丹皮酚在製備抗內毒素血症的藥物中的應用的製作方法

2023-06-22 14:45:46

專利名稱：丹皮酚在製備抗內毒素血症的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有機有效成分的醫藥配製品，具體涉及含有直接與環相連的氧原子的酮類化合物的醫藥配製品。
背景技術：
丹皮酚又稱牡丹酚，分離自中藥牡丹、芍藥的乾燥根皮和徐長卿的根或全草，是一種具有廣泛生物活性的物質。其化學名稱為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，分子式為C9H1003，相對分子質量為166.18。丹皮酚藥理活性廣泛，且具有半衰期短、不良反應少等優勢，具有廣泛的應用前景。目前研究發現，丹皮酚劑量依賴性抑制角叉菜聚糖誘導的大鼠的熱覺過敏反應，減少大鼠爪部皮膚滲出液中中性粒細胞浸潤和TNF-α ,IL-β ,IL-10及前列腺素(PGE2)和環氧合酶(C0X2)的含量，可能具有抗過敏與抗炎作用。丹皮酚還能顯著提高體外培養的大鼠主動脈環內皮細胞一氧化氮合酶(eNOS)形成，並能有效抑制血管緊張素(Ang- 11)、5_羥色胺(5-HT)等抑制腫瘤細胞增殖，可能具有心血管保護作用。丹皮酚還能誘導凋亡，抑制瘤細胞遷移與腫瘤新生血管的形成，可能具有抗腫瘤作用。丹皮酚是一種具備多種臨床療效的中藥有效成分，在多系統、多器官疾病防治中發揮作用。目前有關丹皮酚的藥理作用分析正在逐步深入。目前內毒素休克的高發病率和死亡率仍然是困擾醫學界的一大難題，而主流抗生素失效的速度比替代藥物的研製速度更快。隨著有關內毒素信號機制研究的不斷深入，發現核轉錄因子高遷移率族蛋白BI (high mobility group box-lprotein, HMGBl)可能是導致內毒素休克晚期致死性的關鍵因子。目前已有多種HMGBl抗體、抑制劑如HMGBlA box、正丁酸鈉(Sodium Butyrate, SB)、丙酮酸乙酯等受到了國內、國外研究者的關注。因此,開發一種新的HMGBl抑制劑具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供丹皮酚的新用途，即丹皮酚在製藥中的新用途。上述新用途實際上是，丹皮酚在製備抗內毒素血症的藥物中的應用。上述應用中所述的丹皮酹主要是從毛茛科植物牡丹(Paeonia moutan Sim.)皮，蘿蘑科植物徐長卿(Pycnostelma panicuIatum K.Schum)的全草等中提取。上述應用中所述的藥物由丹皮酚和醫學上可接受的輔料組成，其中丹皮酚的含量為0.001 10%。所述藥物可以是注射劑，也可以是常見的口服製劑，如片劑、軟膠囊和滴丸。根據HMGBl結構與毒性機制研製新型抗感染藥物成為治療和控制日益加劇的感染性疾病的新希望。HMGBl是細胞核內一類30KD非組蛋白染色體結合蛋白，維持核小體結構，參與基因轉錄。研究發現,受內毒素(lipopolysaccharide, LPS)刺激後，細胞核中HMGBl向胞漿移位，被包裝到分泌性溶酶體內分泌出胞，這種方式被稱為「主動分泌」。主動分泌的HMGBl再結合RAGE和/或TLR4受體，通過TLR4/MyoD88/NF_KB信號通路，加劇炎症級聯瀑布反應，造成多器官功能障礙甚至死亡，成為一種致死性毒性的炎症因子。HMGBl還有一種出胞方式是壞死或受損的細胞崩解，低乙醯化的HMGBl直接從細胞核中漏出到胞夕卜，稱為「被動釋放」。當細胞正常凋亡時，HMGBl在細胞核內被固化包裹，不會漏出到細胞外環境。但是，HMGBl也是機體維持正常生理作用的重要蛋白，低劑量的HMGBl還可增強淋巴細胞免疫功能，因此，調控HMGBl的策略不能是完全抑制其表達，而是要減少HMGBl分泌出胞。但是目前HMGBl的抗體和抑制劑大多是在減少HMGBl表達量上，而忽視了 HMGBl的重要生理功能。本發明所述的藥物可以在LPS刺激條件下抑制HMGBl出核，HMGBl的主要表達部位在細胞核內，可以用於治療因HMGBl分泌而產生的毒性作用；另一方面，本發明所述的藥物通過穩定HMGBl在細胞核內，可以調控HMGBl相關的基因轉錄，用於治療相關疾病。這是完全不同於抗生素、HMGBl抗體的藥理特點，與HMGBl抗體相比，有較優越的安全性和獨特性，具有重要的臨床應用價值。


圖1是MTT法檢測丹皮酚抑制RAW264.7細胞活性的效果圖，其中，圖1A為用丹皮酚處理RAW264.7細胞24h後IC50值的曲線圖；圖川和圖1C為用丹皮酚處理RAW264.7細胞24h、48h後的細胞活性的條形圖；圖1D和圖1E為LPS刺激條件下用丹皮酚處理RAW264.7細胞24h、48h後的細胞活性的條形圖。圖2是共聚焦顯微鏡觀察丹皮酚抑制HMGBl出核的顯微放大圖(放大600倍)，其中，圖2E、F、G、H、1、J和K中的白色箭頭指示在細胞質中的HMGB1，圖21、J、K、L中的方框指示多核形細胞。圖3是Western blot方法檢測丹皮酚抑制LPS刺激的HMGBl出核作用的電泳圖和相應的條形圖，其中，圖3A為以Tub I in為內參，細胞質中HMGBI表達情況的電泳圖；圖3B為HMGBl/Tublin的條形圖；圖3(:為以Lamin B為內參，細胞核中的HMGBl表達情況的電泳圖；圖3D為HMGBl/Lamin B的條形圖；圖3E為以GAPDH為內參，RT-PCR檢測HMGBl表達情況的電泳圖；圖3F為HMGB1/GAPDH的條形圖。
具體實施例方式實施例1 (滴丸)取丹皮酚160mg，加入PEG4000150g作為基質，適量液體石蠟為冷卻劑；藥液溫度800C，滴速為每分鐘15滴，滴距5cm，冷卻柱長35cm，滴口內徑2.5cm,冷卻劑溫度(TC (冰水浴)，滴製法製成含有每丸含廣藿香醇0.016mg的滴丸10000顆，每丸淨重0.015g。口服用以治療內毒素血症。每次I 5丸，一日I 3次，3 7天為一療程，可連續使用I 2療程。實施例2 (注射劑)取丹皮酹16m g,加入氯化鈉9g,加水至1000ml,調整pH至7.0-7.4,過濾,濾液灌封在2、5或IOml的安瓿中，100°C滅菌30min，得到注射液。注射用以治療內毒素血症。本品可靜脈注射或肌肉注射，每次I 10ml，一日I 3次，3 7天為一療程，可連續使用I 2療程。實施例3 (軟膠囊)稱取丹皮酚16mg與食用玉米油60g混合，充分攪勻製得廣藿香醇軟膠囊內容物；稱取明膠、甘油和水各適量(質量比為明膠:甘油:水=1: 0.5: I)製備囊材膠液；採用旋轉模壓法，將內容物和囊材膠液裝入自動旋轉制囊機中，壓製出規格為每粒含廣藿香醇0.016mg的軟膠囊1000粒，每粒淨重0.06g,適量液狀石蠟作為潤滑劑。每次I 5粒，一日I 3次，3 7天為一療程，可連續使用I 2療程。實施例4 (丹皮酚抑制LPS刺激的HMGBl出核作用)一、實驗藥物:丹皮酚，購於中國食品藥品檢定研究院(N0.110708-200506, Beijing, China)。二、實驗方法和結果:URAW264.7的培養:RAW264.7用含10%胎牛血清和2mmol/L穀氨醯胺的RPMI1640培養基37°C、5%C02培養。用0.25%的胰蛋白酶液進行消化，顯微鏡下觀察，當細胞間隙變大、細胞回縮時，用完全培養基終止消化。吸管均勻、輕柔吹打細胞，鏡下觀察，細胞基本脫落，收集細胞液，離心lOOOrpm，8min,製成細胞懸液，以I X IO5個/ mL的密度接種於培養瓶、6 孔及 96 孔板中。LPS(0555:B5)和 SB 購自美國 Sigma(L2880, St.Louis, UnitedStates)，丹皮酚購自中國食品藥品檢定研究院(N0.110708-200506, Beijing, China)。2、MTT法考察丹皮酚對LPS刺激後細胞活性的影響:取對數生長期的細胞按I X IO3個細胞/孔接種於96孔板，培養I天(細胞貼壁後)，將細胞分為空白對照組、丹皮酚各劑量組，每組設五個復孔，在有或無LPS刺激條件下，後，其中參附組根據細胞IC50值選取低、中、高劑量(0μ g/ml-20l.! g/ml)在給藥後24h、48h，按培養液量的10%加入每孔加入20ul3- (4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(3- (4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-
`2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)溶液(5mg/ml,即 0.5%MTT),繼續培養 4h。吸去半量培養基，加入與培養液相同量的二甲基亞碸(DMS0)。然後置於搖床lOmin，使結晶充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上於492nm波長測定光吸收值，記錄數據，繪製細胞活性曲線。3、通過螢光免疫組化和共聚焦顯微鏡確定HMGBl在細胞核的定位:在預先放置蓋玻片的12孔板內培養細胞，LPS(0.2μ g/mL)，誘導細胞損傷後換無血清加藥培養基繼續培養18h，再終止培養。取出蓋玻片，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定。3%過氧化氫5-1Omin，雙蒸水洗3次，每次5min。滴加羊血清室溫封閉30min，不洗，分別加入單克隆兔抗小鼠HMGBl (I:500 稀釋，Catalog#2600-1, Epitomics, California, USA)工作液，4°C過夜，0.0lM PH7.2 的PBS洗漆液洗漆洗3次,每次lOmin。用Cy3標記的二抗(Invitrogen, California, USA)孵育lh，洗後用H0echst33258復染細胞核，雷射共聚焦顯微鏡觀察。4、通過Western blot和RT-PCR方法確定HMGBl在細胞核和細胞質中的表達量4.1消化收集丹皮酚處理組與對照組細胞，轉移至1.5ml離心管中，4°C，2500rpm離心5min，棄掉上清液，加入事先用冰預冷的PBS洗滌細胞2次，4°C，2500rpm離心5min，棄掉上清液，立即至於冰上；加入IOOul buffer A裂解細胞，輕柔吹，冰上放置15min ;4°C，800g離心lOmin,儘可能多保留沉澱，用buffer A洗漆沉澱2次；加入IO-1OOul bufferC與蛋白酶抑制劑的混合液到沉澱中，劇烈吹勻，冰上放置30-40min ；4°C, 12000rpm離心IOmin ;將上清轉移至另一乾淨的離心管中，取部分上清用Bradford測定法(BCA , Pierce,美國)進行蛋白定量，樣品-70°C保存；制膠，將樣品、蛋白Marker依次加入上樣孔內；在凝縮膠以恆壓80伏進行電泳30min，進入分離膠後將電壓提高到120伏，繼續電泳直至溴酚藍到達分離膠底部(約120min)，關閉電源。將PVDF膜浸泡到甲醇中活化後，在轉膜儀中從下到上依次按厚濾紙、凝膠、PVDF膜、厚濾紙的順序放好並對齊，在最上層厚濾紙上趕壓，除去氣泡；恆流31毫安轉膜l_2h。將轉完蛋白的PVDF膜加入封閉液5%脫脂牛奶放置於旋轉搖床上室溫封閉Ih或4°C封閉過夜；棄去封閉液後，加入3ml5%脫脂牛奶稀釋的一抗(1:3000)，放置於旋轉搖床上室溫孵育2h或4°C孵育過夜；棄去一抗後，加入TBS-T洗膜，5minX3次。然後加入3ml5%脫脂牛奶稀釋的HRP標記的相應二抗(1:2000)，放置於旋轉搖床上室溫孵育Ih ;棄去二抗後，加入TBS-T洗膜，5minX 3次。等體積混合ECL化學發光A液和B液，與PVDF膜共孵育lmin，用濾紙將多餘的發光液吸乾，將膜用保鮮膜包被好後放入壓片夾移入暗房，取X光片置於膜上曝光l_5min後，衝洗膠片，根據曝光條帶判斷蛋白的表達。Image J(NIH，美國)軟體分析結果。4.2消化收集分組培養的各組細胞製成細胞懸液置Eppendorf管，每IO5個細胞滴加Trizol (Invitrogen, USA) Iml劇烈振蕩,氯仿,異戍醇(I:24)、異丙醇抽提,DEPC水溶解，每樣品在紫外分光光度計(日本SHIMADZU UV minil240)上測定波長為260nm時的吸光度值為總RNA量。取2 μ g RNA模板做逆轉錄反應，採用德國Qiagen公司RT-PCR試劑盒，儀器為PE9600PCR儀，上、下遊引物為華美公司合成，37°C lh，然後95°C 3min。螢光定量PCR反應採用定量PCR buffer (ABI，USA)、dNTPs (Sigma，USA)、螢光探針(上海生工)、Taq酶(八81，^4)，反應條件為931:21^11，然後931:458，551: 1_，共25-33個循環。反應結束後，由電腦自動分析並計算結果。Mouse HMGBl:CGAAGGCTATCACAAGAAC and ATAAAGGGACAAACCACAG, 33cycles;MouseGAPDH:AACGACCCCTTCATTGAC and TCCACGACATACTCAGCAC, 25cycles.
5、結果 5.1丹皮酚抑制RAW264.7細胞活性圖1A表明丹皮酚抑制RAW264.7細胞的IC50濃度為0.6mM_0.8mM，因此選取
0.2mM、0.用於後續實驗。如圖1B，IC所示，在用SB和Paeonol對照處理RAW264.7細胞24h，48 h時，丹皮酚呈劑量依賴性地抑制RAW264.7細胞活性。如圖1D，IE所示，LPS刺激RAW264.7細胞24h和48小時均可刺激活性增加，丹皮酚呈劑量依賴性地抑制RAW264.7細胞活性。5.2共聚焦顯微鏡觀察表明丹皮酚可抑制LPS刺激的HMGBl出核作用用Cy3標記的HMGBl呈紅色，用Hoechst33258標記的細胞核呈藍色，用共聚焦顯微鏡觀察，如果紅色與藍色完全重疊，表明HMGBl位於細胞核內。正常情況下(如圖2A，2B，2C，2D), HMGBl位於細胞核內。在LPS(0.2ug/mL)刺激RAW264.7細胞24h時，呈紅色HMGBl不僅在細胞核內，在細胞質中也出現了大量的紅色的顆粒(如圖2E，2F，2G箭頭所示)，表明HMGBl從細胞核進入了細胞質，而且紅色的顆粒靠近細胞膜的邊緣，提示LPS刺激HMGBl由細胞核入細胞質然後分泌的全過程。在LPS刺激同時，加入丹皮酚24h後可見HMGBl主要表達在細胞核內(以ImM劑量為例，如圖21、2J、2K、2L)，表明丹皮酚能抑制HMGBl由核入胞以及分泌出胞；而且每個細胞核中的紅色顯著高於LPS組，提示丹皮酚提高核內的HMGBl含量；如圖21，細胞為多角形，細胞質中有較多小囊泡，其中方框所示細胞呈核分裂相，提示細胞呈激活狀態。在LPS刺激同時，加入正丁酸鈉(SB，以IOmM劑量為例，如圖2M、2N、20、2P)，24h後也可見HMGBl主要表達在細胞核內，表明SB能抑制HMGBl由核入胞以及分泌出胞；核中的紅色顯著弱於丹皮酚組，細胞呈長梭形，較扁平，活性較弱。5.3RT-PCR和Western blot方法表明丹皮酚可抑制LPS刺激的HMGBl出核作用結果表明丹皮酚抑制HMGBlmRNA表達，HMGBl在細胞質中分布減少，在細胞核中分布增加，有劑量依賴性(如圖3)。圖3A所示為細胞質中HMGBl表達結果，以Tubulin為內參，重複3次，統計結果如圖3B，LPS組細胞質中HMGBl表達顯著高於正常對照組(P〈0.01)，丹皮酚呈劑量依賴性減少細胞質中HMGBl表達，與免疫組化結果一致；圖3C所示為細胞核中HMGBl表達結果，以Lamin B為內參，重複3次，統計結果如圖3D，LPS組細胞質中HMGBl表達顯著低於正常對照組(P〈0.01 )，與LPS組相比丹皮酚增高核內的HMGBl表達，與免疫組化結果一致；圖3E所示為HMGBlmRNA表達結果，以GAPDH為內參，重複3次，統計結果如圖3F，LPS組HMGBlmRNA表達顯著高於正常對照組(P〈0.01 )，與LPS組相比丹皮酚呈劑量依賴性降低HMGBl表達。綜合以上結果，丹皮酚抑制HMGBl轉錄與表達，主要減少HMGBl由核入胞，因此在細胞質中表達減少，細胞核中表達增加，與免疫組化結果一致。SB對HMGBlmRNA的抑制作用比丹皮酚更為顯著，核內含量更少，與免疫組化結果一致。上述 結果顯示，丹皮酚能有效抑制HMGBl出核，可以用於治療內毒素血症。
權利要求
1.丹皮酚在製備抗內毒素血症的藥物中的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的藥物由丹皮酚和醫學上可接受的輔料組成，其中丹皮酚的含量為O. OOl 10%。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述藥物是注射劑或常見的口服製劑。
全文摘要
本發明涉及丹皮酚在製備抗內毒素血症的藥物中的應用。本發明所述的藥物由丹皮酚和醫學上可接受的輔料組成，其中丹皮酚的含量為0.001～10%。本發明所述的丹皮酚是一種新型高遷移率族蛋白B1(high mobility group B1,HMGB1)抑制劑，可以在LPS刺激條件下抑制HMGB1出核，HMGB1的主要表達部位在細胞核內，可以用於治療因HMGB1分泌而產生的毒性作用。
文檔編號A61P39/02GK103251575SQ20131017850
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月14日 優先權日2013年5月14日
發明者黎暉, 吳晶晶, 杜少輝, 陳東風, 李伊為, 周健洪 申請人:廣州中醫藥大學