一種肝癌肝移植術後復發預測試劑盒的製作方法
2023-09-22 17:55:05
專利名稱：一種肝癌肝移植術後復發預測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種肝癌肝移植術後復發預測試劑盒，屬於生物技術領域。
背景技術：
原發性肝細胞肝癌(以下簡稱肝癌)是全球最常見的惡性腫瘤之一，由於我國乙 型肝炎病毒Ofepatitis B Virus, HBV)感染率較高，因此肝癌的發病率居高不下。肝移植 能徹底切除腫瘤並修復肝功能，已成為肝癌的根治性治療手段之一。但移植術後腫瘤的復 發轉移仍是影響肝移植療效的最主要因素。對移植術後腫瘤復發轉移的準確預測將有助於 積極的個體化防治措施的開展。同時由於供肝的短缺，預後的準確預測對於合理分配有限 的供肝具有重要現實意義。影響肝癌肝移植預後因素的研究，目前主要集中於腫瘤大小、數目、腫瘤分化、血 管侵犯、甲胎蛋白(AFP)水平等方面，但上述臨床病理指標仍難以準確預測肝癌肝移植術 後的復發轉移。最近，少量相關的研究發現了可用於肝癌肝移植術後復發預測的分子標記。 但這些研究多採用腫瘤組織作為研究材料，而組織學腫瘤標誌物存在標本採集、無法連續 檢測和隨訪追蹤等諸多限制，不利於實際臨床應用。本發明前期研究發現在肝癌病人的血 漿循環DNA可檢測到與復發密切相關的雜合性缺失(loss of heterOZygOSity，L0H)。基於 晶片的高通量SNP(單核苷酸多態性)分析使全基因組範圍的遺傳分析成為可能。本發明 在我院前期研究的基礎上，利用高通量SNP晶片、時間飛行質譜的方法，尋找血漿循環DNA 分子遺傳學變異(主要是SNP)在肝癌肝移植患者術後轉移復發預測中的價值，並製成檢測 試劑盒，為現有肝癌肝移植適應證的進一步完善提供簡便、有效的檢測指標。
發明內容
本發明的目的是構建一種能夠方便運用於臨床、快速有效地在術前預測肝癌肝移 植患者術後復發潛能的試劑盒。為了達到上述目的，本發明提供了一種肝癌肝移植術後復發預測試劑盒，其特徵 在於，用PCR擴增和螢光探針檢測rs894151和rsl2438080兩個SNP位點的基因型，用這兩 個位點的基因型結合腫瘤大小、數目來預測肝癌肝移植術後復發的風險，包括PCR擴增引 物以及用於基因分型的螢光檢測探針；其中，PGR擴增引物為rs894151 位點上遊序列5，AGAAACACTGAGTCTGCAGG3，；下遊序列5，GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3』 ；rs 12438080 位點上遊序列5，GATGACTCATAGCTTCCCTG3，；下遊序列5，CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3，；用於基因分型的螢光檢測探針為
rs894151-TA :AACTGTGAATAATAAATGCCACGCA ；rs894151-TG TTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG ；rs894151-TR -P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；rsl2438080-TA TTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA ；rsl2438080-TC :TTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC ；rsl2438080-TR -P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。本發明的原理如下如圖1所示，為獲得rs894151和rsl2438080兩個SNP位點的 分析流程圖。通過SNP晶片在30例FFPE腫瘤組織中篩查復發相關位點，然後用飛行質譜 法在這些晶片病例的循環DNA中對篩選出的復發相關位點進行SNP分型，找出同時在血漿 循環DNA中出現的復發位點。在另兩組獨立的病例血漿循環DNA中進行驗證。首先本發明使用Affimetrix公司的最新的SNP6. 0晶片篩查肝癌肝移植患者腫 瘤組織(復發組及未復發組各15例)間的遺傳學差異，發現了 1272個差異SNP位點(P < 0. 001)。其中30個差異最顯著的SNP位點P值小於0. 001。聚類分析發現30個差異最 顯著的SNP位點能清楚地將患者分為兩群，兩群的無復發生存率及總體生存率均有顯著差 異。如圖2和圖3所示，用30個P值最小的差異位點可清楚地將所有的患者分為兩群(高 危復發組及低危復發組)。生存分析發現兩群的總體生存時間(圖2)及無復發生存時間 (圖3)存在顯著差異(P<0. 001)。在以上病人的術前循環DNA中用飛行質譜法檢測這30 個SNP位點，共成功檢測到28個位點，發現腫瘤組織DNA和循環DNA中的符合率大於98 %。 本發明在另外102例獨立病例(測試集)的循環DNA中進一步驗證這28個SNP位點與復 發的關係，發現rs894151和rsl2438080兩個位點與復發顯著相關。其中rs894151位點的 G等位基因和rsl2438080的C等位基因與復發呈正相關。本發明將等位基因G和C定義 為危險等位基因。兩個SNP位點共四個基因座。rs894151位點可能的基因型為AA、AG和 GG, rsl2438080位點可能的基因型為AA、AC和CC。本發明將兩個位點均為AA基因型的患 者定義為復發低危組；其餘患者(即兩個位點任一基因座出現危險等位基因的患者)分為 復發高危組。生存分析發現這兩個位點的聯合指標是肝癌肝移植術後復發的獨立預後指標 (P = 0. 030)，如表1所示表1 多因素分析臨床病理因素與OS和RFS的關係(102例測試集病例) 該結果得到第三組獨立病例(47例驗證集)的驗證。如表2所示表2 多因素分析臨床病理因素與RFS的關係(驗證組47例病例) 符合米蘭標準的患者均為早期肝癌，而我國大多數患者就診時已進入晚期從而失 去移植機會。本發明在超過米蘭標準的患者中檢測血漿循環DNA SNP聯合指標，發現超出 米蘭標準的患者若rs894151和rsl2438080位點基因型均為AA其術後復發轉移的概率僅 為30% (6/20)。圖4為米蘭標準分層後SNP聯合指標的預測結果圖，兩個SNP位點的聯合 指標在超出米蘭標準病例中的預測價值。本發明進一步用循環DNA中兩個SNP(rs894151和rsl2438080)的聯合指標以及 米蘭標準中採用的腫瘤大小、個數共三個因子建立肝癌肝移植的預後模型。微血管侵犯雖 然也是復發的獨立預後因素，但該指標在術前無法獲得，因此不納入預後模型中。將SNP聯 合指標、腫瘤大小和腫瘤個數分別置入COX風險比例模型中，計算每個因子與復發關聯，每 個因子產生一個係數。患者的復發風險為三個指標分別與其係數相乘後的累加。即患者 復發風險=2. 008XSNP聯合指標+1.381 X腫瘤大小+0.859X腫瘤數目。當患者兩個位 點基因型均為AA時「SNP聯合指標」 =0 ；否則「SNP聯合指標」 =1 ；當患者腫瘤直徑彡5cm 時「腫瘤大小」 =0 ；大於5cm時「腫瘤大小」 =1 ；，當患者腫瘤僅一枚時「腫瘤數目」 =0 ； 多枚時「腫瘤數目」 =1。用模型計算每個患者的復發風險並用不含SNP指標的模型作為 參照，ROC曲線分析兩種模型復發風險的預後價值發現，用含有SNP指標的模型AUC面積為 0. 810，而用傳統的腫瘤大小、數目的模型AUC面積僅為0. 705，如圖5所示，為復發風險的 ROC曲線分析圖，兩者具有顯著差異(P 2. 240為高危組，該組患者兩年內復發的概率為70. 4% (50/71)；復發風險< 2. 240為低危組，該組患者兩年內復發的概率為17. 9% (14/78)。同 樣用ROC曲線分析其預測效能。如圖6所示，為用復發風險中位數分組後的ROC曲線分析 圖，用復發風險的中位數2. 240作為復發的預測閾值進行ROC分析。其預測復發的AUC面 積為0. 767，敏感度為78. 1%，特異度為75. 3%。本發明的優點是
5
1、能夠方便運用於臨床、快速有效地在術前預測肝癌肝移植患者術後復發潛能。2、檢測外周血分子指標為非侵入性檢查，創傷小，患者更易接受。3、遺傳學變異反映了腫瘤的生物學行為，結合腫瘤大小、數目等臨床病理指標能 更好的預測腫瘤術後復發，而目前國際上所有的肝癌肝移植標準均未含術前肝癌生物學特 性指標。4、血漿循環DNA可在術前獲取樣本，術前即能完成患者復發潛能評估，有利於移 植病人的選擇、供肝的合理分配。5、外周血獲取方便，可在術前術後對患者進行連續動態監測。有利於高復發風險 的移植患者選擇合理有效的幹預治療，延長總體生存時間。6、腫瘤具有異質性，同一個腫瘤不同的取材點可能得到不同亞群的腫瘤細胞。循 環DNA可以起源於腫瘤內部任何一個亞克隆的群體，因此能比組織學取材的腫瘤更全面地 反映腫瘤細胞的遺傳學改變。
圖1為獲得rs894151和rsl2438080兩個SNP位點的分析流程圖；圖2為總體生存曲線圖；圖3為無復發生存曲線圖；圖4為米蘭標準分層後SNP聯合指標的預測結果圖；圖5為復發風險的ROC曲線分析圖；圖6為用復發風險中位數分組後的ROC曲線分析圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步說明。實施例一種肝癌肝移植術後復發預測試劑盒，以血漿循環DNA中兩個SNP rs894151和 rsl2438080為檢測位點，包括PCR擴增引物以及用於基因分型的螢光檢測探針；其中，PCR擴增引物為rs894151 位點上遊序列5，AGAAACACTGAGTCTGCAGG3，；下遊序列5，GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3，；rs 12438080 位點上遊序列5，GATGACTCATAGCTTCCCTG3，；下遊序列5，CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3，；用於基因分型的螢光檢測探針為rs894151-TA :AACTGTGAATAATAAATGCCACGCA ；rs894151-TG TTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG ；rs894151-TR -P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；rsl2438080-TA TTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA ；rsl2438080-TC :TTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC ；
rsl2438080-TR -P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。使用試劑盒進行肝癌肝移植術後復發預測的具體步驟如下1、血漿獲取肝癌患者肝移植術前，清晨空腹取靜脈血5ml置於EDTA抗凝管中，以 820g離心10分鐘後將上清血漿部分吸至潔淨離心管，再用16000g離心10分鐘完全去除血 細胞成分後置於乾燥潔淨凍存管中。2、循環DNA抽提血漿循環DNA的抽提採用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen公司，德國，cat 51106)試劑盒的操作步驟進行。具體操作步驟如下(1)將試劑盒中所有試劑和buffers升溫至室溫。(2)將水浴箱調至56°C。(3)如果Buffer AL或Buffer ATL含有沉澱，將其置於70°C水域中。(4)加 20μ 1 蛋白酶 K 至 1. 5mlEP 管底。(5)加入200 μ 1血漿至EP管內混勻。(6)加入200 μ IAL至EP管內，渦旋混勻15秒。(7)置入水域箱中56°C孵化10分鐘。(8)短暫離心，去除管蓋內和管壁內側的液珠。(9)打開管蓋，加入200 μ 1無水乙醇，渦旋混勻。(10)將EP管置於90°C水浴箱中放置1小時。(11)短暫離心，去除管蓋內和管壁內側的液珠。(12)將所有液體轉移至QIAamp MinElute column, 6000g離心1分鐘，棄收集管。 將QIAamp MinElute column置入另一潔淨收集管中。(13)在 QIAamp MinElute column 中加入 500 μ 1 AWl，6000g 離心 1 分鐘，棄收集 管。將QIAamp MinElute column置入另一潔淨收集管中。(14)在 QIAamp MinElute column 中加入 500 μ lAW2,6000g 離心 1 分鐘，棄收集 管。將QIAamp MinElute column置入另一潔淨收集管中。(15)將QIAamp MinElute column空柱最高轉速離心3分鐘。(16)將 QIAamp MinElute column 置入一潔淨 1. 5mlEP 管中。加入 100 μ 1 Buffer AE至膜中央。室溫孵育1分鐘。(17)將QIAamp MinElute column全速離心1分鐘收集EP管中的DNA溶解。(18)抽提好的DNA用Nanodrop測濃度後凝膠電泳進行質量鑑定。3、rs894151 和 rsl2438080 位點基因分型SNP分型服務採用連接酶特異檢測技術，對需檢測SNP位點設計特異性探針，在 連接酶的作用下，當特異性的寡核苷酸探針與互補靶序列DNA完全配對時連接反應順利進 行，若寡核苷酸探針與其不完全配對，則連接反應不能進行。最後通過測序儀檢測，得到分 型結果。步驟如下(1)、PCR 擴增:PCR 儀為 ABI 9600 ；擴增體系上一步抽提的DNA Iul (調整濃度至20ng/ul)，10 * buffer (Tris-Cl 10mmol/L, PH 8· 3 8· 8) 1. 5ul, MgCl2 溶液(1. 5mmol/L) 1. 5ul,四種 dNTP (總量為1 OmM) 0. 3u 1，本發明試劑盒中的四種PCR擴增引物，每種1 Opmo 1 /u 1，0. 25u 1，Taq酶(5u/ul) 0. 25ul，加H2O補至15ul。其中，引物由上海生工合成，taq酶(貨號201223)， dNTP都由凱捷公司提供。擴增條件 (2)、連接反應反應體系PCR擴增產物 3ul、10*Taq DNA ligase buffer (20mM Tris-HCl (pH7. 6) Iul、Taq DNAligase (40U/ul) 0. 125ul、本發明試劑盒中的 6 種探針，每種 10pmol/ul，0. OlulJnH2O補至10ul。探針由上海捷瑞合成，Taq DNAligase由NEB公司提 供(貨號測0208S)。 連接條件 (3)、在ABI 377型測序儀上進行電泳檢測取Iul連接產物，加2ul上樣，95C變 性3min，立即冰水浴。4、肝癌肝移植患者的復發風險預測值計算採用如下公式患者復發風險= 2. 008XSNP聯合指標+1.381 X腫瘤大小+0.859X腫瘤數目。當患者兩個位點基因型均 為AA時"SNP聯合指標」 =O ；否則"SNP聯合指標」 =1 ；當患者腫瘤直徑彡5cm時「腫瘤 大小」 =O ；大於5cm時「腫瘤大小」 =1 ；，當患者腫瘤僅一枚時「腫瘤數目」 =O ；多枚時 「腫瘤數目」 =1。腫瘤大小及數目資料來源於患者術前CT或MRI或彩超，由兩種及兩種以 上影像學確認。風險大於2. 240為高復發風險，不適宜行肝移植術，小於等於2. 240則為低 復發風險，適合行肝移植術。
權利要求
一種肝癌肝移植術後復發預測試劑盒，其特徵在於，以血漿循環DNA兩個SNP rs894151和rs12438080為檢測位點，包括PCR擴增引物以及用於基因分型的螢光檢測探針；其中，PCR擴增引物為rs894151位點上遊序列5』AGAAACACTGAGTCTGCAGG3』；下遊序列5』GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3』；rs12438080位點上遊序列5』GATGACTCATAGCTTCCCTG3』；下遊序列5』CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3』；用於基因分型的螢光檢測探針為rs894151-TAAACTGTGAATAATAAATGCCACGCA；rs894151-TGTTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG；rs894151-TR-P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；rs12438080-TATTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA；rs12438080-TCTTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC；rs12438080-TR-P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。
全文摘要
本發明提供了一種肝癌肝移植術後復發預測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒以血漿循環DNA中兩個SNP rs894151和rs12438080為檢測位點，以rs894151和rs12438080上遊序列和下遊序列作為擴增引物，用螢光探針作為基因分型探針。本發明可在術前評估肝癌患者行肝移植術後的復發風險。並且本發明以外周血為檢測樣本具有快捷、準確、簡單、易於推廣應用等特點。可用於臨床肝癌肝移植患者的篩選，指導肝癌肝移植術後的輔助治療，降低高危患者術後復發率，從而改善肝癌肝移植的預後，有效利用有限的供肝。該試劑盒對於超出米蘭標準患者預後的判斷具有重要的臨床意義。
文檔編號C12Q1/68GK101880715SQ20101020493
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年6月22日
發明者代智, 周儉, 樊嘉, 王徵, 肖永勝, 胡捷 申請人:復旦大學附屬中山醫院