一種檢測貝肉中鎘-金屬硫蛋白的酶聯免疫吸附測定方法
2023-07-04 14:05:01 1
專利名稱：一種檢測貝肉中鎘-金屬硫蛋白的酶聯免疫吸附測定方法
技術領域：
本發明屬於一種檢測貝肉中金屬硫蛋白的酶聯免疫吸附測定方法。
背景技術：
由於人類對重金屬的開採、冶煉、加工及商業製造活動日益增多，造成不少重金屬 如鉛、汞、鎘、鈷等進入大氣、水、土壤中，引起嚴重的環境汙染。在工業「三廢」汙染中，尤其 以重金屬如鎘，汞，鉛等環境汙染最為突出。水生生物對鎘的富集能力極強，水中的鎘通過 食物鏈富集後可在其體內達到相當高的濃度，如魚類可富集IO3 IO5倍，貝類富集IO5 IO6倍。鎘被人體吸收後，在體內形成鎘蛋白，選擇性地蓄積於腎、肝，其中腎臟可吸收進入 體內近1/3的鎘，是鎘中毒「靶器官」。鎘損傷腎小管，患者出現糖尿、蛋白尿和胺基酸尿，特 別是使骨骼的代謝受阻，造成骨質疏鬆、萎縮、變形等一系列症狀。目前貝類鎘含量的測定方法主要有原子吸收法、比色法和原子螢光法，這些檢測 方法的共同特點是要使用大型儀器，要對樣品進行消化，消化過程中要使用大量的硝酸、高 氯酸等帶來環境汙染，耗時長。另外由於貝類樣品中鎘的測定基體幹擾較嚴重，測定結果的 準確度和精密度存在較大的不確定性。金屬硫蛋白是一類廣泛存在於生物體內的低分子量、富含半胱氨酸、可被重金屬、 激素及各種細胞因子誘導的金屬結合蛋白，它的一個顯著特點是分子中的大量巰基與金屬 離子尤其是重金屬離子具有很強的結合力，且可在轉錄水平上被環境中的金屬所誘導合 成，這種誘導可以反映出環境受金屬汙染的水平，故金屬硫蛋白可以作為重金屬汙染的生 物標誌物，其研究成為環境與生物醫學領域研究的熱點。酶聯免疫吸附測定法是把抗原抗體免疫反應的高度特異性和酶促反應的高度敏 感性有機地結合起來的一種檢測技術。由於酶的催化效率很高，使測定方法具有高敏感度。 故本發明通過建立酶聯免疫吸附測定法檢測貝肉中金屬硫蛋白的含量從而間接得出貝肉 中鎘含量。鄭軍恆等(1999)從人胎肝中分離提純了金屬硫蛋白的兩個亞型，並用亞型1為 抗原免疫青紫蘭兔製備了抗血清，以純化的抗體建立了人金屬硫蛋白的酶聯免疫吸附檢測 方法。Margarita Apostolova等利用從小鼠肝臟中提取的鎘-金屬硫蛋白誘導紐西蘭兔合 成鎘-金屬硫蛋白抗體，並用此抗體建立了一種靈敏的酶聯免疫吸附法檢測血清和組織中 的金屬硫蛋白。吳力專建立的競爭型酶聯免疫吸附法靈敏度約為4. lng/ml。國內外對金屬硫蛋白提取製備及酶聯免疫吸附法都有研究，而誘導家兔合成 鎘-金屬硫蛋白抗體，再提純抗體建立酶聯免疫吸附法檢測貝肉中的鎘金屬硫蛋白，從而 間接檢測貝肉中鎘含量的研究還處於空白。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測貝肉中鎘_金屬硫蛋白的技術，它能有效的反應貝 肉中鎘的汙染情況，為貝肉中重金屬鎘的檢測提供了一種有效手段。本發明包括如下步驟
1.鎘金屬硫蛋白的誘導將100 μ 1 0. 2mg/L 0. 6mg/L的氯化鎘注射到0. 5 2年的企鵝珍珠貝中，每天 注射1次，共注射6 8次，誘導貝體內大量合成鎘_金屬硫蛋白；2.鎘-金屬硫蛋白的分離提純取出貝肉全臟器，用超純水清洗，冰上剪碎，稱量，加入2倍體積預冷的 pH8. 60. 01mol/L的Tris-HCl緩衝液勻漿，勻漿後加入一倍體積的V(0. Olmol/lTris-HCl, pH8. 6) V(CH3CH2OH) V(CH3Cl) = 1 1. 05 0. 08 混合液，混勻，4°C靜置過夜。10000 12000r/min離心20 30min，上清液置80°C水浴加熱3 5min，同上離心。上清中加入 3倍體積_20°C預冷的無水乙醇，攪拌，-20°C放置過夜，4°C下，10000 12000r/min，離心 20 30min，沉澱用Tris-HCl溶解，同上離心，上清即為鎘-金屬硫蛋白粗提液。粗提液先 後經S印hadex G-50、DEAE-52柱層析後得到鎘-金屬硫蛋白亞型，再經S印hadex G-25脫 鹽，冷凍乾燥；3.鎘_金屬硫蛋白抗體的製備將100 150mg金屬硫蛋白、200 300mg牛血清蛋白溶解於20 30mlpH7. 00. lmol/L的磷酸緩衝液中，振蕩下滴加1 %戊二醛10 15ml，25 30°C反應2 3h形成偶聯物，4°C保存。把偶聯物注射到家兔中誘導鎘-金屬硫蛋白抗體的合成，每隔7 10天加強免疫一次，約2 3次後試血。用瓊脂雙向擴散實驗測定抗體效價達1 16以上 時通過心臟採血法採血；4.鎘-金屬硫蛋白抗體的提純將全血靜置，等血清析出後，4000rpm離心取上清。用飽和硫酸銨沉澱法對血清中 鎘-金屬硫蛋白抗體進行粗提，粗提液用透析袋透析脫鹽，DEAE-Sephadex A50柱層析分 離，測定280nm和260nm處的OD值，OD260nm OD280nm的光吸收比率應低於0. 6，比率高則應 重新提純；5. ELISA 的建立包被，封閉，加兔抗體貝鎘_金屬硫蛋白抗體與樣品，加酶標羊抗兔抗體，加底物， 加H2SO4終止反應，在酶標儀上450nm波長讀數。本發明具有以下優點1.本發明的原理科學合理，技術步驟比較成熟，是一種有效可靠而且快速靈敏的 檢測方法。2.本發明用於檢測貝肉中的鎘-金屬硫蛋白含量從而間接反應貝肉重金屬鎘的 汙染情況，這為貝肉中重金屬鎘的檢測提供了一種快速靈敏的檢測方法。3.本發明的靈敏度較高，檢出限可達到2 lOng/ml。
具體實施例方式上述的S印hadex G-50 層析用 pH8. 60. 01mol/L Tris-HCl 緩衝液以 lml/min 的洗 脫速度進行洗脫，DEAE-52柱層析用pH8. 60. 01mol/L Tris-HCl作為緩衝液以0 0. 5mol/ L的NaCl進行梯度洗脫，流速lml/min。在抗體的誘導過程中每次多點注射100 200 μ g 的鎘_金屬硫蛋白，共注射六次，前三次用一倍體積的弗氏完全佐劑乳化，後三次用一倍體 積的弗氏不完全佐劑乳化。以PH7. 40. 01mol/L的PBS溶液洗脫DEAE-S印hadex A50柱純化粗提後的鎘_金屬硫蛋白抗體。 ELISA的建立過程中，加待測樣品的包被液80 120 μ 1，2 5°C包被過夜，用 250 μ 1洗滌液洗滌3 5次；加100 300 μ 1封閉液，35 39°C封閉2h，同上洗滌；加 30 60 μ g/ml的兔抗貝鎘-金屬硫蛋白抗體40 60 μ 135 39°C封閉2h，同上洗滌；加 稀釋好的辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗90 110 μ 1，35 39°C封閉2h，同上洗滌；加 TMB底物100 300 μ 1，35 39°C反應20 30min ；加2mol/L的H2S0450 μ 1終止反應，酶 標儀上450nm處讀數。
權利要求
一種檢測貝肉中鎘 金屬硫蛋白的酶聯免疫吸附測定方法，其特徵包括如下步驟(1)誘導選擇0.5～2年的珍珠貝，對其注射100μl 0.2～0.6mg/L的氯化鎘，注射6～8次；(2)粗提將貝肉加Tris HCl勻漿，4℃過夜，冷凍離心，取上清於70～90℃水浴3～5min，冷凍離心，上清液中加3倍體積乙醇， 20℃過夜，同上離心，沉澱用Tris HCl溶解，再同上離心，上清即為鎘 金屬硫蛋白粗提液；(3)純化粗提液先後經Sephadex G 50、DEAE 52柱層析後得到鎘 金屬硫蛋白亞型。再用Sephadex G 25脫鹽。冷凍乾燥後即為成品；(4)抗原的製備用戊二醛將鎘 金屬硫蛋白與牛血清蛋白相偶聯，再用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑乳化得可注射抗原；(5)抗體的誘導將處理好的抗原注射到家兔體內誘導抗體的合成，當抗體效價達到1∶16以上時心臟取血；(6)抗體的提純先用飽和硫酸銨法對抗體進行粗提，在用DEAE Sephadex A50進行純化；(7)酶聯免疫吸附測定法的建立包被；封閉；加一抗與樣品；加酶標二抗；加底物；加終止液；在酶標儀上450nm波長讀數。
全文摘要
一種檢測貝肉中鎘-金屬硫蛋白的酶聯免疫吸附測定方法，採用氯化鎘誘導貝合成鎘-金屬硫蛋白，再用提純的金屬硫蛋白誘導兔合成抗體，再對抗體進行分離提純，用達到電泳純的兔抗貝金屬硫蛋白抗體作一抗，用山羊抗兔酶標抗體作二抗，採用間接競爭型酶聯免疫吸附法測定貝金屬硫蛋白的含量。本發明的原理科學合理，技術步驟比較成熟，用於檢測貝肉中的鎘-金屬硫蛋白含量，從而間接反應貝肉中鎘的汙染情況，這為貝肉中重金屬鎘的測定提供了一種快速靈敏的檢測方法。
文檔編號G01N33/543GK101900726SQ201010227649
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者吳曉萍, 吳育廉, 廖愛琳, 廖豔, 楊捷, 梁鵬, 鄧楚津 申請人:廣東海洋大學