固相多肽合成曲普瑞林的製備方法
2023-05-31 17:55:41 1
專利名稱：：固相多肽合成曲普瑞林的製備方法
技術領域：
：本發明涉及曲普瑞林的製備方法，尤其涉及固相多肽合成曲普瑞林的製備方法。
背景技術：
：中文名曲普瑞林，醋酸曲普瑞林，英文名Triptorelin，TriptorelinAcetate結構式pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，分子式C64H82N18Ol3分子量1311.5曲普瑞林臨床用於治療相關性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宮內膜異位、中樞性性早熟症等。曲普瑞林是一種促性腺激素釋放激素類似物，主要作用於垂體前葉，大劑量應用初期可以引起一過性黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)釋放增多，後期則導致垂體敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌減少。醋酸曲普瑞林用於治療相關性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宮內膜異位、中樞性性早熟症。1974年日本武田化工的FujinoMasahiko等人首先發明促黃體激素釋放激素的十肽醯胺類似物的合成工藝。並在日本、德國、美國等國家申請專利，專利號分別為JP19740027442、DE2446005、US4008209(液相法)。目前的方法均存在著一定的缺陷，每一輪脫帽須用三氟醋酸，故接肽收率低，導致生產成本較高；三廢汙染多，並使用三氟醋酸進行純化，汙染環境，純化收率一般在25%以下。因此目前的方法限制了醋酸曲普瑞林的大規模生產和使用。
發明內容本發明需要解決的技術問題是公開一種固相多肽合成曲普瑞林的製備方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。本發明的方法包括如下步驟(1)以.RinkAmideAM樹脂或.RinkAmideMBHA樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的胺基酸，獲得保護十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，同步進行脫側鏈保護基團；(2)切肽，獲得粗品；(3)粗品經C18(或C8)柱分離純化，凍幹後，製得曲普瑞林精品。按照本發明，所說的依次連接具有保護基團的胺基酸，獲得保護十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團的方法，包括如下步驟(1)製備Fmoc-Gly-樹脂取所說的樹脂用DMF浸泡0.52小時，使樹脂充分溶脹，抽乾，然後加入溶解於接肽試劑的Fpioc-Gly-OH(FW:297.3)、TBTU/HBTU(FW:321)和HOBt(FW:153，)的混合物，106(TC反應0.54小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，106(TC反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾。所說的樹脂取代量為0.5-1.lmmol/g;所說的接肽試劑為NMM:DMF=1:5~15，體積比，下同；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比，下同；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數為樹脂的2~6倍；HOBt的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g;(2)製備Fmoc-Pro-Gly-樹脂在步驟(1)的Fmoc-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，10~60"反應5~60分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，然後加入溶解於接肽試劑的Fmoc-Pro-OH(FW:337.4)、TBTU/HBTU(FW:321)、HOBT(FW:153,)的混合物，1060。C反應0.5-1.5小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Pro-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，106(TC反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗漆，抽乾。所說的樹脂取代量為0.5-1.lmmol/g;所說的接肽試劑為NMM:DMF-1:5~15，體積比，下同；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比，下同；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數為樹脂的2~6倍；HOBT=的摩爾數為樹脂的26倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g;(3)製備Fmoc-Arg(Pbl)-Pro-Gly-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，1060。C反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW:648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060。C反應0.5-4小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數為樹脂的26倍。HOBT摩爾數為樹脂的26倍；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；(4)製備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(3)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，10-60。C反應5~60分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Leu-OH(FW:321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060。C反應0.54小時，抽乾，.分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Leu-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(5)製備Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(4)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106(TC反應5~60分鐘，抽千，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Trp-OH(FW:354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，106(TC反應0.5~4小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-D-Trp-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(6)製備Fmoc-Tyr(tBu)-D陽Trp-Leu-Arg(Pbf)隱Pro-Gly-樹脂在歩驟(5)的Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，10~60°。反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW:459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060。C反應0.5-4小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(P的-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5-20ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(7)製備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(但u)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(6)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106(TC反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW:383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10~60°C反應0.5~1.5小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(8)製備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)隱D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(7)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106℃反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Trp-OH(FW:426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，106(TC反應0.5-4小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為520ml/g;Fmoc-Trp-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(9)製備Fmoc-His(Trt)-T卬-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(8)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106(TC反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW:619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060'C反應0.54小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)墨Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的26倍。Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(10)製備pGlu-His(Trt)國Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(9)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Tip-Leu-Arg(PbO-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，1060。C反應560分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的pGlu-OH(FW:129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10-60。C反應0.54小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽千，獲得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)國Tyr(tBu)-D-Trp國Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;pGlu-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上。按照本發明，所說的切肽包括如下步驟將上述步驟(10)所獲得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加入預冷至010'C的切肽試劑中，203(TC反應1~3小時，減壓蒸除溶劑，加入乙醚沉澱，收集沉澱物，用乙醚洗，真空乾燥，獲得切肽後的粗品；所說的切肽試劑為TFA/EDT/H20/TIS=800680ml/3518ml/3518ml/l03.6ml;按照本發明，粗品經C18(或C8)柱分離純化分離純化的方法包括如下歩驟將曲普瑞林粗品溶於乙酸中，過濾，濾液經C18(或C8)柱純化，流速為100-650ml/min;檢測波長為280nm;用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合併後去鹽，凍幹，獲得成品，總收率25.4(以樹脂的60mmo1計)。乙酸的重量濃度為0.5~10%，乙酸中曲普瑞林粗品的重量濃度為150%;流動相為0.11M醋酸鹽或磷酸鹽或三氟乙酸乙腈=96:14;本發明的曲普瑞林工藝路線有下列特點，具備規模化生產能力，工藝穩定，原輔材料來源方便，生產周期短，生產成本低，三廢少，收率高，質量穩定，生產成本低，極具市場競爭力，接肽收率高(每步接肽收率為》98%)，降低了成本，採用切肽試劑(TFA/EDT/H20/TIS)進行切肽，加入乙醚沉澱粗品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢汙染少，且提高收率，採用C18(或C8)柱進行分離純化，避免使用TFA(三氟醋酸)進行純化，減少三廢，純化收率高達25%以上，每步接肽收率均在98%以上；切肽後收率為78.8%，總收率為25.4%。具體實施例方式實施例1實施例和前述過程中所採用的原料列表如下tableseeoriginaldocumentpage13實施例中接肽試劑為NMM:DMF=1:10，體積比;脫帽試劑為PIP:DMF=1:3.5，體積比；合成肽鏈製備Fmoc-Gly-樹脂1)取75g樹脂(0.8mmol/g樹脂，60mmol)，用1000mlDMF浸泡1小時，使樹脂充分溶脹，抽乾。2)取71g(FW:297.3240mmo1)Fmoc-Gly-OH、77.lg(FW:321,240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25'C反應1小時。3)抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗漆三次，抽乾。製備Fmoc-Pro-Gly-樹脂1)加1000ml脫帽試劑，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。2)取81g(FW:337.4,240mmo1)Fmoc-Pro-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25'C反應1小時。3)抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。製備Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂1)加1000ml脫帽試齊U，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。2)加入155.7g(FW:648.8，240mmo1)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、77.1g(FW:321，240纖o1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25'C反應1小時。3)抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。製備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。力卩84.9g(FW:354,240mmo1)Fmoc國Leu-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25。C反應l小時。其餘操作同上。製備Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加lOOOml脫帽試齊U，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。加84.9g(FW:354,240mmo1)Fmoc-D-lYp-OH、77.1g(FW:426.5，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25'C反應1小時。其餘操作同上。製備Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。加110.4g(FW:459.5，240匪o1)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25。C反應1小時。其餘操作同上。製備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。加92.1g(FW:383.4，240mmo1)Fmoc-Ser(tBu)-OH、77.1g(FW:321,240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240腿o1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25'C反應1小時。製備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂力口1000ml脫帽試劑，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。加126.3g(FW:426.5，240畫o1)Fmoc-Trp-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25'C反應1小時。其餘操作同上。製備Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。加148.7g(FW:619.7,240腿o1)Fmoc-His(Trt)-OH、77.1g(FW:321，240謹o1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25。C反應l小時。加入1000ml脫帽試劑，25。C反應10分鐘。製備pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應15分鐘，抽乾，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，抽乾。加30.9g(FW:129,240mmo1)pGlu-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應容器，25'C反應1小時。切肽將保護十肽轉移至1000ml反應器中，加入事先配製好並預冷至約5'C的試劑(TFA/EDT/H2O/TIS=680ml/18ml/18ml/3.6ml),25。C攪拌2小時。減壓除溶劑至小體積，加入1000ml冷乙醚沉澱，離心收集，用無水乙醚洗後，真空乾燥。得曲普瑞林粗品62g(47.3mrno1)，收率78.8%。分離純化-將曲普瑞林粗品溶於5%乙酸中，過濾，濾液經C18柱純化，流動相0.1MNH4Ac:乙腈(7.5:2.5，體積比)；流速為500ml/min;檢測波長為280nm;用液相色譜儀跟蹤收集所需要的^[出液，樣品峰合併後去鹽，凍幹，約得20g白色塊狀物成品(MW:131L5，15.25mmo1),總收率25.4%(以樹脂的60mmo1計)。權利要求1.固相多肽合成曲普瑞林的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)以.RinkAmideAM樹脂或.RinkAmideMBHA樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的胺基酸，獲得保護十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，同步進行脫側鏈保護基團；(2)切肽，獲得粗品；(3)粗品經C18(或C8)柱分離純化，凍幹後，製得曲普瑞林精品。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所說的依次連接具有保護基團的胺基酸，獲得保護十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團的方法，包括如下歩驟(1)製備Fmoc-Gly-樹脂取所說的樹脂用DMF浸泡，使樹脂溶脹，抽乾，然後加入溶解於接肽試劑的Fmoc-Gly-OH(FW:297.3)、TBTU/HBTU(FW:32I)和HOBt(FW:153，)的混合物，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾；所說的接肽試劑為NMM:DMF=1:5~15，體積比，下同；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比，下同；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數為樹脂的2~6倍；HOBt的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-Gly-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g;(2)製備Fmoc-Pro-Gly-樹脂在歩驟(1)的Fmoc-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，然後加入溶解於接肽試劑的Fmoc-Pro-OH(FW:337.4)、TBTU/HBTU(FW:321)、'HOBT(FW:153,)的混合物，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Pro-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾。所說的接肽試劑為NMM:DMF=1:5~15，體積比；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數為樹脂的2~6倍；HOBT=的摩爾數為樹脂的26倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g;(3)製備Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW:648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數為樹脂的2~6倍。HOBT摩爾數為樹脂的26倍；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；(4)製備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(3)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，203(TC反應5~30分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Leu-OH(FW:321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，203(TC反應0.5~1.5小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Leu-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍。Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(5)製備Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(4)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，2030。C反應5~30分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Trp-OH(FW:354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，203(TC反應0.5~1.5小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(PW)-Pro-Gly-樹脂；混合物中-Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-D-Trp-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(6)製備Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(5)的Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，20~30"反應5~30分鐘，抽乾，分別用DMF和乙醇洗漆，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW:459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，2030。C反應0.5~1.5小時，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(7)製備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(6)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW:383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(PbO-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(8)製備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(PbO-Pro-Gly-樹脂在步驟(7)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Trp-OH(FW:426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly隱樹月旨；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Trp-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-SerOBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(9)製備Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)隱Pro-Gly-樹脂在步驟(8)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，力口入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW:619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly陽樹脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾數為樹脂的26倍；Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上；(10)製備pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(9)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp陽Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，加入用接肽試劑溶解的pGlu-OH(FW:129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，抽乾，分別用DMF和乙醇洗滌，抽乾，獲得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)匿Pro-Gly陽樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;pGlu-OH的摩爾數為樹脂的2~6倍；Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其餘操作以及工藝條件同上。3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所說的切肽包括如下步驟將權利要求2步驟(IO)所獲得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-1"0-0^-樹脂加入預冷至0~10^的切肽試劑中，反應，收集切肽後的粗品；所說的切肽試劑為TFA/EDT/H20/TIS=800680ml/3518ml/3518ml/l03.6ml。4.根據權利要求l所述的方法，其特徵在於，粗品經C18(或C8)柱分離純化分離純化的方法包括如下步驟將曲普瑞林粗品溶於乙酸中，過濾，濾液經C18(或C8)柱純化，流速為100-650ml/min;檢測波長為280nm;用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合併後去鹽，凍幹，獲得成品，總收率25.4(以樹脂的60mmo1計)；流動相為0.11M醋酸鹽或磷酸鹽或三氟乙酸乙腈=96:14。5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，乙酸的重量濃度為0.5~10%，乙酸中曲普瑞林粗品的重量濃度為1~50%。6.根據權利要求15任一項所述的方法，其特徵在於，脫帽反應溫度為10~60°C，反應時間為530分鐘。7.根據權利要求15任一項所述的方法，其特徵在於，接肽反應溫度為10~60°C，反應時間為0.5-1.5小時。8.根據權利要求15任一項所述的方法，其特徵在於，切肽溫度為10~60°C，時間為1~6小時。全文摘要本發明公開了一種固相多肽合成曲普瑞林的製備方法，包括如下步驟以.RinkAmideAM樹脂或.RinkAmideMBHA樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的胺基酸，獲得保護十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，同步進行脫側鏈保護基團及切肽，獲得粗品，粗品經C18(或C8)柱分離純化，凍幹後，製得曲普瑞林精品。本發明的方法，工藝穩定，原輔材料來源方便，生產周期短，收率高，質量穩定，生產成本低，接肽收率高，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢汙染少，純化收率高達25％以上，每步接肽收率均在98％以上；切肽後收率為78.8％，總收率為25.4％。文檔編號C07K7/06GK101357936SQ200710044419公開日2009年2月4日申請日期2007年7月31日優先權日2007年7月31日發明者周逸明,頎崔申請人:崔頎;周逸明;上海蘇豪逸明製藥有限公司