明的方法。
用於獲得表面標記表達的促有絲分裂刺激可通過使用已知刺激物,諸如植物凝集素(PHA),蛋白A,PWM或其它具有萎縮或有絲分裂效果的化合物來實現。該刺激可受添加單獨化合物或組合添加物的影響。
本領域技術人員已知用於這種刺激的合適的實驗條件,例如所使用的有絲分裂原的濃度,刺激的持續時間及其它的溫育條件。刺激應在允許氣體充分交換的合適容器中進行。相應刺激劑的濃度應相應的生理學範圍內,既在1μg/ml至20μg/ml PHA,1μg/ml至50μg/mlPWM,以及10μg/ml至200μg/ml蛋白A。刺激時間取決於待檢測分子的表達率。然而,對於特定的檢驗,2至24小時的刺激時間應該是必需的。在當表達的表面標記分子為CD 69時,4小時的刺激時間是最佳的。刺激應在生理條件下進行,例如可以在37℃,5%CO2的氣體恆溫箱中進行。
本領域技術人員同樣也知曉用於表徵促有絲分裂刺激效果本身的合適的表面標記,例如CD 69,CD 25,CD 45RO,CD 63和HLA-Dr,優選表面標記CD 69。為實現本發明的目的,同樣也可實施表面標記組合的測定或通過進一步鑑定由特定的表面標記分離的細胞,其中特定的表面標記為例如CD 69,來進行檢測,其中有關對亞細胞群的進一步鑑定,例如可以利用其它表面標記亞群(例如CD 4+和/或CD 8+和/或CD 19+和/或CD 56+)來進一步鑑定。
從刺激前後具有表面標記的細胞數目的關係得出刺激指數(活化指數)。刺激指數達到未刺激的對照樣品的至少10倍,最大100倍是阿爾茨海默氏病或該疾病早期階段或傾向的病徵。刺激指數小於未刺激對照樣品的10倍不表徵阿爾茨海默氏病或該疾病早期階段或傾向。可根據常規方法測定具有表面標記的細胞,例如,Western印跡,ELISA,RIA,FACS,LSC等。
為了確定具有表面標記的細胞,優選利用特有的細胞特徵,將它們與不具有表面標記的細胞或具有其它表面標記的細胞分離。
在本發明的診斷方法中,通過直接針對目的表面標記的抗體將具有表面標記的細胞與不具有表面標記的細胞分離。適用於此目的的抗體可以是單克隆的,多克隆的或合成的抗體或其片段。在這方面,術語「片段」是指與完全抗體具有相同的表位特異性的單克隆抗體的所有部分(例如,Fab,Fv或單鏈Fv片段)。這種片段的製備是本領域技術人員公知的,許多直接針對表面標記的抗體也是可市售獲得的。
在本發明診斷方法最優選的實施方案中,表面標記的特異抗體結合在磁性粒子上,例如,順磁性磁珠(例如,獲自DYNALA.S.,P.O.Box158 Skyen,N-0212Oslo,Norway),其允許根據目前的方法通過免疫磁性分離法分離具有相應表面標記的細胞。
因此刺激指數可在利用目前方法測定的核酸含量和/或蛋白質含量的基礎上,通過確定利用目的表面標記分離的細胞的量進行限定,所述的核酸含量和/或蛋白含量的測定方法,例如在細胞裂解之後通過分光光度法或利用特異性染料例如溴化乙錠、碘化丙啶、吖啶橙、DAPI等對核酸染色後利用光度計定量分析來測定核酸或蛋白質含量。可利用標準曲線由樣品的蛋白和/或核酸含量計算細胞數。
本發明也涉及一種適合於實施本發明診斷方法的試劑盒且其至少含有下列組分(a)一種用於促有絲分裂刺激的化合物;(b)至少一種直接針對在促有絲分裂刺激之後表達的表面標記的抗體,優選結合在磁性粒子上的抗體。
本發明的試劑盒還優選含有(a)至少一種反應容器;(b)一種抗凝血化合物和/或用於細胞裂解的緩衝液;(c)用於固定細胞的緩衝液;(d)定量分析DNA和/或蛋白濃度所需的物質以及用於製作標準曲線的預製溶液;(e)用於分離結合在磁性粒子上(如果使用結合在磁性粒子上的抗體時則包含)的細胞的磁體;以及(f)用於除去結合上的磁性粒子(如果使用結合在磁性粒子上的抗體時則含有)的試劑。
在本發明試劑盒的優選實施方案中,抗體為抗-CD 69抗體。此外,試劑盒可另外含有,或含有代替的抗-CD 69抗體,抗-CD 4和/或抗-CD 8抗體。
最後,合適時,本發明的試劑盒可與一種或多種合適的其它檢測劑組合存在,例如螢光-耦合的初級抗體,次級抗體,用於蛋白和/或核酸的檢測劑,例如嵌入染料等等。
實施例利用阿爾茨海默氏病患者的CD 69測定促有絲分裂的刺激指數可對活著的患者(生物學標記)進行的阿爾茨海默氏病目前已知特徵的測定僅僅顯示不充分的敏感性和特異性或由於成本或高度複雜的檢驗方案的原因不適於大規模的檢驗。用臨床方法,僅僅確診80%至90%且尤其難以在疾病早期進行診斷區分。由於缺乏合適的生物學標記對該疾病潛伏期的檢測目前是不可能的。
就阿爾茨海默氏病而言,神經退行性變化是基於營養和促有絲分裂信號的胞內介導的幹擾過程。這些胞內信號轉導的功能紊亂並不局限於神經系統。它們也類似地存在於這些患者的皮膚細胞和外周血的淋巴細胞上。由於其疾病特異性,這種變化是具有診斷價值的且適於作為生物學標記。
在下述實施例中,在促有絲分裂刺激前後,通過對表達CD 69的淋巴細胞免疫磁性細胞分離進行確定是否存在阿爾茨海默氏病典型的營養和促有絲分裂信號胞內介導的功能紊亂的問題。
利用來自SARSTEDT公司的血液提取系統通過靜脈穿刺來收集血液。提取過程中通過摻入血液提取系統中的抗凝血劑諸如檸檬酸鈉或肝素鈉穩定血液。在此形式中,其可在室溫下儲存24至48小時。刺激實驗在可被充分充氣的反應容器中進行,諸如Greiner bio-one公司的24孔懸浮培養板。為此,有絲分裂植物凝集素(PHA),蛋白A和美洲商陸有絲分裂原(PWM)被單獨或以不同的組合用於各400μL的穩定化全血。在此實施例中,相應的有絲分裂原的終濃度在生理學範圍內且為12μg/ml的PHA,50μg/ml的蛋白A和4μg/ml的PWM。在氣體恆溫箱中37℃和5%CO2濃度的生理條件下進行該刺激4小時。取100μl的刺激的全血與包被抗體的不同磁性粒子溫育。在此實施例中,使用來自DYNAL公司的抗-CD 4和抗-CD 8包被的磁性粒子。將相應的磁性粒子過量添加於特定的樣品(10μl磁性粒子懸浮液)中來確保相應淋巴細胞亞群的完全分離。在4℃溫育30分鐘之後,磁性分離相應的淋巴細胞亞群且在隨後的衝洗步驟之後,將獲得的淋巴細胞亞群轉入100μl所限定的培養基中,在此實施例中為與1%胎牛血清(FCS)混合的RPMI1640。在此實施例中利用各10μl的DYNAL公司的DETACHaBEAD除去結合上的磁性粒子。室溫下溫育45分鐘之後,分離所去除的磁性粒子且在若干衝洗步驟之後將細胞懸液吸取在所限定的培養基中,在此實施例中為RPMI1640。通過添加特異性裂解緩衝液,裂解細胞,用特異性DNA染料,諸如溴化乙錠、碘化丙啶、吖啶橙或DAPI標記DNA,且隨後經光度定量分析。通過利用Bradford的蛋白質測定法比較確定了樣品的蛋白質含量。通過標準曲線由樣品的DNA和/或蛋白質含量計算細胞數。此方法可以直接得到細胞數目。由促有絲分裂刺激前後表達CD 69的細胞的數目計算係數(刺激指數),此指數提供了關於這些細胞促有絲分裂刺激能力變化的信息。
刺激指數達到未刺激對照樣品的至少10倍,最大100倍是阿爾茨海默氏病或該疾病早期階段或傾向的病徵。刺激指數小於未刺激對照樣品的10倍不表徵阿爾茨海默氏病或該疾病的早期階段或傾向。
在另一實驗中,為了確定表達CD 69的細胞的數目,同樣測定了樣品的蛋白含量和DNA的含量。在這裡,DNA的定量不是通過加入DNA染色物質來測定的,而是通過測定DNA或蛋白對特定波長(例如260nm或280nm)的光的吸收值來確定其濃度的。
權利要求
1.一種利用患者樣品診斷阿爾茨海默氏病或該疾病的早期階段或傾向的方法,該方法包括以下步驟(a)對樣品中可外周獲得的細胞進行促有絲分裂刺激;(b)利用促有絲分裂刺激後表達的一種或多種表面標記定量分析步驟(a)之前和之後細胞群體內促有絲分裂刺激的細胞,利用直接針對所述表面標記的抗體將具有表面標記的細胞與不具有表面標記的細胞分離;以及(c)測定刺激指數作為步驟(a)之前和之後具有表面標記的細胞數目之間的關係,達到未刺激的對照樣品的至少10倍,最大100倍的刺激指數是阿爾茨海默氏病或該疾病早期階段或傾向的病徵。
2.根據權利要求1的方法,其中所說的樣品為血樣且細胞為淋巴細胞。
3.根據權利要求1或2的方法,其中所說的表面標記為CD 69。
4.根據權利要求3的方法,其中所說的CD 69+細胞被進一步限定為CD 4+和/或CD 8+亞群。
5.根據權利要求1至4之任一項的方法,其中在步驟(a)之前用一種或多種抗凝血化合物穩定化所說的血液。
6.根據權利要求1至5之任一項的方法,其中用PHA,蛋白A或PWM刺激所說細胞。
7.根據權利要求1的方法,其中步驟(b)中所說的抗體結合在磁性粒子上且通過免疫磁性分離法進行分離。
8.根據權利要求1至7之任一項的方法,其中通過測定步驟(a)之前和之後具有表面標記的細胞的蛋白質含量和/或核酸含量來檢測所說的刺激指數。
9.一種用於診斷阿爾茨海默氏病或該疾病的早期階段或其傾向的試劑盒,該試劑盒含有下列組分(a)一種用於促有絲分裂刺激的化合物;(b)至少一種直接針對促有絲分裂刺激之後表達的表面標記的抗體。
10.根據權利要求9的試劑盒,該試劑盒還含有(c)一種抗凝血化合物;和/或(d)一種用於細胞裂解的緩衝液。
11.根據權利要求9或10的試劑盒,其中所說的抗體為結合在磁性粒子上的抗體。
12.根據權利要求9至11之任一項的試劑盒,其中所說的抗體為抗-CD 69抗體。
13.根據權利要求9至12之任一項的試劑盒,該試劑盒還含有抗-CD 4和/或抗-CD 8抗體。
全文摘要
本發明涉及診斷阿爾茨海默氏病或該疾病的早期階段或傾向的方法。所述方法基於可促有絲分裂表達的表面標記,尤其是CD 69,以及可外周獲得的細胞,例如皮膚細胞或淋巴細胞,在促有絲分裂刺激(a)之前(b)之後的定量測定。特異性刺激指數a∶b是表明阿爾茨海默氏病或該疾病早期階段或傾向的病徵。本發明也涉及適於實施本發明診斷方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK1871519SQ200480031004
公開日2006年11月29日 申請日期2004年9月29日 優先權日2003年10月22日
發明者託馬斯·阿倫特, 延斯·施蒂勒 申請人:萊比錫大學