富含異黃酮化合物的分離蛋白及其生產方法
2023-06-15 04:02:26
專利名稱：富含異黃酮化合物的分離蛋白及其生產方法
技術領域：
本發明涉及富含異黃酮的植物分離蛋白及其製備方法。
異黃酮存在於各種豆科植物中，包括植物蛋白原料如大豆。對於本發明來說，這些化合物一般包括黃豆苷、60AC-黃豆苷、黃豆苷原、染料木苷、60AC染料木苷、染料木黃酮、大豆異黃酮、生原禪寧-A、芒柄花黃素和擬雌內酯。通常這些化合物與大豆固有的苦味有關，在生產商品如分離物和濃縮物時，焦點一直集中在如何除去這些物質。例如，在傳統的生產大豆分離蛋白的方法中，用鹼液介質浸取大豆片，大部分異黃酮溶解在浸出液中並在乳清中保持溶解狀態，用酸沉澱蛋白質形成分離物後乳清通常被排掉。通過徹底洗滌分離物通常可以除去殘留在酸沉澱的分離蛋白中的異黃酮。
最近人們認識到植物蛋白如大豆中所含的異黃酮能抑制人類癌細胞的生長，如在下列文獻中描述的乳腺癌細胞和前列腺細胞Peterson和Barnes的「Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer CellsIndependence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene」(Biochemical and Biophysical Research Communications，Vol.179，NO. 1，P. 661-667，August 30，1991)，Peterson和Barnes的「Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostrate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation」，(The Prostate 22:335-345(1993))以及Barnes等人的「Soybeans Inhibit Mammory Tumors in Models of Breast Cancer」(Mutagens and Carcinogens in the Diet P.239-253(1990).)。
上述令人感興趣的異黃酮引起對適合於在膳食中攝取的富含這些化合物的蛋白質物料的需求，而在以前生產商品蛋白質材料的方法中總是儘可能地除去這些化合物。
因此，本發明的目的是提供一種富含異黃酮的分離蛋白及其生產方法。此目的和其它目的在下面詳細描述的本發明中能夠實現。
本發明涉及一種富含異黃酮的植物分離蛋白及其生產方法，本發明的方法包括用PH值高於大約蛋白質等電點的含水提取劑提取植物蛋白質原料得到含有蛋白質和異黃酮的水相提取液。然後調節水相提取液的PH值至大約蛋白質材料的等電點以沉澱蛋白質材料。分離沉澱出的蛋白質材料，但避免或最大限度地減少對沉澱物的進一步的洗滌以防止失去剩餘的異黃酮，提供富含異黃酮的分離物。另外，既然異黃酮容易溶解在用於溶解蛋白質的含水提取劑中，那麼所採用的蛋白質原料與水的特定重量比應在提取過程中最大程度地溶解異黃酮。
對本發明來說，有用的異黃酮具有下列通式
其中R1、R2、R3和R4可選自H、OH和OCH3以及這些化合物的葡糖苷。具體地說，已從植物蛋白質原料分離出的這些化合物和其葡糖苷包括黃豆苷、60AC-黃豆苷、黃豆苷原、染料木苷、60AC-染料木苷、染料木黃酮、大豆異黃酮、生原禪寧-A、芒柄花黃素和擬雌內酯。本發明分離物富含的異黃酮優選包括黃豆苷、60AC-黃豆苷、黃豆苷原、染料木苷、60AC-染料木苷和染料木黃酮。
儘管本發明是針對大豆製品進行描述的，而且其方法特別適合於由大豆原料生產的富含異黃酮的分離物，但本發明方法一般也適用於從包含異黃酮的各種植物蛋白源中生產分離蛋白。
本發明的起始原料是大豆片，其中所含油已通過溶劑浸取從其中除去。用PH值大於大約蛋白質材料等電點的含水提取劑提取大豆片，優選的PH值大約為6.0-10.0，最優選的PH值大約為6.7-9.7。如果需要，可採用典型的鹼性試劑來提高含水提取劑的PH值，提取劑包括氫氧化鈉，氫氧化鉀和氫氧化鈣。所需的異黃酮化合物通常溶解在含水提取劑中，為了最大程度地回收含水提取液中的這些化合物，將薄片與含水提取液的重量比控制至特定的值上以便儘可能多的溶解蛋白質材料中固有的異黃酮。
可用各種方式完成蛋白質和異黃酮的提取，包括以豆片與含水提取液的重量比為大約5∶1-12∶1的比例對豆片進行逆流提取，其中用初始提取液再提取豆片得到含蛋白質和異黃酮的水提液。另外，也可以採用兩步提取法，其中第一步提取豆片與提取劑的重量比為大約8∶1，第二步提取是用新鮮提取劑提取豆片，豆片與提取劑的重量比為大約3∶1-大約6∶1，這樣在這兩步中，兩步加起來的豆片與提取劑的重量比不會超過豆片與提取劑的總重量比即大約11∶1-14∶1。
儘管不是嚴格的，但提取可在溫度高達大約120°F下進行大約5-60分鐘，優選15分鐘。然後通過加入食用酸如醋酸、硫酸、磷酸、鹽酸或任何其它適合的酸性試劑將含有上述異黃酮的蛋白質水提液的PH值調節至大約蛋白質的等電點。大豆蛋白的等電點一般在大約4.0-5.0，優選大約4.4-4.6。PH值調至等電點時沉澱出凝乳狀的蛋白質。典型地，在生產傳統的分離蛋白中，從稱為乳清的剩餘水提液中分離出酸沉澱的蛋白質，然後洗滌或處理以除去殘留的風味物。此後將洗滌的分離物脫水以形成蛋白質含量(以幹基計)大於90%的乾燥分離物。反覆進行徹底的洗滌以除去不期望的風味，這些風味歸因於在大豆中的各種「酚」化合物如異黃酮。
在本發明中，完全避免或儘量減少蛋白質材料的洗滌以便基本上減少蛋白沉澱物中異黃酮的除去，由此提供富含異黃酮的分離物。例如通過避免或儘量減少對沉澱的蛋白質材料的洗滌，在乾燥的分離蛋白中保留的異黃酮大於兩倍。因此應當完全避免用水洗滌酸沉澱的蛋白質或僅限於用水洗滌一次，在洗滌過程中水與起始蛋白質原料的重量比為2∶1-4∶1。由於不洗或少洗酸沉澱的凝乳，得到了富含所需的異黃酮的分離物。
然後結合離心或濃縮法使酸沉澱的蛋白質脫水並用傳統的方法乾燥。本發明不受具體脫水方法的限制，但優選採用傳統的乾燥技術如噴霧乾燥以形成乾燥的分離物。正如下面具體實施例所說明的那樣，用上述方法生產的分離蛋白比傳統的分離物提高了異黃酮的含量。
實施例1為了說明按照本發明生產的分離蛋白中異黃酮的含量有所增加，首先說明傳統的分離蛋白和其生產方法以表明在傳統的方法中所需異黃酮的回收率。將100磅脫脂大豆片放入提取罐中，用加熱至90°F的1，000磅水提取，該水中加入有足夠量的氫氧化鈣使PH值調節至9.7。水與豆片的重量比為10∶1。從提取液中分離出豆片，並用600磅PH值為9.7，溫度90°F的水提取液再次萃取豆片。此第二步萃取的水與豆片的重量比為6∶1。通過離心分離除去豆片，將第一和第二步的提取液合併並用鹽酸調節到PH值為4.5。通過離心分離從乳清中分離出酸沉澱的凝乳狀物，然後用是起始原料重量7倍的水洗滌得到分離蛋白。對凝乳狀物、乳清、豆片渣和起始原料中的染料木苷(包括染料木苷、染料木黃酮和60AC-染料木苷)和黃豆苷(包括黃豆苷、黃豆苷原和60AC-黃豆苷)進行分析。用下述方法完成這些異黃酮的分析測定總染料木苷和黃豆苷的方法
1.稱出0.25g大豆產品並加入到20ml由80份甲醇、10份水和10份3NHCl組成的提取溶液中。
2.另加20ml4NHCl並將混合物攪拌10分鐘。
3.用冷凝器將溶液回流1小時。
4.冷卻溶液，用Whatman #4濾紙過濾。
5.移出10ml等分試樣，往其中加10ml微孔水(milli pore water)和0.4ml醋酸並混合。
6.將每份溶液注入HPLC柱並通過UV吸收測量上述異黃酮的量。
在表1中列出對沉澱的凝乳狀物、大豆乳清、豆片渣和起始原料中的上述異黃酮的分析值。結果還給出了從起始原料所含量中回收上述異黃酮的百分率。
表1含量(mg/gm幹基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物0.900.5423％15％乳清3.243.3075％83％豆片渣0.21 0.192％2％起始原料1.721.58上述實施例清楚地說明，在傳統方法中，所需異黃酮大部分富集在乳清中，使大多數商品分離蛋白中異黃酮的含量低。
實施例2將100磅脫脂大豆片放入提取罐中，用800磅加熱至90°F的水以連續兩步逆流法提取，所說的水中加有足夠的氫氧化鈣使PH值調節至9.7。水與豆片的重量比為8∶1。通過離心分離除去豆片，調節水提液至PH值為4.5以便沉澱出蛋白質，然後通過離心分離從乳清中分離出蛋白質。避免用水洗滌分離的凝乳狀物。用類似於實施例1中描述的方法對凝乳狀物、乳清、豆片渣和起始原料進行分析。這些結果列於表2中。
表2含量(mg/gm幹基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.311.5959％44％乳清1.682.1139％53％豆片渣0.210.282％3％起始原料1.721.58上述回收結果表明，與實施例1相比，在凝乳狀物中所需異黃酮的量已顯著地增加，由此得到富含異黃酮的大豆分離蛋白。
實施例3同實施例2描述的製備酸沉澱的凝乳狀物，但接著酸沉澱凝乳狀物後，用等於2倍於豆片重量的室溫水洗滌凝乳狀物。如實施例1描述的進行分析，異黃酮的回收率列於表3中。
表3含量(mg/gm幹基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.031.3752％38％乳清1.942.3545％59％豆片渣0.310.283％3％起始原料1.721.58回收結果表明，與實施例1相比，凝乳狀物中異黃酮回收率顯著地增加，由此得到富含異黃酮的大豆分離蛋白。
實施例4按實施例2的描述製備酸沉澱的凝乳，但接著用酸沉澱後，用等於4倍於豆片重量的室溫水洗滌凝乳狀物。由此方法得到的異黃酮回收率列於表4中。
表4含量(mg/gm幹基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物1.801.1246％31％乳清2.202.6351％66％豆片渣0.310.283％3％起始原料1.721.58與實施例1相比，儘管回收數據表明了凝乳狀物中異黃酮回收明顯的增加，但回收率比實施例3描述的少。
實施例5用800克90°F的水提取100克脫脂大豆粉。漿液的PH值為6.7。將漿液攪拌5分鐘並離心分離以除去粉渣。用鹽酸調節提取液至PH值為4.5並通過離心分離10分鐘從大豆乳清中分離出凝乳狀物。不洗滌凝乳狀物。如實施例1的描述測定各部分中異黃酮的回收率並列於表5中。
表5含量(mg/gm幹基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.491.7660％46％乳清1.251.4729％37％豆粉渣0.911.4011％17％起始原料1.721.58可以看出，與實施例1相比，凝乳狀物中異黃酮的量普遍得到提高。
實施例6用800g 90°F的水提取100g脫脂大豆粉。通過加氫氧化鈣調PH值至9.7。攪拌漿液15分鐘，然後離心分離5分鐘以分離出提取液。通過將粉與300g水混合5分鐘對粉渣進行第二次提取。通過離心分離5分鐘從粉渣中分離出第二次提取液。將第一和第二次的水提液合併並調PH值至蛋白質的等電點4.5。通過離心分離回收酸沉澱的凝乳狀物，按實施例1的描述測定凝乳狀物，乳清和粉渣中異黃酮的回收率。異黃酮的回收列於表6中。
表6含量(mg/gm幹基)％回收率材料染料木苷黃豆苷染料木苷黃豆苷凝乳狀物2.231.4857％41％乳清1.772.2741％57％豆粉渣0.210.192％2％起始原料1.721.58顯然，對本領域技術人員來說，可對在此描述的本發明進行許多的改變和改進。
權利要求
1.一種生產富含異黃酮的植物分離蛋白的方法，包括(a)用PH值大於大約原料等電點的含水提取劑提取含有異黃酮的植物蛋白原料得到含有蛋白質和異黃酮的水相提取液；(b)調節水相提取液的PH值至大約蛋白質材料的等電點以便沉澱出蛋白質材料；和(c)分離所說的沉澱蛋白質材料並避免用水進一步洗滌所說的沉澱物以得到富含異黃酮的分離蛋白。
2.根據權利要求1的方法，其中提取是在PH值大約6.0-10.0下進行的。
3.根據權利要求2的方法，其中提取是在PH值大約6.7-9.7下進行的。
4.根據權利要求1的方法，其中調節提取液的PH值至大約4.4-4.6。
5.根據權利要求1的方法，其中用所說的提取劑，以提取劑與原料的重量比為大約5∶1-12∶1的比例提取植物蛋白原料。
6.根據權利要求1的方法，其中提取植物蛋白原料包括兩步提取，而兩次提取的提取劑與原料的相加重量比不會超過大約11∶1-14∶1的總重量比。
7.一種生產富含異黃酮的植物分離蛋白的方法包括(a)用PH值大於大約原料等電點的含水提取劑提取含有異黃酮的植物蛋白原料以得到含有蛋白質和異黃酮的水提液；(b)調節水提液的PH值至大約蛋白質材料的等電點以便沉澱出蛋白質材料；和(c)分離所說的沉澱蛋白材料並用小於約4倍於蛋白材料重量的水洗滌所說的材料以提供富含異黃酮的分離蛋白。
8.根據權利要求7的方法，其中在PH值為大約6.0-10.0下進行提取。
9.根據權利要求8的方法，其中在PH值為大約6.7-9.7的條件下進行提取。
10.根據權利要求7的方法，其中調節提取液的PH值至大約4.4-4.6。
11.根據權利要求7的方法，其中用提取劑與原料的重量比為大約5∶1-12∶1的所說提取液提取植物蛋白質原料。
12.根據權利要求7的方法，其中提取植物蛋白質原料包括兩步法提取，而兩次提取的提取劑與原料的相加重量比不會超過大約11∶1-14∶1的總重量比。
13.根據權利要求7的方法，其中用小於約2倍於蛋白質材料重量的水洗滌沉澱的蛋白質材料。
14.根據權利要求7的方法，包括將富含異黃酮的分離物脫水的步驟。
15.由權利要求14的方法生產所得的富含異黃酮的分離物。
全文摘要
本發明涉及生產富含異黃酮的植物分離蛋白，其中控制原料與提取劑的重量比，避免或儘量減少洗滌酸沉澱的蛋白質凝乳狀物以提高分離蛋白中異黃酮的含量。
文檔編號A61K36/185GK1111946SQ94112830
公開日1995年11月22日 申請日期1994年10月12日 優先權日1993年10月12日
發明者J·L·什恩, B·F·戈瓦拉, F·E·斯帕達弗拉 申請人:蛋白質技術國際公司