一種利用高溫花生粕製備高水解度功能性短肽的方法
2023-06-22 14:26:06
一種利用高溫花生粕製備高水解度功能性短肽的方法
【專利摘要】一種利用高溫花生粕製備高水解度功能性短肽的方法，涉及短肽。1）將高溫花生粕粉碎，加入水，得花生粕粉料液，浸提後料液離心，取上清液，靜置酸沉，再離心，收集沉澱，沉澱用水洗至中性，乾燥後得花生蛋白粉；2）將步驟1）得到的花生蛋白粉進行亞硫酸鈉前處理，得花生蛋白液；3）在步驟2）得到的前處理後的花生蛋白液中加入鹼性蛋白酶，進行第一次酶解，再加入菠蘿蛋白酶，進行第二次酶解，料液升溫滅酶，停止酶解，得花生蛋白酶解液；4）將步驟3）所得花生蛋白酶解液離心，收取上清液，超濾，收集超濾透過液，再納濾脫鹽處理，收集納濾截留液；5）將納濾截留液冷凍乾燥，即得高水解度功能性短肽。操作方便、條件溫和、處理速度快。
【專利說明】—種利用高溫花生粕製備高水解度功能性短肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及短肽，尤其是涉及一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法。
【背景技術】
[0002]功能性短肽在人體內活性的高低與短肽的吸收率、生物利用度密切相關。二肽和三肽能在體內以完整形式迅速被吸收，因此在體內功能活性高。要製備以二肽、三肽為主要組分的短肽產品，要求蛋白質原料有很高的水解度，即應接近或超過30%。
[0003]功能性短肽是一類由二個到十幾個胺基酸組成的短肽的統稱。短肽幾乎都具有特定的生物活性，它們在人體內的吸收機制與單個胺基酸的吸收機制不同。已有生物學、營養學及臨床醫學等領域的研究證實，人體內小腸上皮細胞中存在二肽、三肽轉運載體，二肽和三肽可以完整的形式被迅速吸收並在體內發揮生理功效。三肽以上的多肽，則主要是以旁路擴散或胞飲途徑被完整吸收，但這類作用會隨分子質量的增加而迅速降低。由於吸收速度慢、經歷過程長，這些三肽以上的短肽分子在消化道中大多被逐步降解，其特定生物活性大大降低，因此功能性短肽要順利發揮作用，首先要能被人體大量地迅速、完整吸收。二肽、三肽的人體吸收利用度大，可以在人體內很好地發揮其原有的功能活性。而要得到大量二肽、三肽組分，其短肽生產工藝應首先能確保蛋白水解得到高水解度(二肽、三肽對應的蛋白水解度應高達30-50%)，即水 解度應接近或超過30%，同時胺基酸的產生應儘可能少即肽的得率高。然而多數蛋白質在常規蛋白酶的水解作用下其水解度一般都不太高，為百分之幾至百分之十左右。因此，提高蛋白質的水解度可以作為衡量功能性短肽製備工藝的重要指標，得到高水解度是生產功能性短肽的工藝應達到的主要目的。
[0004]酶解蛋白製備功能性短肽，關鍵是要選擇合適的蛋白酶，同時在酶解過程中使蛋白酶與蛋白質底物充分接觸，使蛋白酶能專一、高效地發揮作用。
[0005]功能性短肽的製備方法多樣，其中，酶法水解蛋白製備功能性短肽相較於酸鹼水解法，具有過程溫和、安全、簡便可控、高效的優點，同時酶解法也比基因工程法、化學合成法簡便、原料易得，因此在保健食品原料的生產研究領域得到了廣泛應用。然而酶是一種專一性強的生物催化劑，不同種類、不同來源的蛋白酶其專一性水解部位即酶切位點不同，如來源於胰臟的胰蛋白酶(Trypsin)其主要酶切位點為賴氨酸殘基、精氨酸殘基部位，而胃蛋白酶(Pepsin)其主要酶切位點則為亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基部位。由於不同原料來源的蛋白質其胺基酸組成及比例大有差異，因此選擇合適的酶及其水解工藝對得到高水度十分關鍵。花生蛋白中疏水性胺基酸的含量達到了 35%，其中芳香族胺基酸含量為12%左右。
[0006]蛋白酶要順利酶解還有一個關鍵因素是酶與底物應充分結合，這樣酶才能夠發揮作用。高溫花生柏由於在生產過程中受到高熱作用，蛋白質變性嚴重，蛋白質肽鏈間或蛋白質與其他組分間易形成非常緊密的結合而成為難溶聚合物，這對於蛋白肽鏈的解離、蛋白酶的進入及結合十分不利，而低度變性或中度變性的低溫花生柏在這方面則顯著優於高溫花生柏。採用特定的理化輔助處理技術來處理從高溫柏中提取的花生蛋白，使花生蛋白的肽鏈解離開，是使蛋白酶充分酶解的關鍵技術之一。
[0007]利用超濾膜的選擇性分離作用，可將花生蛋白酶解生成的目的短肽與蛋白及大分子肽分離。另外，鹽的存在會影響功能性短肽活性的發揮，採用納濾技術可快速有效地進行功能性短肽脫鹽、濃縮處理，該技術也適用於工業化生產。
[0008]蛋白酶解製備短肽的結果是生成含有大量短肽及少量大分子肽或蛋白的混合物，需要將短肽與其他組分分離。選擇適宜截留分子量的超濾膜，可以利用膜的選擇性分離作用將目的短肽與其他大分子組分分開，此外，應用超濾膜技術處理量大、可以適用於連續化生產。
[0009]在蛋白質酶解製備功能性短肽的過程中，由於要維持酶的活性，反應過程中會不斷加入一定量的酸、鹼、鹽類物質以維持體系的PH值及離子強度。這樣在功能性短肽的製備終點，必然會存在一定量的鹽類物質，這些組分極可能影響功能性短肽作為保健品原料或藥品原料應用的活性及適用範圍。因此，需要對功能性短肽進行脫鹽處理。傳統的脫鹽方式多為陰離子、陽離子交換結合脫鹽，或是大孔樹脂吸附、解析脫鹽，這些往往過程繁瑣，且樣品處理量不多、肽回收率低，不利於工業化大生產。納濾技術是採用孔徑為納米級的膜的膜分離技術，對相對分子質量大於200的有機物及大離子團具有高的截留效果，因此納濾技術可以用於脫鹽、同時濃縮樣品，此外納濾設備處理速度快，可以適用於工業化連續生產的情況。
[0010]目前相關的酶解花生蛋白製備功能性短肽的研究多停留在以開發具有某種功能活性的短肽為目的的酶解、純化製備工藝研究上，而非以得到高水解度短肽為目的。如張偉等考察了幾種酶在水解花生蛋白製備ACE抑制肽中的效果，結果表明鹼性蛋白酶酶解產物ACE抑制率最大。黎觀紅採用鹼性蛋白酶Alcalase水解花生，水解產物ACE抑制活性提高，再經過離子交換樹脂脫鹽、超濾^kDa膜)富集濃縮、凝膠層析分離，得到活性更高的ACE抑制肽。張宇昊等探討了花生降血壓肽的超濾分離工藝條件，並用體外化學模型對花生肽的ACE抑制活性進行了評價，對花生短肽的ACE抑制活性量效關係、ACE抑制機理以及花生短肽的體內降血壓活性等進行了研究。江利華等將花生蛋白酶解產物通過大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠色譜分離純化製得花生ACE抑制肽，並用RP-HPLC進一步分離純化花生ACE抑制肽。王瑛瑤等採用水酶法製得的花生肽，採用體積排阻色譜、大孔吸附樹脂色譜和半製備RP-HPLC進行分離，並對結構進行了鑑定，花生肽的相對分子質量在189-2000範圍之內，具有抑制ACE活性。申請號為CN201010510989.2的中國專利申請公開了一種花生降血壓肽及其製備方法，以冷榨花生餅為原料，鹼提、酸沉提蛋白，鹼性蛋白酶酶解，超濾分離得降血壓肽，離子交換脫鹽，後經濃縮乾燥得產品。以上的研究集中在以製備具有某種功能活性(如ACE抑制活性)短肽的酶解工藝優化、短肽的活性機理(構效關係、量效關係等)的探討上，且研究主要還處於實驗室規模，離工業化生產還有一定距離。
[0011]申請號為CN200610112479.3的中國專利申請公開了一種以花生蛋白粉為原料製備花生功能性混合短肽的方法，申請號為CN201010110302.6的中國專利申請公開了一種利用低溫花生柏製備花生蛋白和花生肽的方法，申請號為CN201010540547.2、CN200910017429.0的中國專利申請分別公開了一種以花生柏為原料製備製備花生蛋白活性肽的方法。這些研究以製備花生蛋白混合肽為目的，未特別關注蛋白水解度，水解度不高；並不強調產品的某種特定的生物活性，因此在肽水解度的分級分離、純化、精製等工藝環節的要求也略不同於製備高純度降血壓活性肽的製備，這些產品主要用於作為保健食品或食品、飼料原料等。
【發明內容】
[0012]本發明的目的是提供一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法。
[0013]本發明包括以下步驟:
[0014]I)將高溫花生柏粉碎，加入水，得花生柏粉料液，浸提後，料液離心，取上清液，靜置酸沉，再離心，收集沉澱，沉澱用水洗至中性，乾燥後得花生蛋白粉；
[0015]2)將步驟I)得到的花生蛋白粉進行亞硫酸鈉前處理，得花生蛋白液；
[0016]3)在步驟2)得到的前處理後的花生蛋白液中，加入鹼性蛋白酶，進行第一次酶解，再加入菠蘿蛋白酶，進行第二次酶解，料液升溫滅酶，停止酶解，得花生蛋白酶解液；
[0017]4)將步驟3)所得花生蛋白酶解液離心，收取上清液，超濾，收集超濾透過液，再納濾脫鹽處理，收集納濾截留液；
[0018]5)將納濾截留液進行冷凍乾燥，即得高水解度功能性短肽。[0019]在步驟I)中，所述高溫花生柏最好粉碎至80目，所述高溫花生柏與水的配比可為1:8~12 (m/v);所述水可採用去離子水；所述花生柏粉料液最好調節pH為9.0~11.0，所述浸提的溫度可為40~60°C，浸提的時間可為2h ;所述料液離心的條件可為3000rpm、15min ;所述上清液最好調節pH值至4.5 ;所述靜置酸沉的時間可為30min ;所述再離心的條件可為4000rpm、IOmin ;所述乾燥可採用冷凍乾燥。
[0020]在步驟2)中，所述將步驟I)得到的花生蛋白粉進行亞硫酸鈉前處理可為:將花生蛋白粉溶解在去離子水中配製成濃度為3%~5% (m/v)的花生蛋白液,加熱至50°C後，向花生蛋白液中加入Na2SO3至終濃度為0.04%~0.10% (m/v),並持續恆溫攪拌Ih ；
[0021]在步驟3)中，所述前處理後的花生蛋白液最好調節至pH8.0~8.5、溫度為50~550C ;所述加入鹼性蛋白酶(Alcalase2.4，比活力138328U/g)的量可按每克花生蛋白加入5000~10000U/g酶，所述第一次酶解的時間可為180~240min ;所述加入菠蘿蛋白酶的溫度為40~45°C、pH6.0~7.0，加入菠蘿蛋白酶(比活力49395U/g的量按每克花生蛋白加入5000~10000U/g的酶，所述第二次酶解時間可為180~240min ;最好在各段酶解過程中溫度保持恆定，同時不斷攪拌溶液，並通過加入lmol/L的NaOH來維持pH恆定；所述升溫滅酶的條件可為在90°C下水浴滅酶20min。
[0022]在步驟4)中，所述離心的條件可在12000g條件下離心15min ;所述超濾的條件可為:採用截留分子量為IkDa的超濾膜，調節花生蛋白酶解液pH為6.8，在超濾壓力為
0.086~0.193MPa、超濾溫度為25~45°C的條件下超濾；所述超濾可採用恆體積超濾方式，所述恆體積超濾方式可為:先在超濾設備料槽中加入超濾原液，然後利用一臺輔助泵在超濾過程中向料槽內不斷泵入去離子水，使水加入的流速與從超濾膜中透過的透過液流速相等，超濾過程中加入的去離子水總體積最好為料液初體積的2~6倍；所述納濾的操作方法可採用間歇式恆容積納濾，納濾的溫度最好為常溫(25°C)，納濾的壓力最好為1.5MPa ；所述間歇式恆容積納濾的具體操作方式可為:納濾原液體積為\，經納濾膜脫鹽、濃縮至Vr, Vr=l/3V0,再加水稀釋至Vtl,即每次透過液的體積與加水體積相同，隨著加水次數的增多,粗鹽脫除率逐漸增加,加水次數最好為10~20次。[0023]本發明在眾多的單酶篩選及復配酶組合酶解花生蛋白的實驗結果基礎上，最後確定了以鹼性蛋白酶結合菠蘿蛋白酶的復配酶組合酶解方式來酶解花生蛋白。採用巰基還原劑亞硫酸鈉處理花生蛋白，可破壞花生蛋白肽鏈上的二硫鍵，以提高蛋白酶進入蛋白肽鏈間並與之結合的機會，從而可大大提高花生蛋白的水解度。
[0024]本發明以高溫花生柏為原料，提取花生蛋白，結合特定化學技術進行前處理，再應用複合酶酶解花生蛋白，高效製備高水解度的功能性短肽，最後應用膜技術進行功能性短肽的分離純化。本發明從高溫花生柏中以鹼提酸沉法提取蛋白，然後採用亞硫酸鈉處理技術對花生蛋白進行前處理，之後採用鹼性蛋白酶、菠蘿蛋白酶雙酶複合法水解花生蛋白；隨後，應用超濾技術將蛋白酶解產物分離出來，並採用納濾技術進行脫鹽處理，得到純化的功能性短肽濃縮液，最終經冷凍乾燥處理，得功能性短肽產品。
[0025]本發明的優點在於:
[0026]I)本發明採用特定前處理技術結合複合蛋白酶酶解技術，對從高溫花生柏中提取的花生蛋白進行酶解，可得到高水解度的花生蛋白短肽產品，其水解度高達30%左右。酶解產物即功能性短肽的分子量集中在284~401Da左右，主要為二肽、三肽。產品功能性短肽具有明顯的血管緊張素轉化酶E(AC)抑制活性、抗氧化活性。整個蛋白酶解處理工藝簡便、溫和、高效，蛋白水解度高。
[0027]2)酶解產物採用超濾技術分離、納濾技術脫鹽，超濾作用可以將短肽產品方便地從酶解體系中分離出來，而納濾技術可使短肽產品脫去除少量一價離子之外的絕大多數鹽類，且脫鹽的同時對產品有濃縮作用；此外，超濾、納濾作為膜技術具有操作方便、條件溫和、處理速度快、可連續化的特點，適用於工業化生產。
[0028]3)本發明以在我國產量極大的高溫花生柏為原料製備高水解度的功能性短肽產品，為由於過度變性而難以深開發的花生柏蛋白的應用開拓了新的途徑，具有很好的經濟效益和社會效益。
【具體實施方式】
[0029]以下實施例將對本發明作進一步的說明。
[0030]實施例1
[0031]鹼溶酸沉法從高溫花生柏中製備花生蛋白粉:取高溫花生柏粉碎至80目得高溫花生柏粉，按一定料液比1:8加入去離子水混勻，得花生柏粉料液，在60°C下浸提2h，浸提過程中維持恆定PH9.5，然後冷卻至室溫，料液以3000rpm、15min離心，取上清液，調節上清液pH值至4.5,靜置酸沉30min後以4000rpm、IOmin離心,收集花生蛋白沉澱,用去離子水水洗至中性，冷凍乾燥，得到花生柏蛋白粉。花生蛋白提取率達64.28%，花生蛋白粉中蛋白質純度達到83.14%。
[0032]亞硫酸鈉前處理:稱取花生蛋白粉配製成5% (m/v)的花生蛋白液,加入Na2SO3至終濃度為0.07% (m/v)，持續攪拌並在50°C保持lh。
[0033]復配酶法酶解花生蛋白製備功能性短肽:調整料液體系pH8.0、溫度50°C，按酶底比7000.00U/g加入鹼性蛋白酶，水解180min。隨後將料液體系調至溫度為45°C、pH6.8，按酶底比為8000.00U/g加入菠蘿蛋白酶，水解180min。各段酶解過程中溫度保持恆定，同時不斷攪拌溶液，並通過加入lmol/L的NaOH來維持pH恆定。水解結束後水解液在90°C下水浴滅酶20min，停止酶解。酶解結果測得蛋白水解度為31.77%。[0034]花生蛋白酶解液的超濾分離、納濾脫鹽:取花生蛋白酶解液，在12000g下離心15min，取上清液作為超濾原液。取超濾原液進行超濾處理。用截留分子量為IkDa的超濾膜，在超濾壓力0.193MPa、料液pH6.8，超濾溫度為45°C的條件下超濾。採用恆體積超濾方式，即先在超濾設備料槽中加入一定體積超濾原液，然後利用一臺輔助泵在超濾過程中向料槽內不斷泵入去離子水，使水加入的流速與從超濾膜中透過的透過液流速相等，超濾過程中加入的去離子水總體積為料液初體積的3倍時最佳，此時短肽透過率高、超濾速度穩定在較快的速度。此時短肽透過率為65.2%，透過液的分子量均在IkDa以內，且主要分布在284~401Da之間。
[0035]取收集的超濾透過液進行納濾脫鹽處理。在常溫(25°C )、納濾壓力為1.5MPa的條件下進行間歇式恆容積納濾脫鹽。具體操作方式為:納濾原液體積為Vtl，經納濾膜脫鹽、濃縮至Vr，Vr=IAVtl，再加水稀釋至Vtl，即每次透過液的體積與加水體積相同。總加水次數為15次。最後粗鹽脫除率達到86.1%，短肽損失率為3.3%。
[0036]將得到的納濾截留液進行冷凍乾燥，即得到功能性短肽凍乾粉，凍乾粉對ACE的IC50 為 0.78mg/mL,體外抗氧化活性為 ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)值2359.50 ±40.43 μ moL Trolox/g。對原發性高血壓大鼠(SHR大鼠)的動物試驗表明，灌胃劑量在1000~1500mg/kg體重時，給藥4h後，大鼠收縮壓能顯著降低，且灌胃劑量為1500mg/kg體重時，降壓效果可持續到8h，降幅在16~25mmHg，說明製得的花生降血壓短肽有明顯降壓效果。
[0037]實施例2
[0038]鹼溶酸沉法從高溫花生柏中製備花生柏蛋白粉:取高溫花生柏粉碎至80目得高溫花生柏粉，按料液比l:10(m/v)加入去離子水混勻，得花生柏粉料液，在一定溫度50°C下浸提2h，浸提過程中pH維持恆定9.5，然後冷卻至室溫，料液以3000rpm、15min離心，取上清液，調節上清液pH值至4.5,靜置酸沉30min後以4000rpm、IOmin離心,收集花生蛋白沉澱，用去離子水水洗至中性，冷凍乾燥，得到花生柏蛋白粉。花生蛋白提取率可達62.5%。對所得花生蛋白進行了蛋白質含量測定，其蛋白質純度達到85.20%。
[0039]亞硫酸鈉前處理:稱取花生蛋白粉配製成5% (m/v)的花生蛋白液,加入Na2SO3至終濃度為0.1% (m/v)，持續攪拌並在50°C保持lh。
[0040]複合酶法酶解花生蛋白製備功能性短肽:調整料液體系pH8.0、溫度50°C，按酶底比7500.00U/g加入鹼性蛋白酶，水解240min。隨後將料液體系調至溫度為45°C、pH6.8，按酶底比為8000.00U/g加入菠蘿蛋白酶，水解240min。各段酶解過程中溫度保持恆定，同時不斷攪拌溶液，並通過加入lmol/L的NaOH來維持pH恆定。水解結束後水解液在90°C下水浴滅酶20min，停止酶解。酶解結果測得蛋白水解度為35.52%。
[0041]花生蛋白酶解液的超濾分離、納濾脫鹽:取花生蛋白酶解液，在12000g下離心15min，取上清液作為超濾原液。取超濾原液進行超濾處理。用截留分子量為IkDa的超濾膜，在超濾壓力0.157MPa、料液pH6.8，超濾溫度為40°C的條件下超濾。採用恆體積超濾方式，即先在超濾設備料槽中加入一定體積超濾原液，然後利用一臺輔助泵在超濾過程中向料槽內不斷泵入去離子水，使水加入的流速與從超濾膜中透過的透過液流速相等，超濾過程中加入的去離子水總體積為料液初體積的4倍，此時短肽透過率為65.5%，透過液的分子量均在IkDa以內，且主要分布在284~401Da之間。
[0042]取收集的超濾透過液進行納濾脫鹽處理。在常溫(25°C )、納濾壓力為1.5Mpa的條件下進行間歇式恆容積納濾脫鹽。具體操作方式為:納濾原液體積為Vtl，經納濾膜脫鹽、濃縮至Vr，Vr=IAVtl，再加水稀釋至Vtl，即每次透過液的體積與加水體積相同。總加水次數為12次。最後粗鹽脫除率達到85.3%，短肽損失率為3.0%。
[0043]將得到的納濾截留液進行冷凍乾燥，得到功能性短肽凍乾粉，凍乾粉對ACE的IC5tl為0.72mg/mL,體外抗氧化活性為ORAC值2623.68± 15.66 μ moL Trolox/g。對原發性高血壓大鼠(SHR大鼠)的動物試驗表明，所制的功能性短肽具有與實施例1同樣的降血壓功效。
[0044]功能性短肽中的二肽、三肽在人體內吸收速度快、生物利用度高，能在體內較好地發揮特定的功能活性，而大分子肽的體內活性則大大低於其體外活性。因此要開發在體內活性高的肽產品，應以二肽、三肽為主要組分，要求蛋白質水解程度要高，即達到接近或高於30%的水解度值。本發明提供了一種可工業化應用的以高溫花生柏為原料，高效酶解花生蛋白、製備高水解度功能性短肽的工藝方法。[0045]本發明從高溫花生柏中以鹼提酸沉法提取蛋白，然後採用亞硫酸鈉處理技術對花生蛋白進行前處理，之後採用鹼性蛋白酶、菠蘿蛋白酶先後水解花生蛋白製備高水解度(30%以上)蛋白水解液。隨後應用超濾技術從酶解液中分離出小分子肽(以二肽和三肽為主)，並採用納濾技術對小分子肽進行脫鹽處理，得到純化的功能性短肽濃縮液，最終經冷凍乾燥處理，得功能性短肽產品。本發明工藝具有操作方便、條件溫和、處理速度快、可連續化的特點，適用於工業化生產。功能性短肽產品得率在25%以上(以原料蛋白為基準)，分子量在284-401Da之間的短肽佔90%左右，脫鹽率85%以上，產品純度80%以上，胺基酸含量5%以下。產品功能性短肽具有明顯的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性、抗氧化活性。酶解產物採用超濾技術分離、納濾技術脫鹽，此外，本發明以在我國產量極大的高溫花生柏為原料製備高水解度的功能性短肽，為由於過度變性而難以深開發的花生柏蛋白的應用開拓了新的途徑，具有很好的經濟效益和社會效益。
【權利要求】
1.一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)將高溫花生柏粉碎，加入水，得花生柏粉料液，浸提後，料液離心，取上清液，靜置酸沉，再離心，收集沉澱，沉澱用水洗至中性，乾燥後得花生蛋白粉； 2)將步驟I)得到的花生蛋白粉進行亞硫酸鈉前處理，得花生蛋白液； 3)在步驟2)得到的前處理後的花生蛋白液中，加入鹼性蛋白酶，進行第一次酶解，再加入菠蘿蛋白酶，進行第二次酶解，料液升溫滅酶，停止酶解，得花生蛋白酶解液； 4)將步驟3)所得花生蛋白酶解液離心，收取上清液，超濾，收集超濾透過液，再納濾脫鹽處理，收集納濾截留液； 5)將納濾截留液進行冷凍乾燥，即得高水解度功能性短肽。
2.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟I)中，所述高溫花生柏粉碎至80目，所述高溫花生柏與水的配比為1:8~12 (m/V);所述水可採用去離子水；所述花生柏粉料液最好調節pH為9.0~11.0，所述浸提的溫度可為40~60°C,浸提的時間可為2h。
3.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟I)中，所述料液離心的條件為3000rpm、15min ;所述上清液最好調節pH值至4.5 ；所述靜置酸沉的時間可為30min ;所述再離心的條件可為4000rpm、IOmin ;所述乾燥可採用冷凍乾燥。
4.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟2)中，所述將步驟I)得到的花生蛋白粉進行亞硫酸鈉前處理為:將花生蛋白粉溶解在去離子水中配製成濃度為3%~5% (m/v)的花生蛋白液,加熱至50°C後，向花生蛋白液中加入Na2SO3至終濃度為0.04%~0.10% (m/v),並持續恆溫攪拌lh。
5.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟3)中，所述前處理後的花生蛋白液調節至pH8.0~8.5、溫度為50~55°C ;所述加入鹼性蛋白酶(Alcalase2.4，比活力138328U/g)的量可按每克花生蛋白加入5000~10000U/g酶；所述第一次酶解的時間可為180~240min。
6.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟3)中，所述加入菠蘿蛋白酶的溫度為40~45°C、pH6.0~7.0，加入菠蘿蛋白酶(比活力49395U/g的量按每克花生蛋白加入5000~10000U/g的酶，所述第二次酶解時間可為 180 ~240min。
7.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟3)中，在各段酶解過程中溫度保持恆定，同時不斷攪拌溶液，並通過加入lmol/L的NaOH來維持pH恆定；所述升溫滅酶的條件可為在90 °C下水浴滅酶20min。
8.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟4)中，所述離心的條件是在12000g條件下離心15min ;所述超濾的條件為:採用截留分子量為IkDa的超濾膜，調節花生蛋白酶解液pH為6.8，在超濾壓力為0.086~0.193MPa、超濾溫度為25~45°C的條件下。
9.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟4)中，所述超濾採用恆體積超濾方式，所述恆體積超濾方式為:先在超濾設備料槽中加入超濾原液，然後利用一臺輔助泵在超濾過程中向料槽內不斷泵入去離子水，使水加入的流速與從超濾膜中透過的透過液流速相等，超濾過程中加入的去離子水總體積最好為料液初體積的2~6倍。
10.如權利要求1所述一種利用高溫花生柏製備高水解度功能性短肽的方法，其特徵在於在步驟4)中，所述納濾的操作方法採用間歇式恆容積納濾，納濾的溫度為25°C，納濾的壓力為1.5MPa ;所述間歇式恆容積納濾的具體操作方式可為:納濾原液體積為Vtl，經納濾膜脫鹽、濃縮至Vr，Vr=l/3V0,再加水稀釋至Vtl, 即每次透過液的體積與加水體積相同，隨著加水次數的增多，粗鹽脫除率逐漸增加，加水次數最好為10~20次。
【文檔編號】C07K1/34GK103740797SQ201410022568
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】劉冬, 孫海燕, 周麗珍, 萬紅霞, 李豔, 唐旭蔚, 從彥麗 申請人:深圳職業技術學院