一種玉米黃質合成基因重組質粒及其製備方法和用途
2023-06-15 03:32:01 1
一種玉米黃質合成基因重組質粒及其製備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，其鹼基序列如SEQ?ID?NO:1所示。同時本發明還公開了pET-Zea的製備方法及其在檢測目標受體玉米黃質合成基因活性中的應用和應用方法。本發明所提供的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，在導入大腸桿菌BL21菌株後，成功地實現了玉米黃質在大腸桿菌細胞體內的積累，由此可準確快速構建玉米黃質生產菌株。本發明所提供的製備玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea的方法簡便、易操作、成本低。本發明方法可以通過酶切、連接，將目標受體中待檢測的基因序列替換重組表達質粒pET-Zea中的相關基因序列，然後通過檢測宿主細胞體內是否積累玉米黃質即可簡單、有效地對目標受體中待測基因功能進行檢測和驗證。
【專利說明】一種玉米黃質合成基因重組質粒及其製備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及重組質粒及其製備方法和用途，具體的說是一種玉米黃質合成基因重組質粒及其製備方法和用途。
【背景技術】
[0002]玉米黃質，亦稱玉米黃素(Zeaxanthin，3，3_ 二羥基-β -胡蘿蔔素)，脂溶性化合物，屬葉黃素類類胡蘿蔔素。近年來的藥理學和生理學研究發現玉米黃質具有極強抗氧化性，其在預防眼睛黃斑退化所致失明與老年性白內障、預防部分腫瘤的發生和發展、減少某些心血管病的危險發生方面具有顯著作用。作為三大主要糧食作物之一的玉米，其籽粒中玉米黃質含量豐富，通過基因工程育種，培育富含玉米黃質的鮮食玉米，可以進一步發揮其保健應用價值，具有較大的發展前景。目前，玉米規模化轉基因主要以愈傷組織為受體，其誘導和培養受玉米基因型和取材季節的限制很大，且培養、轉化、篩選和再生的周期較長，轉基因操作的規模一般較小，難以保證轉化成功。以莖尖生長點為受體的農桿菌介導的原位轉化法，不依賴於組織培養，受基因型限制小，操作簡單，實驗周期短，可以從絕大多數材料中獲得轉基因植株。但是，轉化效率還有待提高，而且所獲轉化體大多為嵌合體，後代分離鑑定較為困難，所以還需要進一步研究改進。近來通過構建玉米黃質生物代謝工程合成玉米黃質逐漸受到研究人員的青睞，但由於玉米黃質在微生物體內的合成步驟多且複雜，因此研製能夠高效表達玉米黃質多種合成酶的載體成為人們研究的熱點和難點。另外，研究人員對研發過程中目標受體玉米黃質合成代謝途徑中主要酶系的功能的檢測也存在很多困惑，如通過離體的生化反應或利用基因突變株進行功能互補的方法進行檢測， 其操作步驟比較繁瑣，並且效率也不高。因此如何獲得一種高效檢測目標受體玉米黃質合成基因活性的方法亦是本領域研究人員所關注的問題。
【發明內容】
[0003]本發明的目的之一就是提供一種高效表達玉米黃質多種合成基因的重組質粒，以期能夠準確、快速構建出玉米黃質生產菌株；本發明的目的之二就是提供該重組質粒的一種製備方法；本發明的目的之三就是提供一種該重組質粒的用途，即所述重組質粒在檢測玉米黃質合成主要相關基因的功能中的應用，更具體地說是所述重組質粒PET-Zea在檢測目標受體玉米黃質合成基因活性中的應用。
[0004]本發明的目的是按如下的技術方案實現的:
[0005]本發明所提供的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea,其攜帶有crtE基因、crtB基因、crtl基因、crtY基因、crtZ基因，該重組質粒的結構如圖1所示；
[0006]所述重組表達質粒是在表達載體pET_28a上依次連接有crtE基因、crtB基因、crtl基因、crtY基因、crtZ基因，其中表達載體pET_28a與crtE基因之間具有Nde I酶切位點，crtE基因與crtB基因之間具有Hpa I酶切位點，crtB基因與crtl基因之間具有Mfe I酶切位點，crtl基因與crtY基因之間具有Nhe I酶切位點，crtY基因與crtZ基因之間具有Aha III酶切位點，crtZ基因與表達載體pET_28a之間具有Not I酶切位點。
[0007]所述的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，其鹼基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]其中所述crtE基因、crtY基因、cr11基因、crtB基因、crtZ基因分別是成團泛菌Pantoea agglomerans的GGPP合成酶基因、番爺紅素環化酶基因、八氫番爺紅素脫氫酶基因、八氫番茄紅素合成酶基因和胡蘿蔔素羥化酶基因。
[0009]本發明所提供的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，在導入大腸桿菌BL21菌株後，成功地實現了玉米黃質在大腸桿菌細胞體內的積累，由此可準確、快速構建玉米黃質生產菌株。
[0010]本發明所提供的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea的製備方法，包括如下步驟:
[0011]I)基因擴增: [0012]提取Pantoea agglomerans ACCC10495 的基因組 DNA,米用 PCR 擴增 crtE、crtB、crtl、crtY、crtZ 基因編碼區，相應引物分別為 P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10:
[0013]所述Pl 的鹼基序列為 5』 -CAGCATATGATGGTGAGTGGCAGT-3』
[0014]所述P2 的鹼基序列為 5，-TTAATTGTTAACTCAGGCGATTTTCAT-3 』
[0015]所述P3 的鹼基序列為 5 』 -TTAATTGTTAACATGAGCCAACCGCCG-3 』
[0016]所述P4 的鹼基序列為 5，-GGGCCCCAATTGCTAAACGGGACGCTG-3 』
[0017]所述P5 的鹼基序列為 5，-GGGCCCCAATTGATGAAAAAAACCGTT-3 』
[0018]所述P6 的鹼基序列為 5，-GGAATTCGCTAGCGAATTTCAGGCTGGCGGTGG-3 』
[0019]所述P7 的鹼基序列為 5，-GGAATTCGCTAGCGTGAGGGATCTGATT-3 』
[0020]所述P8 的鹼基序列為 5』 -CCCTTTAAAGGGTCATCCTTTATCTCG-3』
[0021 ]所述 P9 的鹼基序列為 5 』 -ATTGCGGCCGCTTATTCGGGCGAAGA-3 』
[0022]所述PlO 的鹼基序列為 5』 -CCCTTTAAAGGGATGCTAGTAAATAGT-3』 ；
[0023]II)構建克隆質粒:
[0024]將crtE、crtB、crtl、crtY、crtZ的擴增產物分別進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然後分別回收924bp、930bp、1459bp、1161bp、531bp處的條帶，分別與克隆載體pMD18_T連接、轉化大腸桿菌DH5a，篩選出陽性克隆，發酵後提取得到pMD18-crtE、pMD18_crtB、pMD18-crt1、pMD18-crtY 和 pMD18_crtZ 克隆質粒；
[0025]III)構建重組表達質粒pET-Zea:
[0026]將所製備的克隆質粒分別進行雙酶切，驗證基因序列與載體連接的方向:pMD18-crtE 以 Hpa I 和 EcoR I 雙酶切;pMD18_crtB 以 Hpa I 和 EcoR I 雙酶切；pMD18-crtI以 Mfe I 和 EcoR I 雙酶切；pMD18-crtY 以 Nhe I 和 EcoR I 雙酶切；pMD18_crtZ 以 Aha III和EcoR I雙酶切，選取基因序列與pMD18-T反向連接的克隆質粒；
[0027]將篩選得到的質粒pMD18_crtE和pMD18_crtB經Hpa I和EcoR I雙酶切、連接得至Ij pMD18-crtEB ;將 pMD18_crtEB 和 pMD18_crtI 經 Mfe I 和 EcoR I 雙酶切、連接得到 pMD18-crtEBI ;將 pMD18_crtEBI 和 pMD18_crtY 經 Nhe I 和 EcoR I 雙酶切、連接得到pMD18-crtEBIY ;將 pMD18_crtEBIY 和 pMD18_crtZ 經 Aha III和 EcoR I 雙酶切、連接得到質粒 pMD18-crtEBIYZ ；[0028]將表達載體pET_28a經Sna I和Bgl II酶切，將切口補平、連接得載體pET-28a-SB ；
[0029]將質粒pMD18_crtEBIYZ和載體pET_28a_SB分別經Nde I和Not I雙酶切，酶切產物連接得到表達質粒pET-Zea。
[0030]本發明所提供的製備玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea的方法簡便、易操作、成本低。
[0031]本發明所述重組質粒可用於檢測玉米黃質合成主要相關基因的功能。更具體地址說是可用於檢測目標受體玉米黃質合成酶的活性。其中所述的玉米黃質合成主要相關基因是指crtE基因、crtB基因、crtl基因、crtY基因、crtZ基因。
[0032]本發明所提供的檢測目標受體玉米黃質合成基因活性的方法是:
[0033]將目標受體中待檢測的玉米黃質合成基因擴增；擴增產物與重組表達質粒PET-Zea按照下列方式進行比較；
[0034](a)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經Nde I和Hpa I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtE基因，其具有GGPP合成酶活性；
[0035](b)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經Hpa I和Mfe I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtB基因，其具有八氫番茄紅素合成酶活性；
[0036](C)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經Mfe I和Nhe I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtl基因，其具有八氫番茄紅素脫氫酶活性；
[0037](d)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經經Nhe I和Aha III雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtY基因，其具有番茄紅素環化酶活性
[0038](e)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經Aha III和Not I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，檢測到玉米黃質的吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtZ基因，具有胡蘿蔔素羥化酶活性。
[0039]本發明方法可以通過酶切、連接，將目標受體中待檢測的基因序列替換重組表達質粒pET-Zea中的相關基因序列，然後通過檢測宿主細胞體內是否積累玉米黃質即可簡單、有效地對目標受體中待測基因功能進行檢測和驗證。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是重組表達質粒pET-Zea圖譜。
[0041]圖2是crtE、crtl、crtY、crtZ、crtB基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。 [0042]圖 2 中:M1:DM5000marker;M2:DM2000marker;1:crtE;2:crtB;3:crtY;4:crtl;5:crtZ。
[0043]圖3是重組表達質粒pET-Zea雙酶切檢測瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
[0044]圖 3 中:M1: DM5000marker; M2: DM2000marker 1: Aha III^P Not I 雙酶切;2:Hpa I和Mfe I雙酶切；3:Nde I和Hpa I雙酶切；4:Mfe I和Nhe I雙酶切；5:Nhe I和AhaIII雙酶切。
[0045]圖4是pET_Zea/BL21重組大腸桿菌發酵液中玉米黃質的液相色譜圖。
[0046]圖5是玉米黃質標準品溶液的液相色譜圖。
[0047]圖6 是將 Pantoea ananatis MCCC1F01131 的 crtE 基因與質粒 pET-Zea 重組並轉入大腸桿菌後發酵液中玉米黃質的液相色譜圖。
[0048]圖7 是將 Pantoea ananatis MCCC1F01131 的 crtB 基因與質粒 pET-Zea 重組並轉入大腸桿菌後發酵液中玉米黃質的液相色譜圖。
[0049]圖8 是將 Pantoea ananatis MCCC1F01131 的 crtl 基因與質粒 pET-Zea 重組並轉入大腸桿菌後發酵液中玉米黃質的液相色譜圖。
[0050]圖9 是將 Pantoea ananatis MCCC1F01131 的 crtY 基因與質粒 pET-Zea 重組並轉入大腸桿菌後發酵液中玉米黃質的液相色譜圖。
[0051]圖 10 是將 Pan toea ananatis MCCC1F01131 的 crtZ 基因與質粒 pET-Zea 重組並轉入大腸桿菌後發酵液中玉米黃質的液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0052]實施例1:重組表達質粒的pET-Zea構建
[0053](I)基因擴增
[0054]米用酹仿抽提法提取Pantoea agglomerans ACCC10495 (購自中國農業微生物菌種保藏管理中心)的基因組DNA作為PCR擴增模板，以ExTaq DNA聚合酶(購自Takara)，相應引物(北京三博遠志合成)見表1，分別擴增crtE、crtB、crtl、crtY、crtZ基因編碼區。
[0055]擴增產物於1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2，然後分別回收924bp、930bp、1459bp、1161bp、531bp處的條帶得預期擴增產物。預期擴增產物分別與克隆載體pMD18_T(購自Takara)連接、轉化大腸桿菌DH5 α。挑取單菌落，以Μ13 Primer RV和M13 PrimerM4為引物對(購自Takara)進行陽性克隆檢測，篩選出陽性克隆質粒，並由北京三博遠志公司測序分析基因序列，各基因的胺基酸序列見SEQ ID N0:2~SEQ ID N0:6。
[0056]表1:擴增crtE、crtl、crtY、crtZ、crtB基因所需的引物序列信息
【權利要求】
1.一種玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea,其特徵在於所述重組質粒攜帶有crtE基因、crtB基因、crtl基因、crtY基因、crtZ基因，該重組質粒的結構如下:
2.根據權利要求1所述的玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea，其特徵在於所述重組表達質粒的鹼基序列如SEQ ID NO:1所示。
3.—種玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea的製備方法,其特徵包括如下步驟: I )基因擴增: 提取 Pantoea agglomerans ACCC10495 的基因組 DNA,米用 PCR 擴增 crtE、crtB、crt1、crtY、crtZ 基因編碼區，相應引物分別為 P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10: 所述 Pl 的鹼基序列為 5』 -CAGCATATGATGGTGAGTGGCAGT-3』 所述 P2 的鹼基序列為 5』 -TTAATTGTTAACTCAGGCGATTTTCAT-3』 所述 P3 的鹼基序列為 5』 -TTAATTGTTAACATGAGCCAACCGCCG-3』 所述 P4 的鹼基序列為 5』 -GGGCCCCAATTGCTAAACGGGACGCTG-3』 所述 P5 的鹼基序列為 5』 -GGGCCCCAATTGATGAAAAAAACCGTT-3』 所述 P6 的鹼基序列為 5』 -GGAATTCGCTAGCGAAITTCAGGCTGGCGGTGG-3』 所述 P7 的鹼基序列為 5』 -GGAATTCGCTAGCGTGAGGGATCTGATT-3』 所述 P8 的鹼基序列為 5』 -CCCTTTAAAGGGTCATCCTTTATCTCG-3』 所述 P9 的鹼基序列為 5』 -ATTGCGGCCGCTTATTCGGGCGAAGA-3』 所述 PlO 的鹼基序列為 5』 -CCCTTTAAAGGGATGCTAGTAAATAGT-3』 ； II)構建克隆質粒: 將crtE、crtB、crtl、crtY、crtZ的擴增產物分別進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,然後分別回收924bp、930bp、1459bp、1161bp、531bp處的條帶，分別與克隆載體pMD18_T連接、轉化大腸桿菌DH5 α，篩選出陽性克隆，發酵後提取得到pMD18-crtE、pMD18_crtB、pMD18_crt1、pMD18-crtY 和 pMD18_crtZ 克隆質粒； III)構建重組表達質粒pET-Zea: 將所製備的克隆質粒分別進行雙酶切，驗證基因序列與載體連接的方向:pMD18-CrtE以 Hpa I 和 EcoR I 雙酶切；pMD18_crtB 以 Hpa I 和 EcoR I 雙酶切；pMD18_crtI 以 Mfe I和 EcoR I 雙酶切；pMD18-crtY 以 Nhe I 和 EcoR I 雙酶切；pMD18-crtZ 以 Aha III和 EcoR I雙酶切，選取基因序列與PMD18-T反向連接的克隆質粒； 將篩選得到的質粒pMD18-crtE和pMD18_crtB經Hpa I和EcoR I雙酶切、連接得到 pMD18-crtEB ；將 pMD18_crtEB 和 pMD18_crtI 經 Mfe I 和 EcoR I 雙酶切、連接得到pMD18-crtEBI ；將 pMD18_crtEBI 和 pMD18_crtY 經 Nhe I 和 EcoR I 雙酶切、連接得到pMD18-crtEBIY ;將 pMD18_crtEBIY 和 pMD18_crtZ 經 Aha III和 EcoR I 雙酶切、連接得到質粒 pMD18-crtEBIYZ ； 將表達載體pET-28a經Sna I和Bgl II酶切，將切口補平、連接得載體pET_28a_SB ； 將質粒pMD18-crtEBIYZ和載體pET_28a_SB分別經Nde I和Not I雙酶切，酶切產物連接得到重組表達質粒pET-Zea。
4.玉米黃質合成基因重組表達質粒pET-Zea在檢測目標受體玉米黃質合成基因活性中的應用。
5.一種檢測目標受體玉米黃質合成基因活性的方法，其特徵是: 將目標受體中待檢測的玉米黃質合成基因擴增；擴增產物與重組表達質粒pET-Zea按照下列方式進行比較； (a)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經NdeI和Hpa I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收 峰即表明目標受體中攜帶有crtE基因，其具有GGPP合成酶活性； (b)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經HpaI和Mfe I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtB基因，其具有八氫番茄紅素合成酶活性； (C)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經Mfe I和Nhe I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtB基因，其具有八氫番茄紅素脫氫酶活性； (d)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經經Nhe I和AhaIII雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，如檢測到玉米黃質的特徵吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtY基因，其具有番茄紅素環化酶活性 Ce)擴增產物與重組表達質粒pET-Zea分別經Aha III和Not I雙酶切，酶切產物16°C連接過夜，連接產物轉 化大腸桿菌BL21，大腸桿菌BL21轉化體發酵後進行HPLC分析，檢測到玉米黃質的吸收峰即表明目標受體中攜帶有crtZ基因，具有胡蘿蔔素羥化酶活性。
【文檔編號】C12N15/66GK103740744SQ201410022263
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】張利平, 孔敏, 湯暉 申請人:河北大學