一種富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法
2023-05-31 19:23:31 1
專利名稱：一種富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法
技術領域：
本發明涉及分析化學中樣品前處理領域，具體是涉及一種以磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法。
背景技術：
克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇為苯乙醇胺類化合物，屬於β_受體激動劑類藥物，可促進動物如牛、豬、羊、家禽等生長，並增強體內的脂肪分解代謝，顯著提高瘦肉率。所以自20世紀80年代以來，β -受體激動劑被大量添加於飼料中，以促進家畜生長和提高瘦肉率。β -受體激動劑易在動物組織，特別是內臟中蓄積殘留，其通過食物鏈進入人體後可引發肌肉震顫、心律失常、頭痛等症狀，嚴重者可能危及生命。鑑於以上原因，我國已於1997將克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等列為禁止在飼料和養殖家畜飲用水中使用的藥品。但是目前仍有養殖者將其違法使用在畜牧業中，引發藥物殘留，從而對消費者健康造成嚴重損害。目前檢測活體動物排洩尿樣中β_受體激動劑殘留是判斷動物飼養過程中是否添加受體激動劑的有效手段之一。當前，在所有β_受體激動劑中，克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等是最為常用的三種受體激動劑。針對克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等造成的養殖家畜源性食品安全問題，建立尿樣中中痕量克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺的快速、簡便的分離富集方法，對提高定量檢測的靈敏度以及準確性，具有重要意義。目前，在痕量分析物的食品安全檢測分析中，有將近一半的誤差來源於樣品的前處理，而真正來源於儀器檢測的誤差還不足三分之一，且近70%的工作量都耗費在樣本的前處理階段。因此，發展快速、`高效的樣品前處理方法，對痕量分析物進行高效快速富集後再檢測，是減少痕量分析物檢測誤差、縮短檢測時間的有效手段。現有的養殖家畜尿樣中中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的提取、淨化方法主要參照中華人民共和國農業部行業標準(農業部1063號-3-2008文件)執行，文件中規定了養殖家畜尿樣中11種β_受體激動劑殘留量液相色譜-串聯質譜法測定的具體流程。其中樣品前處理步驟如下:取澄清養殖家畜尿樣5 mL，添加內標工作液100 μ (含克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D9各100 Pg/mL)，充分混勻。5 mol/L氫氧化鈉調節溶液pH至9-10，加叔丁醇-叔丁基甲醚(6:4)提取液10 mL，充分震蕩，7000 r/min離心10min，移取上清，重複提取一次，合併上清，旋轉蒸乾(40°C)。0.2%甲酸水溶液溶解後過混合型強陽離子柱。與本發明方法相比，現有農業部行業標準樣品前處理流程相對較長，包括兩次提取淨化以及旋轉蒸乾等步驟。而本方法僅需簡單地調整一次尿樣PH值即可。
發明內容
本發明目的提供了一種更為簡便和快速有效的養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇高效富集的方法。本發明中所米用的技術屬於磁分散固相萃取技術範疇，磁固相萃取(MagneticSolid Phase Extraction, MSPE)是一種以表面功能化的磁球(Magnetic Beads, MBs)為吸附劑的新型固相萃取方法。原理見圖1，該磁球以超順磁性納米四氧化三鐵為核，經非磁性聚合物材料包裹而成。通過在磁球表面修飾不同的化學功能團對目標物進行吸附。該方法結合了磁分離的簡便性與分散固相萃取吸附的高效性，採用分散固相萃取模式，克服了傳統固相萃取中過柱操作的缺點(如過柱耗時長、易堵塞、流速太快可造成的吸附效率下降，以及裝柱時吸附劑填裝不均勻密實產生的短路等問題)；同時由於磁球粒徑介於納米和亞微米之間，比表面積遠大於固相萃取材料(固相萃取材料粒徑範圍一般為20-100 μ m之間)，吸附容量大，吸附劑用量少，可實現微量洗脫液洗脫，富集倍數高，且可省去常規前處理流程中的旋轉蒸發等濃縮步驟；納米材料在溶液中具有良好的單分散性，在溶液中可均勻分布，比表面積大，提高了萃取過程中吸附劑吸附待分離物的速率，縮短了吸附時間；同時可在短時間內處理大體積樣品，有利於通過加大樣品處理量來增加富集係數，降低檢測限。具體來說本發明的技術方案包含下列步驟:
(1)樣品處理:取尿樣5 10mL，調節尿樣pH至5 7;
(2)吸附:加入適量磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球，混勻，充分·吸附，磁場分離磁球，棄去上清；
(3)洗脫收集:加200-800μ 洗脫溶劑將磁球上的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇洗脫，分離磁球，收集洗脫液；其中洗脫溶劑為含5%氨水的甲醇或乙醇溶液(即100份洗脫溶劑中95份為甲醇或乙醇，5份為氨水)。樣品可以使用牛、豬、羊、馬等養殖養殖家畜的尿樣。加入的磁球數量從節約材料角度以能充分吸附尿樣中的目標物為準。分離磁球可以採用常規的磁力架分離或者通過離心分離磁球等方法。聚苯乙烯超順磁磁球表面修飾有磺酸基功能團(見圖2)，通過磺酸基等作用將目標物吸附，為了達到更好的富集效果，磺酸基修飾磁球粒徑為7(T300 nm ;該範圍的磁珠能更好的在溶液中分散，當然在此粒徑範圍之外的磁珠也能達到富集的作用。本發明還涉及到上述富集方法在養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的分析檢測中應用，只需收集洗脫液，過濾後直接進行液相或者液相色譜-質譜聯用定量分析。過濾可以直接採取常規液相或液質聯用進樣所需的0.45 ym或0.22ym濾膜過濾，液相色譜或液相色譜-質譜聯用的條件可以直接採取隱色孔雀石綠和隱色結晶紫分析條件，此為常規實驗技術，不再贅言。粒徑範圍在70-300 nm的磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球可以按照如下步驟製備:一步法合成磺酸基修飾聚苯乙烯磁性微球(粒徑範圍在70-300 nm):化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米單顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化，無水乙醇洗滌後氮氣吹乾；取5g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒,用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒，超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入400 mL, 0.0lM含0.2 0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超聲波頻率為25KHz，超聲功率為200-300 W條件下繼續超聲乳化30min，形成細乳液；加0.1g K2S2O8於70°C反應2(T40 min後加入0.5 g乙烯基磺酸鈉，繼續反應12 h ;磁架吸附磁球，即獲得內含超順磁性Fe3O4納米單顆粒，表面修飾有磺酸基的磁球，磁球粒徑大小與溶液中SDS含量以及超聲功率成反比；磁架回收磁球，製備好的磺酸化磁球依次採用飽和食鹽水、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗滌各I 3 h，最後以0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩衝液洗滌磁球至中性，並將磁球重懸於0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩衝液中於4°C保存備用。採用上述製備方法，可以使得磁球具有穩定性好、重現性好的優點。磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球可以還按照如下步驟製備:
以羧基化聚苯乙烯磁性微球為原料:將表面羧基修飾的商品化聚苯乙烯磁球分散於pH4.0-5.0硼酸鹽緩衝液中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀醯亞胺以活潑酯法活化磁球上的羧基；取上述表面羧基被活化後的磁球，加入5^20倍於磁球表面羧基密度的對氨基苯磺酸溶液，溶液PH調至8.(T9.0,室溫下振蕩反應2 4 h ;磁架回收磁球，製備好的磺酸化磁球依次採用飽和食鹽水、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗滌各Γ3 h，最後以0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩衝液洗滌磁球至中性，並將磁球重懸於0.01mol/L pH 7.0磷酸鹽緩衝液中，4 °C保存備用。本發明技術方案具有如下優點:1、本發明採用磁固相萃取方法(具體原理見圖1)，能有效地富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇，且吸附效率高，樣品提取回收率高；並且本方法尿樣預處理非常簡單，只需要將尿樣調整PH即可，大大提升了分析速度。2、本方案中磁球的溶液單分散性好，在溶液中可均勻分布，比表面積大，提高了吸附劑吸附待分離物的速率，縮短了吸附時間；與本發明方法相比，現有農業部行業標準樣品前處理流程相對較長，包括兩次提取淨化以及旋轉蒸乾等步驟。而本方法僅需簡單地調整一次尿樣pH值即可。3、磁球粒徑 小，比表面積遠大於固相萃取材料，吸附容量大，吸附劑用量少，可實現微量洗脫液洗脫，富集倍數高，且可省去常規前處理流程中的旋轉蒸發等濃縮步驟，對分析物破壞少，減少了檢測誤差。
圖1磁固相萃取原理圖。圖2本發明磁球結構圖。
具體實施例方式為了使本發明更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1合成直徑70 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
參照文獻(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米單顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化,無水乙醇洗漆後氮氣吹乾；取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒，用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入400 mL, 0.0lM含0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，300 ff (25KHz)功率繼續超聲乳化30 min，形成細乳液；加0.1g K2S2O8於70°C反應2(T40 min後加入0.5 g乙烯基磺酸鈉，繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得粒徑為100 nm的表面修飾有磺酸基的磁球。實施例2合成直徑100 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
參照文獻(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米單顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化,無水乙醇洗漆後氮氣吹乾；取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒，用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入400 mL, 0.0lM含0.4%的SDS的NaHCO3溶液中，300 ff (25KHz)功率繼續超聲乳化30 min，形成細乳液；加0.1g K2S2O8於70°C反應2(T40 min後加入0.5 g乙烯基磺酸鈉，繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得粒徑為100 nm的表面修飾有磺酸基的磁球。實施例3合成直徑200 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
參照文獻(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米單顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化,無水乙醇洗漆後氮氣吹乾；取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒，用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入400 mL，0.0lM含0.25%的SDS的NaHCO3溶液中，250 ff (25KHz)功率繼續超聲乳化30 min，形成 細乳液；加0.1g K2S2O8於70°C反應2(T40 min後加入0.5 g乙烯基磺酸鈉，繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得粒徑為200 nm的表面修飾有磺酸基的磁球。實施例4合成直徑300 nm磺酸基化聚苯乙烯磁球
參照文獻(Yan F，Li J, Zhang J, Liu F，Yang ff.J.Nanopart.Res.，2009, 11(2):289 296)方法，化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米單顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化,無水乙醇洗漆後氮氣吹乾；取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒，用體積比15:1的苯乙烯-十六燒混合液5 mL懸浮Fe3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體，將磁流體轉入400 mL, 0.0lM含0.2%的SDS的NaHCO3溶液中，200 ff (25KHz)功率繼續超聲乳化30 min，形成細乳液；加0.1g K2S2O8於70°C反應2(T40 min後加入0.5 g乙烯基磺酸鈉，繼續反應12h。磁架吸附磁球，即獲得粒徑為300 nm的表面修飾有磺酸基的磁球。實施例5以粒徑為100 nm的磺酸基化聚苯乙烯磁球為吸附劑共同富集、淨化豬尿中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇
O添加克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的豬尿樣品的製備:取經農業部1063號公告-3-2008文件方法驗證不含克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的新鮮豬尿4份，每份各5mL，向每份尿樣中添加等量的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇以及相應的氘代標準品，添加量分別為0.5、1、5和10 ng,其中氣代標準品添加量分別為2.5 ng。2)以粒徑為100 nm的磺酸基化聚苯乙烯磁球為吸附劑共同富集、淨化加標豬尿中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇，操作流程如下:用IN HCl調整尿樣pH至5.0。將10mg磺酸基化修飾的磁球加入上述尿樣中,振蕩混勻後靜置吸附5 min,磁力架分離磁球,棄去提取液；I mL甲醇洗滌磁球兩次，400 μ L 5%氨化甲醇浸泡磁球I分鐘後，磁力架分離磁球，收集洗脫液過0.22 Mffl濾膜後直接用於液相色譜-質譜聯用法定量分析。本方法整個提取、富集淨化過程耗時約20-25 min。3)參照農業部1063號_3_2008文件方法用液相色譜-質譜聯用法測定所得富集液中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的含量，內標法定量。液相色譜條件為:
色譜柱:Agilent Eclipse plus C18 (100 mmX2.1 mm,1.8 Mm);進樣量:IOKL ;柱溫:30°C ;流動相:0.2%甲酸/甲醇溶液(50:50)，流速為0.2 mL /min。質譜條件:
離子源:電噴霧ESI，正離子模式；掃描方式:多反應監測MRM;霧化氣、窗簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應優化至最優靈敏度；監測離子對:克倫特羅m/z277/203 (定量離子)、氘代克倫特羅-D9 m/z 286/204 (定量離子)，沙丁胺醇m/z 240/148(定量離子)、氘代沙丁胺醇-D3 m/z 243/151 (定量離子)，萊克多巴胺m/z 302/164 (定量離子)、氘代萊克多巴胺m/z 307/167 (定量離子)。4)回收率的計算:將由液相色譜-串聯質譜法測定得到的富集淨化液中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的含量，除以加標量得到加標樣品中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率。5)不同添加量時本專利提取富集方法的加標回收率見表I。由表可知，本實驗方法提取回收率較高，可達到國標要求。表I加標回收實驗結果`
權利要求
1.一種富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特徵在於包含以下步驟: (1)樣品處理:取尿樣5 10mL，調節尿樣pH至5 7; (2)吸附:加入適量磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球，混勻，充分吸附，磁場分離磁球，棄去上清； (3)洗脫收集:加200-800μ 洗脫溶劑將磁球上的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇洗脫，分離磁球，收集洗脫液；其中洗脫溶劑為含5%氨水的甲醇或乙醇溶液。
2.根據權利要求1所述的富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特徵在於步驟(2)中聚苯乙烯超順磁磁球表面修飾有磺酸基功能團，磺酸基修飾磁球粒徑為70 300 nm。
3.根據權利要求1所述的富集方法，其特徵在於每5mL尿樣所需磁球劑量為7.5-20mg ο
4.根據權利要求1所述的富集方法在養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的分析檢測中應用，其特徵在於收集洗脫液，過濾後直接進行液相或者液相色譜-質譜聯用定量分析。
5.根據權利要求3所述的富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法，其特徵在於所述粒徑為7(T300 nm，磺酸基修飾的聚苯乙烯磁球按照如下步驟製備: 化學共沉澱法合成超順磁性Fe3O4納米單顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸化，無水乙醇洗滌後氮氣吹乾；取5 g表面油酸化的Fe3O4納米顆粒，用體積比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL懸浮F e3O4納米顆粒,超聲5 10 min形成磁流體,將磁流體轉入400 mL, 0.0lM含0.2 0.5%的SDS的NaHCO3溶液中，超聲波頻率為25KHz，超聲功率為200-300 W條件下繼續超聲乳化30min，形成細乳液；加0.1g K2S2O8於70°C反應2(T40 min後加入0.5 g乙烯基磺酸鈉，繼續反應12 h ;磁架吸附磁球，即獲得內含超順磁性Fe3O4納米單顆粒，表面修飾有磺酸基的磁球，磁球粒徑大小與溶液中SDS含量以及超聲功率成反比；磁架回收磁球，製備好的磺酸化磁球依次採用飽和食鹽水、3% NaOH以及3% HCl浸泡洗滌各廣3 h，最後以0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩衝液洗滌磁球至中性，並將磁球重懸於0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩衝液中於4 °C保存備用。
全文摘要
本發明公開了一種富集養殖家畜尿樣中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的方法。本發明涉及分析化學領域特別是樣品前處理的方法。本發明先通過樣品預處理，再加入表面修飾有磺酸基的聚苯乙烯超順磁納米或亞微米磁球吸附，洗脫，收集洗脫液。洗脫溶液可直接用於液相色譜-質譜聯用定量分析克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的含量。本發明方法具有操作流程簡單、提取回收率高、洗脫溶劑用量少、無需旋蒸的特點。
文檔編號G01N30/08GK103076416SQ20121031629
公開日2013年5月1日 申請日期2012年8月31日 優先權日2011年11月15日
發明者熊勇華, 許恆毅, 吳科盛, 郭亮, 梁語嫣, 徐峰, 賴衛華 申請人:南昌大學