人肌動蛋白相關蛋白基因、其編碼的多肽及製法和用途的製作方法

2023-06-15 02:52:16

專利名稱：人肌動蛋白相關蛋白基因、其編碼的多肽及製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產。更具體地說，本發明的蛋白多肽被推斷鑑定為肌動蛋白相關蛋白家族的一個新成員。
肌動蛋白相關蛋白(actin-related protein，簡稱為″ARP″)是一類和肌動蛋白有著共同的起源，經歷了不同進化歷程的蛋白分子。它是肌動蛋白超家族的一員，普遍存在於各種真核生物細胞中，並且是細胞骨架的重要組成部分之一，廣泛參與細胞形狀的維持、細胞運動、胞質分裂和細胞器移動等功能(Trends Cell Biol.6208-212，1996；Curr.Opin.Cell Biol.830-37，1996)。
1992年Schroer等人最早在酵母中用隨機測序法發現了Arp基因(J.Cell.Biol.1271777-1778，1994)，以後人們在各種生物中都發現了Arp基因家族的成員。已知的Arp家族成員可分成三個家族Arp1、Arp2和Arp3，它們分別有著各自獨特的序列和功能。1992年Lees-Miller等人從裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中發現了第一個Arp3家族成員act2(Proc.Natl.Acad.Sci.8980-83，1992)；1995年Kelleher等人在阿米巴蟲(Acanthamoeba castellanii)中克隆了Arp3的同源物(J.Cell.Biol.131(2)385-397，1995)；同年Murgia等人在粘菌(Dictyostelium discoideum)中找到了Apr3家族成員(FEBS Letters 360235-241，1995).1997年Welch等人在人的血小板細胞中找到了Arp3家族的同源物(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。但在本申請之前，沒有公開或發表過其它的人的Arp3蛋白同源物。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼肌動蛋白相關蛋白基因家族的一個新成員，本發明新的人肌動蛋白相關蛋白基因被命名為人Arp3H。
本發明的另一個目的是提供一種新的肌動蛋白相關蛋白蛋白家族成員，該蛋白被命名為人Arp3H蛋白。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人肌動蛋白相關蛋白的方法。
本發明還涉及這種人肌動蛋白相關蛋白基因序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的人Arp3H蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有人Arp3H蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人Arp3H蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Arp3H蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Arp3H蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Arp3H蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為583個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位於29-1237位核苷酸。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「人Arp3H蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中29-1237位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.3序列的編碼框29-1237位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.3中29-1237位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人Arp3H相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「人Arp3H蛋白多肽」指具有人Arp3H蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術語還包括具有與人肌動蛋白相關蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人Arp3H蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人Arp3H DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Arp3H多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人Arp3H多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還提供了人Arp3H多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Arp3H多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供人Arp3H蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Arp3H多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還可以包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「人Arp3H保守性變異多肽」指與SEQ ID No.4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。較佳地，這些保守性變異多肽是根據表1進行胺基酸替換而產生的。
表1
本發明還包括人Arp3H多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內人Arp3H的表達。
本發明還包括一種可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有人Arp3H核苷酸序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼人Arp3H的核酸分子。
本發明還包括檢測人Arp3H核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於人Arp3H多肽的編碼序列，可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對人Arp3H DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人Arp3H基因產物或片段。較佳地，指那些能與人Arp3H基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人Arp3H蛋白的分子，也包括那些並不影響人Arp3H蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人Arp3H基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人Arp3H基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人Arp3H或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人Arp3H功能的抗體以及不影響人Arp3H功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人Arp3H基因產物的片段或功能區，通過免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人Arp3H基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人Arp3H核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。
對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的SEQ ID NO.3序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按已知方法製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發明的一個實施方案中，本發明獲得的Arp3H的多核苷酸全長為1269個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位於29-1237位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人腦λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-CGGGGCCGAGCGCCGCGCG-3′和反向引物B15′-TGACACCATCGAACGAC GCGTTC-3′進行PCR，獲得1269bp的目的片段。測序後得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
根據同源比較的結果，本發明的核苷酸序列及其編碼的蛋白質序列與不同來源的肌動蛋白相關蛋白顯示了顯著的同源性，因此，這表明它是肌動蛋白相關蛋白家族的一個新成員，並且具有肌動蛋白相關蛋白家族蛋白的一些重要功能。
和Arp2相類似，Arp3也是和肌動蛋白同源程度較低、相關性較遠的Arp蛋白(Proc.Natl.Acad.Sci.8980-83，1992)。它們廣泛存在於真核生物中(Curr.Opin.Cell Biol.830-37，1996)。Arp3蛋白和肌動蛋白有著相似的三維核心結構，並且有結合ATP所需的全部胺基酸殘基，但是和蛋白間相互作用相關的蛋白表面的胺基酸殘基是各異的(Trends Cell Biol.6208-212，1996)。
在在阿米巴蟲中Arp3蛋白集中分布於富含肌動蛋白的皮質區(J.Cell.Biol.131(2)385-397，1995)。對鼠Swiss 3T3成纖維細胞的研究發現，Arp3蛋白和Arp2蛋白組成的複合體經螢光免疫顯示定位於片狀足(lamellipodia)結構中(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。Welch等人在一種能在宿主細胞質內直接移動的致病細菌(Listeria monocytogenes)中的研究表明，有活性的Arp2/3複合體可能作為肌動蛋白組裝時聚核作用的模板，促進肌動蛋白聚集(Nature 385265-269，1997).Arp3蛋白和肌動蛋白有著交聯作用，使得片狀足結構中的纖維有序地排列成網狀結構(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。
此外，片狀足伸出與神經細胞發育、生長錐形成和神經突觸的定向等過程均有緊密關聯(Cell Motil Cytoskeleton 37(1)54-71 1997；Perspect.Dev.Neurobiol.4(2-3)111-123，1996)，因此Arp3對神經系統的發育可能是必需的。另外，粘菌中的Arp3同源蛋白參與了線粒體在細胞內的運動和定位(FEBS Letters 360235-241，1995)，Arp3是否在哺乳動物細胞中也參與細胞內能量的分配過程還有待進一步的研究。
在附圖中，

圖1為本發明的人Arp3H與人Arp3(h-Arp3)的核酸序列同源比較圖。其中，相同的核苷酸用「|」標出。
圖2為本發明的人Arp3H與人Arp3(h-Arp3)的胺基酸序列同源比較圖。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用「|」標出，相似的胺基酸用「·」標出。相似的胺基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，比如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人Arp3H的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腦λgtl lcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物-A15′-CGGGGCCGAGCGCCGCGCG-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B15′-TGACACCATCGAACGACGCGTTC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、70℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最後72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片段為1269bp的目的片段。
2.PCR產物的測序將如上獲得的PCR擴增產物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1269bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位於29-1237位核苷酸。
根據得到的全長cDNA序列推導出人Arp3H的胺基酸序列，共402個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例2同源比較用本發明的人Arp3H的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+Swiss Prot+Spupdate+PIR資料庫中，用BLAST軟體進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現，本發明的人Arp3H與肌動蛋白相關蛋白家族成員顯示了較高的同源性，如用PCGENE軟體分析，它與人Arp3(gb|AF006083)在核酸水平上的同一性達到了75.7％(圖1)，在蛋白水平上的同一性達到了82.6％，並有5％的胺基酸相似(圖2)，因此z這表明本發明的人Arp3H是人Arp3的同源基因，並且屬於同一個Arp基因家族，並具有相同或相似類似的功能。
和Arp2相類似，Arp3也是和肌動蛋白同源程度較低、相關性較遠的Arp蛋白，它們並不組成肌動蛋白絲那樣的纖維結構(Proc.Natl.Acad.Sci.8980-83，1992).Arp3基因廣泛存在於真核生物中，在酵母中該基因的缺失是致死的(Curr.Opin.Cell Biol.830-37，1996)。
研究表明，Arp3蛋白和肌動蛋白有著相似的三維核心結構(L/M)(L/I/V/M)TE(G/A/P/Q)X(L/I/V/M/F/Y/W/H/Q)N(P/S/T/A/Q)X2N(K/R)[注該序列中X為任意胺基酸，「2」等數字為胺基酸數目，「(L/M)」表示從這2個胺基酸中任選一個胺基酸]。
在本發明的Arp3H蛋白中，相對應序列為SEQ ID NO.4中第92位至第104位胺基酸，即92M-T-E-P-P-L-N-T-P-E-N-R104。並且，本發明的Arp3H中存在結合ATP所需的全部胺基酸殘基，但是和蛋白間相互作用相關的蛋白表面的胺基酸殘基是各異的(Trends Cell Biol.6208-212，1996)。
研究已表明，Arp3在阿米巴蟲中是主要的細胞內蛋白，集中分布於富含肌動蛋白的皮質區(J.Cell.Biol.131(2)385-397，1995)。研究靜止或移動的鼠Swiss 3T3成纖維細胞發現，Arp3蛋白和Arp2蛋白組成的複合體經螢光免疫顯示定位於片狀足(lamellipodia)結構中，這與肌動蛋白絲不同(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。片狀足是真核細胞內由一層細胞質組成的非肌肉的基本運動細胞器，具有伸出活力(Symp.Soc.Exp.Biol.4757-71，1993)。Welch等人在一種能在宿主細胞質內直接移動的致病細菌(Listeria monocytogenes)中的研究表明，有活性的Arp2/3複合體可能作為肌動蛋白組裝時聚核作用的模板，促進肌動蛋白聚集。它們位於肌動蛋白絲靜止的一端，啟動肌動蛋白有方向的聚合(Nature 385265-269，1997)。Arp3蛋白和肌動蛋白有著交聯作用，很可能起到肌動蛋白絲端和複合體的連結作用並具有幫助肌動蛋白絲平行排列的功能，使得片狀足結構中的纖維有序地排列成網狀結構(J.Cell.Biol.138(2)375-384，1997)。有關實驗表明，片狀足伸出與神經細胞發育、生長錐形成和神經突觸的定向等過程均有緊密關聯(Cell MotilCytoskeleton 37(1)54-71，1997；Perspect.Dev.Neurobiol.4(2-3)111-123，1996)，因此Arp3對神經系統的發育可能是必需的。根據目前研究推測，本發明的Arp3H可能與神經系統的發育存在一定相關性。
此外，對粘菌中Arp3同源基因進行的螢光免疫實驗證明，該蛋白參與了線粒體在細胞內的運動和定位(FEBS Letter 360235-241，1995)。雖然，Arp3和Arp3H是否在哺乳動物細胞中也參與細胞內能量的分配過程還有待進一步的研究。但是，這些研究都暗示，Arp3和Arp3H的缺失或表達異常會導致疾患，甚至死亡。
本發明的人Arp3H除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人Arp3H還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人Arp3H蛋白的N端與人Arp3蛋白或粘菌的Arp3蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人Arp3H的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員，如人Arp3蛋白)。
例如，本發明人Arp3H核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人Arp3H的表達水平或者抑制人Arp3H的過度表達。本發明的人Arp3H蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因人Arp3H缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
實施例3人Arp3H在大腸桿菌中的表達編碼人Arp3H的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中得到的片段為模板進行擴增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCGTCGACATGGCAGGCTCCCTGCTCC-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalI限制性內切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人Arp3H編碼序列的19個核苷酸；3』寡核苷酸引物序列為5』-GTTCAAGCTTCTAGGACATGACTCCAAAG-3』(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和人Arp3H的編碼序列。
限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。抽提質粒，用BamHI酶切鑑定插入片段大小及方向，測序驗證結果表明人Arp3H的cDNA插入片段已正確裝入載體。
過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然後接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(「異丙基硫代-β-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人Arp3H。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人Arp3H。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小約為45KDa。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人Arp3H在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人Arp3H的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中得到的片段為模板進行擴增，以合成插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCAAGCTTATGGCAGGCTCCCTGCTCC-3′(SEQ ID NO.7)，該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人Arp3H編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5』-GTTCGAATTCCTAGGACATGACTCCAAAG-3』(SEQ ID NO.8)該引物含有EcoRI限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人Arp3H的編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(f1 ori)、一個病毒複製起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用HindIII、EcoRI消化pcDNA3載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，用PstI酶切鑑定插入片段大小及方向，測序驗證結果表明人Arp3H的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質粒轉染是採用脂轉染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小約為45KDa。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5製備抗體將實施例3和4獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱人Arp3H基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生沉澱。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海新黃浦復旦基因工程有限公司(ii)發明名稱人肌動蛋白相關蛋白基因、其編碼的多肽及製法和用途(iii)序列數目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度19鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CGGGGCCGAG CGCCGCGCG 19(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TGACACCATC GAACGACGCG TTC23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特徵(A)長度1269bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3CGGGGCCGAG CGCCGCGCGT TCCCGAGCAT GGCAGGCTCC CTGCTCCCTG CGTGGTGGAC 60TGTGGCACCG GCTATTGCCA TCAAAGAGTC AGCAAAGATA GTTGACCAAG CTCAAAGGAG 120AGTGTTGAGG GGAGTTGATG ACCTTAACTT TTTCATAGGA GATGAAGCCA TCGATAAACC 180TACATATGCT ACAAAGTGGC CGATACGACA TGGAATCATT GAAGACTGGG ATCTTATGGA 240AAGGTTCATG GAGCAAGTGG TTTTTAAATA TCTTCGAGCT GAACCTGAGG ACCATTATTT 300TTTAATGACA GAACCTCCAC TCAATACACC AGAAAACAGA GAGTATCTTG CAGAAATTAT 360GTTTGAATCA TTTAACGTAC CAGGACTCTA CATTGCAGTT CAGGCAGTGC TGGCCTTGGC 420CGCATCTTGG ACATCTCGAC AAGTGGGTGA ACGTACGTTA ACGGGGATAG TCATTGACAG 480CGGAGATGGA GTCACCCATG TTATCCCAGT TGGCCAAGAA GGTTATGTAA TTGGAAGCTG 540CATCAAACAC ATCCCGATTG CAGGTAGAGA TATTACGTAT TTCATTCAAC AGCTGCTAAG 600GGAGAGGGAG GTGGGAATCC CTCCTGAGCA GTCACTGGAG ACCGCAAAAG CCATTAAGGA 660GAAATACTGT TACATTTGCC CCGATATAGT CAAGGAATTT GCCAAGTATG ATGTGGATCC 720CCGGAAGTGG ATCAAACAGT ACACGGGTAT CAATGCGATC AACCAGAAGA AGTTTGTTAT 780AGACGTTGGT TACGAAAGAT TCCTGGGACC TGAAATATTC TTTCACCCGG AGTTTGCCAA 840CCCAGACTTT ATGGAGTCCA TCTCAGATGT TGTTGATGAA GTAATACAGA ACTGCCCCAT 900CGATGTGCGG CGCCCGTCGT ATAAGAATGT CGTACTCTCA GGAGGCTCCA CCATGTTCAG 960GGATTTCGGA CGCCGACTGC AGAGGGATTT GAAGAGAGTG GTGGATGCTA GGCTGAGGCT 1020CAGCGAGGAG CTCAGCGGCG GGAGGATCAA GCCGAAGCCT GTGGAGGTCC AGGGTGGTCA 1080CGCATTCACA TGCAGCGCTA CGCCGTGTGG TTCGGAGGCT CCATGCTTGG CCTCGACTCC 1140CGAGTTCTTT CAGGTCTGCC ACACCAAGAA GGACTATGGA AGGAGTACGG GCCCAGCATC 1200TTGCCGCCAC AACCCCGTCT TTGGAGTCAT GTCCTAGTGT CTGCCTGAAC GCGTCGTTCG 1260ATGGTGTCA 1269(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度402個胺基酸
(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ala Gly Ser Leu Leu Pro Ala Trp Trp Thr Val Ala Pro Ala 15Ile Ala Ile Lys Glu Ser Ala Lys Ile Val Asp Gln Ala Gln Arg 30Arg Val Leu Arg Gly Val Asp Asp Leu Asn Phe Phe Ile Gly Asp 45Glu Ala Ile Asp Lys Pro Thr Tyr Ala Thr Lys Trp Pro Ile Arg 60His Gly Ile Ile Glu Asp Trp Asp Leu Met Glu Arg Phe Met Glu 75Gln Val Val Phe Lys Tyr Leu Arg Ala Glu Pro Glu Asp His Tyr 90Phe Leu Met Thr Glu Pro Pro Leu Asn Thr Pro Glu Asn Arg Glu 105Tyr Leu Ala Glu Ile Met Phe Glu Ser Phe Asn Val Pro Gly Leu 120Tyr Ile Ala Val Gln Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Ser Trp Thr 135Ser Arg Gln Val Gly Glu Arg Thr Leu Thr Gly Ile Val Ile Asp 150Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Ile Pro Val Gly Gln Glu Gly 165Tyr Val Ile Gly Ser Cys Ile Lys His Ile Pro Ile Ala Gly Arg 180Asp Ile Thr Tyr Phe Ile Gln Gln Leu Leu Arg Glu Arg Glu Val 195Gly Ile Pro Pro Glu Gln Ser Leu Glu Thr Ala Lys Ala Ile Lys 210Glu Lys Tyr Cys Tyr Ile Cys Pro Asp Ile Val Lys Glu Phe Ala 225Lys Tyr Asp Val Asp Pro Arg Lys Trp Ile Lys Gln Tyr Thr Gly 240Ile Asn Ala Ile Asn Gln Lys Lys Phe Val Ile Asp Val Gly Tyr 255Glu Arg Phe Leu Gly Pro Glu Ile Phe Phe His Pro Glu Phe Ala 270Asn Pro Asp Phe Met Glu Ser Ile Ser Asp Val Val Asp Glu Val 285Ile Gln Asn Cys Pro Ile Asp Val Arg Arg Pro Ser Tyr Lys Asn 300Val Val Leu Ser Gly Gly Ser Thr Met Phe Arg Asp Phe Gly Arg 315Arg Leu Gln Arg Asp Leu Lys Arg Val Val Asp Ala Arg Leu Arg 330Leu Ser Glu Glu Leu Ser Gly Gly Arg Ile Lys Pro Lys Pro Val 345Glu Val Gln Gly Gly His Ala Phe Thr Cys Ser Ala Thr Pro Cys 260Gly Ser Glu Ala Pro Cys Leu Ala Ser Thr Pro Glu Phe Phe Gln 375Val Cys His Thr Lys Lys Asp Tyr Gly Arg Ser Thr Gly Pro Ala 390Ser Cys Arg His Asn Pro Val Phe Gly Val Met Ser 402(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGTCGAC ATGGCAGGCT CCCTGCTCC 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCAAGCTT CTAGGACATG ACTCCAAAG 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGGCAGGCT CCCTGCTCC 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGAATTC CTAGGACATG ACTCCAAAG 29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列。
4.一種分離的人Arp3H蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有人Arp3H蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有人Arp3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人Arp3H蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Arp3H蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Arp3H蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Arp3H蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸29-1237位。
12.一種能與權利要求4所述的人Arp3H蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特徵在於，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及了一種新的肌動蛋白相關蛋白基因家族的成員人Arp3H。本發明提供了該新肌動蛋白相關蛋白的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術生產所述的新的人肌動蛋白相關蛋白的方法。本發明還提供了這種新人肌動蛋白相關蛋白的應用。
文檔編號C07K14/435GK1252448SQ9812348
公開日2000年5月10日 申請日期1998年10月22日 優先權日1998年10月22日
發明者餘龍, 傅強, 張宏來, 屠強, 趙勇 申請人:上海新黃浦復旦基因工程有限公司