一種用於轉基因玉米檢測的標準分子對照物及其製備方法
2023-06-25 13:05:01
專利名稱：：一種用於轉基因玉米檢測的標準分子對照物及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於分子生物學
技術領域：
，涉及轉基因作物檢測中必須的對照物質標準分子及其製備方法，具體說是一種製備轉基因玉米中外源基因特異性片段標準分子對照物的方法。背景材料轉基因產品越來越進入人們的生活。2006年全世界轉基因作物種植面積為10200萬公頃，與2005年轉基因作物9000萬公頃相比增長了13%，從1996年到2006年十年間轉基因作物總的種植面積增加了60倍。目前，世界各國已進行田間試驗的轉基因作物超過5000種，批准商品化的轉基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、菸草、西瓜、菊苣等。我國轉基因生物研究始於20世紀80年代初期，主要是轉基因抗蟲棉。近年來，政府不斷加大對生物技術研究的支持力度，積極促進農業生物技術的研究與產業化開發。轉基因作物安全性主要集中在轉基因作物釋放的環境安全性和由轉基因作物生產出的食品的安全性上。包括對人和動物健康的風險、對生態環境與農業的風險、對非目標生物的風險。針對第一種風險，1993年，聯合國經濟發展與合作組織(OECO)提出了食品安全性評估的"實質等同性"原則。如果轉基因作物生產的產品與傳統產品具有實質等同性，則可以認為是安全的。最早提出對轉基因食品進行標識管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一個法案，要求對轉基因產品進行標籤說明；1999年，要求出口到歐盟的非轉基因產品不得含有1%的轉基因產品汙染；2002年，歐盟將標識的最低限量降低到0.9%。日本、澳大利亞、紐西蘭對轉基因成分的最低含量做了不同規定，域值從1_5%不等。我國於2001年5月9日公布並實施《農業轉基因生物安全管理條例》，於2002年1月5日公布了農業轉基因生物安全評價、標識和進口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農業轉基因生物目錄，並於2002年3月20日起正式實施。轉基因作物檢測方法主要基於核酸水平的PCR檢測和基於蛋白質水平的檢測。核酸水平檢測分為定性和定量檢測，蛋白質水平檢測包括酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫試紙條法等。目前最常用的檢測方法是定性PCR檢測。通過對樣品中可能含有的外源基因進行擴增，再利用瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。如果電泳結果含有特異條帶，說明樣品中含有轉基因成分；反之則沒有。在進行定性PCR檢測時，應設置陰性對照、陽性對照和空白對照，以確保檢測過程的有效性和檢測結果的可靠性。陰性對照是指用非轉基因作物中提取的DNA作為PCR反應體系的模板；陽性對照是指用特定的轉基因作物中提取的DNA作為PCR反應體系的模板；空白對照指用無菌重蒸水作為PCR反應體系的模板。由於轉基因作物存在生物安全性的問題，所以有些轉基因作物的陽性樣品是很難得到的。為了滿足檢驗檢疫工作需要，歐盟委員會直屬的聯合研究中心(JRC)下屬的兩個研究所——健康及消費者保護研究所(IHCP)和標準物質及計量研究所(IRMM)在聯合研製轉基因產品檢測標準物質，目前只製備出幾種轉基因作物標準樣品，包括轉基因大豆RoundReadySoybean、轉基因玉米btll，btl76，mon810，event1507、轉基因棉花event281-24_236x3006-210-23和轉基因甜菜eventH7-l，含量分別為0%、0.1%、0.5%、1%、2%和5%。而全世界已有近百種商品化轉基因品種，現有的標準物質與快速增長的轉基因作物相比，根本無法滿足檢測的需要。綜上所述，種類少、不易獲得是轉基因陽性材料存在的重要問題，嚴重影響著轉基因檢測工作的進行。由於各種限制，國內的檢驗檢疫機構很難獲得陽性樣品，而且國際上有證標準物質的價格也一直居高不下，這些都成為了實際檢側工作中很重要的制約因素。為了解決這個問題，國內各科研單位也做了大量研究工作，但是都不能避開轉基因生物的基因漂移的問題。目前，以質粒作為陽性對照在國際轉基因檢測中的得到公認。例如在英國FAPAS分析實驗室能力驗證測試中心組織的國際能力驗證(轉基因檢測)中，網站的提交信息選項中明確表示質粒可以作為陽性材料使用。在國際期刊上發表的文章中，很多陽性對照也使用質粒。
發明內容本發明通過PCR方法擴增得到轉基因作物外源基因的特異性片段，經重疊PCR將外源基因的特異性片段拼接在一起，經過克隆、建立文庫，那麼就可以將插入這些特異性片段的質粒作為檢測過程中的陽性對照。這樣就為解決陽性樣品缺乏問題提供一條有效途徑，有效地保障檢測工作的進行。而且，以建立文庫的方式獲得陽性材料，容易保存、擴繁。本發明一個目的在於提供一種用於轉基因玉米檢測的標準分子對照物。本發明另一個目的在於提供一套用於製備轉基因玉米標準分子對照物引物。本發明再一個目的在於提供一種篩選製備標準分子特異性引物的方法。本發明還一個目的在於提供一種用於製備轉基因玉米標準分子對照物的方法。即設計特異性引物製備轉基因玉米Mon810、Mon863、BTll、BT176中外源基因特異性片段標準分子對照物。為實現上述目的本發明提供如下的技術方案—種轉基因玉米標準分子對照物，包括轉基因品系M0N810、M0N863、BTll、BT176轉化事件特異性序列及內源基因zSSIIb特異片段，其先後順序為zSSIIb+M0N810+M0N863+BT11+BT176。本發明所述轉基因玉米標準分子對照物，其中zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176標準分子的特異性引物序列如下引物名稱引物序列(5'-3')長度bpTm。CGC%MaiZss-ol:CGGTGGATGCTAAGGCTGATG2158.957.1MaiZss-o2:CACACTTGAAAGGGCCAGG1958.557.9Mai810-o3GCCCTTTCAAGTGTGCCCA1961.457.9Mai810-o4TGAGTGCGCAAGCAAATTCGG2162.752.4tableseeoriginaldocumentpage6本發明設計用於製備轉基因玉米對照物質標準分子引物的方法以將zSSIIb及轉化事件特異性序列特異性引物為基礎，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上轉化事件特異性正向引物的反向互補序列；在轉化事件反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互補序列；在引物設計軟體primerprimer5.0中調節引物Tm值在55-60之間。本發明所述的轉化事件特異性引物序列指的是農業部發布的轉基因作物檢測標準中的引物序列情況，詳細內容見附件1。本發明進一步公開了用於製備轉基因玉米標準分子對照物的PCR反應條件，其特徵在於第一輪反應以非轉基因玉米及轉基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因組DNA為模板，用檢測標準中引物序列擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng組)1yL，用(1朋20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為PPzssb—"PP腦。—"PPM863—"PPB11—"PP罷—!。第二輪反應以第一輪PCR擴增產物PPzssIIb—pPP誦—pPPM863—i、PPB11—i、PP罷—!為模板，以權力說明書2中對應引物，進行PCR擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各0.5yL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。產物記為PPzssb—2、PP腦。—2、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2。第三輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5yL，用ddH20補足至25i！L。其中PP腦。—2與PP腦—2相連接，PPB11—2與PP罷—2相連接。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產物記為Mega810+863和Mega11+176;第二步分別以第一步反應產物Mega810+863和Megal1+176為模板，引物分別為Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL，Mai11-o7禾口Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為PPM81。+M863、PPB11+B176。第四輪反應，分兩步進行擴增第一步取第三輪反應產物PPm810+m863、PPb11+B176各5ilL，2倍pfUmix緩衝液7.5iiL，用ddH20補足至25iiL。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為Mega81。+863+11+176，第二步分別以第一步反應產物，引物為Mai810-o3和Mai176_ol0各1iiL;力口2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為PPM81。+M863+B11+B176。第五輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物PPzssub—2及第四輪產物PP腦。+腦+Bn+罷各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5iiL，用ddH20補足至25yL。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為MegaZSSIIb+81。+863+11+176;第二步以第一步反應產物為模板，引物為MaiZss-ol和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為PPZSSIIM81。+M863+B11+B176。第六輪反應以第五輪產物為模板lyL，用引物MaiZss-ol和Mai176_010擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各1iiL，用(1朋20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4T短期保存。產物記為TPZSSIIb+M81。+M863+B11+B176。回收純化第六輪產物，連接於T-easy載體，導入大腸桿菌JM109即可。為了能更加清楚的說明本發明的測定方法，下面對本發明的試驗方法做以詳細的說明。1、原理本方法採用兩步PCR擴增法將轉基因玉米中特異片段逐步連接起來，獲得含有zSSIIb+M0N810+M0N863+BT11+BT176的轉基因玉米檢測中需要的標準分子對照物質。將該標準分子通過常規的方法採用T-easy載體導入大腸桿菌JM109中，即可長期保存使用。2、引物設計本引物設計依據農業部轉基因玉米檢測標準中涉及的zSSIIb、M0N810、M0N863、BT11、BT176等引物序列，以將zSSIIb及轉化事件M0N810特異性引物為基礎，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上M0N810正向引物的反向互補序列；在轉化事件M0N810反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互補序列；在引物設計軟體primerprimer5.0中調節引物Tm值在55-60之間。用上述方法設計出一套用於製備zSSIIb+M0N810+M0N863+BTll+BT176標準分子的引物。表l引物序列表如下tableseeoriginaldocumentpage83、製備方法第一輪反應以非轉基因玉米及轉基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因組DNA為模板，用檢測標準中引物序列擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng組)1yL，用(1朋20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為PPzssb—"PP腦。—"PPM863—"PPB11—"PP罷—!。第二輪反應以第一輪PCR擴增產物PP^hh、PP誦fPP鵬h、PPb1h、PP罷4為模板，以權力說明書2中對應引物，進行PCR擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各0.5yL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。產物記為PPzssb—2、PP腦。—2、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2。第三輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5yL，用ddH20補足至25i！L。其中PP腦。—2與PP腦—2相連接，PPB11—2與PP罷—2相連接。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產物記為Mega810+863和Mega11+176;第二步分別以第一步反應產物Mega810+863和Megal1+176為模板，引物分別為Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL，Mai11-o7禾口Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為PPM81。+M863、PPB11+B176。第四輪反應，分兩步進行擴增第一步取第三輪反應產物PPm810+m863、PPb11+B176各5ilL，2倍pfUmix緩衝液7.5iiL，用ddH20補足至25iiL。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為Mega81。+863+11+176，第二步分別以第一步反應產物，引物為Mai810-o3和Mai176_ol0各1iiL;力口2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為PPM81。+M863+B11+B176。第五輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物PPzssub—2及第四輪產物PP腦。+腦+Bn+罷各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5iiL，用ddH20補足至25yL。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。產物記為MegaZSSIIb+81。+863+11+176;第二步以第一步反應產物為模板，引物為MaiZss-ol和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為PPZSSIIM81。+M863+B11+B176。第六輪反應以第五輪產物為模板lyL，用引物MaiZss-ol和Mai176-ol0擴增；回收純化第六輪產物，連接於T-easy載體，導入大腸桿菌JM109即可。其方法參本發明公開的有效製備轉基因作物檢測標準分子對照物zSSIIb+M0N810+M0N863+BTll+BT176方法所具有的特點在於(1)方便檢測需要將4種轉基因玉米品系的外源基因特異性片段連在一起，在檢測過程中無需提取多種陽性基因組DNA作為陽性對照。(2)易傳代將該標準分子導入大腸桿菌，易保藏、傳代。(3)易加入新的外源片段如有新的轉基因材料出現，可在原標準分子的基礎上加入新的外源片段，滿足日益增多的轉基因作物材料的檢測需要。(4)降低生物安全等級，風險可控標準分子只含有檢測標準中需要的特異片段，不能表達，且大腸桿菌易滅活。產物記為TP:zssIIb+M810+M863+Bll+B176。圖1為PCR產物用2X瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓，30min圖。圖中M為DL2000D應Eirker;其中1-6為zSSIIb引物擴增結果1為空白對照，2為陰性對照，3為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，4為標準分子陽性對照，5為樣品重複1，6為樣品重複2;7-12為BT11引物擴增結果7為空白對照，8為陰性對照，9為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，10為標準分子陽性對照，11為樣品重複1，12為樣品重複2;13-18為BT176引物擴增結果13為空白對照，14為陰性對照，15為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，16為標準分子陽性對照，17為樣品重複1，18為樣品重複2;19-24為M0N810引物擴增結果19為空白對照，20為陰性對照，21為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，22為標準分子陽性對照，23為樣品重複1，24為樣品重複2;25-30為M0N863引物擴增結果25為空白對照，26為陰性對照，27為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，28為標準分子陽性對照，29為樣品重複1，30為樣品重複2.結果顯示樣品中含有轉基因玉米品系M0N863成分，不含有BT11、BT176、M0N810成分；同時驗證了本專利製備的標準分子陽性對照物能有效地代替轉基因玉米基因組DNA陽性對照。具體實施例方式為了更充分的解釋本發明的實施，提供轉基因玉米標準分子對照物的製備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發明的範圍。其中試驗中所採用的原料及試劑均有市售。實施例1:M0N810+M0N863標準分子製備過程材料轉基因玉米品系M0N810和M0N863基因組DNA(50ng/iiL);試劑pfUmix緩衝液(2倍);Taqmix緩衝液(2倍)；引物(10mM，見表);T-easy載體；大腸桿菌JM109;儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養箱tableseeoriginaldocumentpage10方法第一輪反應以轉基因玉米品系M0N810、M0N863基因組DNA為模板，用檢測標準中引物序列擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩衝液25yL，上下遊引物(10mM)各0.5iiL，模板(50ng/yL)1iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4"短期保存。產物記為PP誦—"PPM863—10第二輪反應以第一輪PCR擴增產物PP,。—pPPM863—工為模板，以上表中對應引物，進行PCR擴增；反應體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩衝液25yL，上下遊引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。產物記為PPM81。—2、PPM863—2。第三輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5yL，用ddH20補足至25iiL。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為Mega81。+863;第二步以第一步反應產物Mega8闊63為模板，引物分別為Mai810_o3和Mai863-o6各1iiL;力口2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為PPM81。+M863。第四輪反應以第三輪產物為模板liiL，用Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩衝液25iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72t:，5min;4t:短期保存。產物記為TPM81。+M863。回收純化第四輪產物，連接於T-easy載體，導入大腸桿菌JM109即可。實施例2:Btll+btl76標準分子製備過程材料轉基因玉米品系Btll和Btl76基因組DNA(50ng/iiL);試劑:pfUmix緩衝液(2倍);Taqmix緩衝液(2倍)；引物(10mM，見表);T-easy載體；大腸桿菌JM109;儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養箱引物名稱引物序列(5'-3')Maill-o7AAAGATGGTAGCGGAACCCCMaiII-08CGTGCTTTGCAAGAAATGGTCMai176-o9CCATTTCTTGTGAAGCACGGTCMail76-ol0TCGACTTTATAGGAAGGGAGAGG方法第一輪反應以轉基因玉米品系BT11、BT176基因組DNA為模板，用檢測標準中引物序列擴增；反應體系為總體積為50L，其中2倍pfUmix緩衝液25yL，上下遊引物(10mM)各0.5iiL，模板(50ng/yL)1iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產物記為PPB11—"PP罷—10第二輪反應以第一輪PCR擴增產物PPBn—pPPB176—工為模板，以上表中對應引物，進行PCR擴增；反應體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩衝液25yL，上下遊引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。產物記為PPB11—2、PP罷—2。第三輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5yL，用ddH20補足至25iiL。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為Mega11+176;第二步以第一步反應產物Mega^76為模板，引物分別為Mai11-o7和Mai176-ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為PPB11+B176。第四輪反應以第三輪產物為模板lyL，用Maill-o7和Mai176_ol0各1yL擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩衝液25iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72°C，5min;4"C短期保存。產物記為TPB11+B176。回收純化第四輪產物，連接於T-easy載體，導入大腸桿菌JM109即可。實施例3:ZssIIb+M0N810+M0N863標準分子製備過程材料非轉基因玉米基因組DNA(50ng/yL)，PCR產物PPM81。+M863;試劑:pfUmix緩衝液(2倍);Taqmix緩衝液(2倍);引物(10mM，見表);T-easy載體；大腸桿菌JM109;儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養箱引物名稱引物序列(5'-3')MaiZss—ol:CGGTGGATGCTAAGGCTGATGMaiZss-o2:CACACTTGAAAGGGCCAGGMai810-o3GCCCTTTCAAGTGTGCCCA12tableseeoriginaldocumentpage13方法第一輪反應以非轉基因玉米基因組DNA為模板，用檢測標準中引物序列擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各O.5yL，模板(50ng/iiL)1iiL，用ddH20補足至50yL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，30sec);72。C，5min;4"C短期保存。產物記為PPZSSIIb—10第二輪反應以第一輪PCR擴增產物PP^nb—!為模板，以ol-o6對應引物，進行PCR擴增；反應體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩衝液25yL，上下遊引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，30sec);72°C，5min;4"短期保存。產物記為PPZSSIIb—2。第三輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物及PPM81。+M863各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5yL，用(1(11120補足至25iiL。反應程序95。C，3min;10個循環(94°C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為Megazssiib+810+863，第二步分別以第一步反應產物為模板，引物分別為MaiZss-o和Mai863_o6各1yL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50yL。反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為PPZssiib+81。+863。第四輪反應以第三輪產物lyL為模板，用引物MaiZss-ol和Mai176-o8擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各1iiL，用(1朋20補足至50iiL。反應程序為95。C，3min;30個循環(94。C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，2min);72°C，5min;4t:短期保存。產物記為TPzssiib+M8io+M863。回收純化第7K輪廣物，連接於T-easy載體，導入大腸桿菌JM109即可。實施例4對照比較材料轉基因玉米品系M0N810、M0N863、Bt11和Btl76基因組DNA(50ng/iiL)，本發明製備的轉基因玉米標準分子對照物，待測樣品基因組DNA(50ng/yL);試劑:Taqmix緩衝液(2倍);引物(10mM，見表);儀器PCR儀；電泳儀；水浴鍋；培養箱方法1轉基因玉米標準分子對照物DNA快速提取無菌條件下，挑去已導入zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176標準分子的JM109大腸桿菌一環，與100iiLPCR小管中，100。C煮沸8min。冰上2min備用。2PCR擴增檢測樣品中是否含有轉基因玉米M0N810、M0N863、BT11、BT176:設置空白對照、陰性對照、轉基因玉米基因組DNA陽性對照、標準分子陽性對照、樣品重複l、樣品重複2。使用檢測標準中品系特異性引物依次對樣品中的內源基因zSSIIb及外源基因M0N810、M0N863、BT11、BT176進行PCR檢測。反應體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各1iiL，DNA模板1iiL，空白對照用水代替，用ddH20補足至50yL。反應程序為95。C，3min;35個循環(94°C，30sec;50°C，30sec;72°C，lmin);72°C，5min;4"短期保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓，30min。結果見下圖1。其中1-6為zSSIIb引物擴增結果1為空白對照，2為陰性對照，3為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，4為標準分子陽性對照，5為樣品重複1，6為樣品重複2;7-12為BT11引物擴增結果7為空白對照，8為陰性對照，9為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，10為標準分子陽性對照，11為樣品重複1，12為樣品重複2;13-18為BT176引物擴增結果13為空白對照，14為陰性對照，15為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，16為標準分子陽性對照，17為樣品重複1，18為樣品重複2;19-24為M0N810引物擴增結果19為空白對照，20為陰性對照，21為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，22為標準分子陽性對照，23為樣品重複1，24為樣品重複2;25-30為M0N863引物擴增結果25為空白對照，26為陰性對照，27為轉基因玉米基因組DNA陽性對照，28為標準分子陽性對照，29為樣品重複1，30為樣品重複2.結果顯示樣品中含有轉基因玉米品系M0N863成分，不含有BT11、BT176、M0N810成分；同時驗證了本專利製備的標準分子陽性對照物能有效地代替轉基因玉米基因組DNA陽性對照。附件1:轉基因玉米檢測標準中轉化事件特異性引物序列表tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage15:0158]附件2:PCR產物回收後連接T-easy載體及導入JM109大腸桿菌方法，參見:0159]http:/7www.promega.com.cn/techserv/ctbs/pGEM—T.pdf。:0160]序列表:0161]天津市農業科學院中心實驗室:0162]〈120〉一種牛羊源成分的快速檢測方法:0163]〈160>10:0164]〈210>1:0165]〈2U〉21bp:0166]〈212〉DNA:0167]〈213〉人工序列:0168]〈400>1:0169]cggtggatgctaaggctgatg21:0170]〈210>2:0171]〈2H〉19bp:0172]〈212>DNA:0173]〈213>人工序列:0174]〈400〉2:0175]cacacttgaaagggccagg19:0176]〈210>3:0177]〈2H〉19bp:0178]〈212>DNA:0179]〈213>人工序列:0180]〈400>3:0181]gccctttcaagtgtgccca19:0182]〈210>4:0183]21bp:0184]〈212>DNA:0185]〈213>人工序列:0186]〈400>4:0187]tgagtgcgcaagcaaattcgg21:0188]〈210〉5:0189]〈211〉21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ttgcttgcgcactcaaagacc〈210>6〈211>21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ggttccgctaccatctttggg〈210>7〈211>20bpDNA〈213〉人工序列〈400>7aaagatggtegcggaacccc〈210>8〈211>21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8cgtgctttgcaagaaatggtc〈210>9〈211>22bp〈212>DNA人工序列〈400>9ccatttcttgtgaagcacggtc〈210>10[0219:23bp[0220:〈212>DNA[0221:〈213〉人工序列[0222:〈400>10[0223:tcgactttataggaagggagagg說明書13/13頁20221權利要求一種用於轉基因玉米檢測的標準分子對照物，包括轉基因品系MON810、MON863、BT11、BT176轉化事件特異性序列及內源基因zSSIIb特異片段，其先後順序為zSSIIb+MON810+MON863+BT11+BT176。2.如權利要求1所述轉基因玉米標準分子對照物，其中zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176標準分子的引物序列如下tableseeoriginaldocumentpage23.—種用於篩選權利要求2所述引物的方法其特徵在於以將zSSIIb及轉化事件特異性序列特異性引物為基礎，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上轉化事件特異性正向引物的反向互補序列；在轉化事件反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互補序列；以連接處為中心，刪減兩端序列，使引物長度在18-28bp之間，Tm值在55-60之間。C。4.一種用於製備權利要求1所述轉基因玉米標準分子對照物的PCR反應方法，其特徵在於第一輪反應以非轉基因玉米及轉基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因組DNA為模板，用檢測標準中引物序列擴增；反應體系為總體積為50yL，其中2倍pfUmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng/yL)1yL，用ddH20補足至50yL;反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；產物記為PPZSSIIb-"PP腦。-"PPM863-"PPB11-"PP罷-!;第二輪反應以第一輪PCR擴增產物PP^nb—pPP誦—pPP腦—pPP,pPP罷—!為模板，以ol-olO中對應引物，進行PCR擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍pfUmix緩衝液`25iiL，上下遊引物(10mM)各O.5yL，用ddH20補足至50yL;反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；產物記為PPZSSIIb—2、PP腦。—2、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2;第三輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5iiL，用ddH20補足至25i！L;其中PP腦。—2與PP腦—2相連接，PPB11—2與PPB176—2相連接;反應程序95。C，3min;10個循環(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4"短期保存；產物記為Mega81。+863和Mega11+176;第二步分別以第一步反應產物Mega810+863和Megall+176為模板，引物分別為Mai810-o3禾PMai863_o6各1iiL，Mai11-o7和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50iiL;反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存；產物記為PPm810+m863、PPb11+B176;第四輪反應，分兩步進行擴增第一步取第三輪反應產物PPm8io+m863、PPbii+bi76各5iiL，2倍pfUmix緩衝液7.5ilL，用ddH20補足至25iiL;反應程序95。C，3min;10個循環(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存；產物記為Mega81。+863+11+176，第二步分別以第一步反應產物，引物為Mai810-o3和Mai176_ol0各1yL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50yL;反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。產物記為PPM810+M863+B11+B176，第五輪反應，分兩步進行擴增第一步取第二輪反應產物PPzssllb-2及第四輪產物PPM810+M863+B11+B176^S"5ilL，2f昔pfUmix緩衝液7.5iiL，用ddH20補足至25iiL;反應程序95。C，3min;10個循環(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;fC短期保存；產物記為MegazssIIb+810+863+ll+176，第二步以第一步反應產物為模板，引物為MaiZss-ol和Mai176_ol0各1yL;加2倍pfUmix緩衝液12.5iiL，用ddH20補足至50yL;反應程序95。C，3min;20個循環(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存；產物記為formulaseeoriginaldocumentpage0，第六輪反應以第五輪產物為模板L，用引物MaiZss-ol和Mai176_ol0擴增；反應體系為總體積為50iiL，其中2倍Taqmix緩衝液25iiL，上下遊引物(10mM)各1iiL，用ddH20補足至50iiL;反應程序為95。C，3min;30個循環(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；產物記為TPZSSIIb+M81。+M863+B11+B176;回收純化第六輪產物，連接於T-easy載體，導入大腸桿菌JM109即可長期保存使用。全文摘要本發明公開了一種轉基因作物檢測中必要的標準分子對照物及其製備方法。設計特異性引物製備含有玉米內源基因ZssIIB特異片段及轉基因玉米品系Mon810、Mon863、BT11、BT176中外源基因特異片段標準分子對照物質。本發明將4種轉基因玉米品系的外源基因特異性片段連在一起，在檢測過程中無需提取多種陽性基因組DNA作為陽性對照。將該標準分子導入大腸桿菌，易保藏、傳代。如有新的轉基因材料出現，可在原標準分子的基礎上加入新的外源片段，滿足日益增多的轉基因作物材料的檢測需要。文檔編號C12N15/10GK101724702SQ20091024503公開日2010年6月9日申請日期2009年12月23日優先權日2009年12月23日發明者蘭青闊,朱珠,王永,程奕,趙新申請人:天津市農業科學院中心實驗室