孕婦外周血中胎兒dna的提取方法

2023-06-22 04:33:11

專利名稱：孕婦外周血中胎兒dna的提取方法
技術領域：
本發明屬於分離提取DNA技術領域。
背景技術：
出生缺陷指嬰兒出生時就存在的各種包括身體結構、智力或代謝等方面的異常。我國是世界上缺陷新生兒的高發國家之一，全國每年出生的2000萬名新生兒有5%存在出生缺陷，每30秒就有一個缺陷兒出生。出生缺陷可由染色體畸變、基因突變等遺傳因素引起，也可由這兩種因素交互作用或其他不明原因所致。現有的科研成果顯示基因突變在出生缺陷發生中發揮重要性，所以對胎兒DNA變異的產前篩查是降低出生缺陷的重要手段。胎兒DNA變異檢測的材料必須來自胎兒自身，傳統的產前診斷是建立在羊膜腔穿刺、絨毛吸取等侵入性基礎上進行的細胞遺傳學診斷，雖然診斷準確，但因其操作有創傷性，易引起宮內感染、流產、甚至對 胎兒有一定的影響，屬於侵入性檢查。而孕婦血漿中胎兒游離DNA的提取只需要採集孕婦血漿標本，無需穿刺羊膜腔和插入絨毛組織，具有對胎兒無任何創傷、可在妊娠早期診斷等優點，屬於非侵入性胎兒遺傳病產前篩查，安全而易於推廣。由於通常人類血漿中游離DNA的總濃度為1-100 ng/mL，胎兒DNA只佔孕婦血漿中總DNA的5% 7%，比例較低。大量母源DNA背景無疑增加了對於胎兒游離DNA檢測的難度，而且游離於母血中的胎兒DNA為短片斷，一般小於200bp，不易捕獲。因此，從孕婦外周血富集到高濃度和高純度的胎兒DNA是開展非侵入性產前胎兒篩查的關鍵，需要開發專用技術。人血漿或血清中純化並濃縮游離DNA和RNA的技術和試劑盒主要用於血漿中總DNA的提取，不能滿足從孕婦血漿或血清中純化並濃縮胎兒DNA的需要，難以進行胎兒遺傳病產前篩查，而且進口的試劑和試劑盒價格昂貴。中國專利200610013153.5公開了一種富集孕婦血漿中胎兒游離DNA的方法，能夠有效提高孕婦血漿中胎兒DNA的提取率，但其對於胎兒DNA的提取率太低，難以保證產前篩查的準確性，不能滿足胎兒遺傳病產前篩查的要求。

發明內容
本發明提供一種孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，採用蛋白酶複合劑將蛋白質降解為小肽或胺基酸，從而實現DNA與蛋白質高效分離，提取液中胎兒DNA佔總DNA的90%以上，能夠滿足胎兒遺傳病產前篩查的需要，為開展非侵入性胎兒遺傳病產前篩查提供必要的技術保障。本發明所採取的技術方案是:
一種孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，包括下述步驟:
(I)採集孕婦外周血5-10mL，加入EDTA抗凝，4°C下1200_1700g離心5-10分鐘，吸取
上清液；(2)在步驟(I)所得上清液中加入蛋白酶複合劑，4°C下1200-1700g離心5-10分鐘，吸取上層水相；
(3)在步驟(2)所得上層水相中加入Tris飽和酚混勻，41:下4000-4600g離心25-35分鐘，吸取上層清液；
(4)在步驟(3)所得上層清液中加入氯仿/異戊醇混合液充分混勻，4°C下4000-4600g，離心5-10分鐘，吸取上層水溶液；
(5)在步驟(4)所得上層水溶液中加入體積濃度為95%的乙醇充分混勻，4 °〇下7000-9000g高速離心5-10分鐘，取得DNA沉澱；
(6)加20-100mLTE溶解DNA沉澱，TE溶解的DNA溶液進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，硝酸銀染色，選擇切取目的條帶固定，得到胎兒DNA粗回收液； (7)胎兒DNA粗回收液用100-200mL無水乙醇沉澱DNA，20-100mLTE溶解DNA沉澱，得到DNA提取液。蛋白酶複合劑中蛋白酶K的濃度為5_20mg/mL、纖維蛋白溶酶的濃度為1000-5000pg/mL,木瓜蛋白酶的濃度為100_400ng/mL和胃蛋白酶的濃度為5-10ng/mL。氯仿/異戊醇的混合液中氯仿/異戊醇的體積比為24:1。步驟(2)中加入上清液總體積8-14%的蛋白酶複合劑。步驟(3)中加入與上層水相等體積的Tris飽和酚。步驟(4)中加入與上層清液等體積的氯仿/異戊醇混合液。步驟(5)中體積濃度為95 %的乙醇的加入量為上清水溶液體積的1.5-3.0倍。步驟(5)中所述乙醇的溫度為4°C。血漿和血清是檢測釋放入血的游離核酸最主要的標本來源，人體外周血游離DNA分子常常以與蛋白質結合的形式存在，染色質的基本結構就是由DNA與組蛋白結合構成。同時血漿中含有豐富的蛋白，包括白蛋白與纖維蛋白等，易於同DNA結合，因此清除蛋白質是提取外周血游離DNA的關鍵。製備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整性。目前，採用蛋白酶K(proteinase K)對蛋白質進行水解，為了提高水解效率，本發明的蛋白酶複合劑不但含有蛋白酶K，還增加了低濃度的纖維蛋白溶酶(fibrinolysin),木瓜蛋白酶(Papain )和胃蛋白酶。其中，纖維蛋白溶酶在纖維蛋白溶解過程中能夠起到催化作用，胃蛋白酶作為一種消化性蛋白酶，可以將蛋白質分解為小的肽片段，木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、鹼性條件下均能分解蛋白質的蛋白酶。因此，蛋白酶複合劑可以高效地溶解蛋白質，並使蛋白質二級結構消失，將蛋白質降解成小肽或胺基酸，從而使DNA與蛋白質分開。同時蛋白酶複合劑能迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，以保證DNA分子不被降解，可使孕婦外周血游離DNA富集效果在原有基礎上提高了 20%。在胎兒游離DNA提取過程中，抗凝劑的使用、離心速度等都會影響提取DNA的量和實驗結果的準確性、可靠性。離心技術用於外周血細胞的清除，血漿蛋白的清除和200bpDNA片段的沉澱等目的，離心速度、時間會影響外周血細胞和血漿蛋白的清除，以及DNA的純度和得率。過低的溫度使得酶反應不充分而影響對蛋白質的降解，從而對胎兒游離DNA造成汙染，過高的溫度可降解DNA分子，影響離心最終獲得DNA的質和量，因此將溫度設定為 4。。。為了保證提取DNA的量和實驗結果的準確性、可靠性，本申請對抗凝血的離心速度、時間、溫度等參數等均進行了調整與優化，以提高提取樣本的可靠性。分別採用蛋白酶K和蛋白酶複合劑進行進行DNA提取，提取結果見下表:
權利要求
1.一種孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於其包括下述步驟: (1)採集孕婦外周血5-10mL，加入EDTA抗凝，4°C下1200_1700g離心5-10分鐘，吸取上清液； (2)在步驟(I)所得上清液中加入蛋白酶複合劑，4°C下1200-1700g離心5-10分鐘，吸取上層水相； (3)在步驟(2)所得上層水相中加入Tris飽和酚混勻，41:下4000-4600g離心25-35分鐘，吸取上層清液； (4)在步驟(3)所得上層清液中加入氯仿/異戊醇混合液充分混勻，4°C下4000-4600g，離心5-10分鐘，吸取上層水溶液； (5)在步驟(4)所得上層水溶液中加入體積濃度為95%的乙醇充分混勻，4 °〇下7000-9000g高速離心5-10分鐘，取得DNA沉澱； (6)加20-100mLTE溶解DNA沉澱，TE溶解的DNA溶液進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，硝酸銀染色，選擇切取目的條帶固定，得到胎兒DNA粗回收液； (7)胎兒DNA粗回收液用100-200mL無水乙醇沉澱DNA，20-100mLTE溶解DNA沉澱，得到DNA提取液。
2.根據權利要求1所述的孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於所述蛋白酶複合劑中蛋白酶K的濃度為5-20mg/mL、纖維蛋白溶酶的濃度為1000-5000pg/mL，木瓜蛋白酶的濃度為100-400ng/mL和胃蛋白酶的濃度為5_10ng/mL。
3.根據權利要求 1所述的孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於所述氯仿/異戊醇的混合液中氯仿/異戊醇的體積比為24:1。
4.根據權利要求1或2所述的孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於步驟(2)中加入上清液總體積8-14%的蛋白酶複合劑。
5.根據權利要求1或3所述的孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於步驟(3)中加入與上層水相等體積的Tris飽和酚。
6.根據權利要求1所述的孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於步驟(4)中加入與上層清液等體積的氯仿/異戊醇混合液。
7.根據權利要求1所述的孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於步驟(5)中體積濃度為95 %的乙醇的加入量為上清水溶液體積的1.5-3.0倍。
8.根據權利要求1所述的孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，其特徵在於步驟(5)中所述乙醇的溫度為4°C。
全文摘要
本發明公開了一種孕婦外周血中胎兒DNA的提取方法，屬於分離提取DNA技術領域。其包括下述步驟(1)採集孕婦外周血，加入EDTA抗凝，離心；(2)加入蛋白酶複合劑，離心；(3)加入Tris飽和酚混勻，離心；(4)加入氯仿/異戊醇混合液充分混勻,離心；(5)加入乙醇充分混勻，高速離心，取得DNA沉澱；(6)製備得到胎兒DNA粗回收液；(7)得到DNA提取液。本發明採用蛋白酶複合劑將蛋白質降解為小肽或胺基酸，從而實現DNA與蛋白質高效分離，提取液中胎兒DNA佔總DNA的90%以上，能夠滿足胎兒遺傳病產前篩查的需要，為開展非侵入性胎兒遺傳病產前篩查提供必要的技術保障。
文檔編號C12N15/10GK103205416SQ20131013348
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者吳超群, 管麗 申請人:邯鄲市康業生物科技有限公司