pH敏感的納米金星材料及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-10 09:32:21

pH敏感的納米金星材料及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種pH敏感的納米金星材料及其製備方法和在腫瘤光熱治療中的應用。該納米金星材料包括納米金星本體，納米金星本體的形狀為多枝狀星形，表面同時修飾氨基功能化和羥基功能化的巰基聚乙二醇。該金納米星材料在弱酸性環境中可被腫瘤細胞大量攝入，經近紅外雷射照射後，將吸收的光能轉化為熱能，使局部溫度升高，殺死腫瘤細胞，達到治療目的。而在弱鹼性環境中不被細胞攝入，在近紅外雷射照射下不會損傷細胞。該納米金星材料對環境pH敏感，可以通過腫瘤組織環境偏酸性的特點特異性靶向腫瘤細胞，在體外弱酸性環境下對宮頸癌細胞有顯著的抑制生長作用，將來還可應用於其它腫瘤的治療。
【專利說明】pH敏感的納米金星材料及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種納米金星材料，具體涉及一種pH敏感的納米金星材料及其製備 方法和應用。

【背景技術】
[0002] 醫用納米材料的腫瘤靶向運輸是納米醫學的重要問題。傳統的腫瘤靶向運輸利用 腫瘤表面受體識別技術，即在醫用納米材料上修飾可靶向腫瘤表面特異性高表達受體的配 體，以提高腫瘤細胞對醫用納米材料的吞噬量。例如：molotamedi實驗組在納米金棒表面 偶聯赫塞汀，可以顯著增加高表達人表皮生長因子受體-2 (HER-2)的乳腺癌細胞對納米金 棒的吞噬量，提高其光熱治療效果（Nano Lett2009, 9, 287)。但是這種方法在實際應用中 受到腫瘤表面受體表面異質性制約（僅有不足25 %的乳腺癌患者腫瘤細胞高表達HER-2)。 因此，需要開發一種不依賴抗原-抗體識別的靶向腫瘤的方法。腫瘤所處微環境與正常組 織微環境相比偏酸性，開發pH敏感的醫用納米材料可以提供新的腫瘤靶向方法。
[0003] 迄今為止尚無 pH敏感的納米金星材料的製備方法和光熱治療應用的相關文獻報 道。


【發明內容】

[0004] 發明目的：為了克服現有技術中存在的不足，本發明提出一種pH敏感的納米金星 材料，表面同時修飾氨基功能化和羧基功能化的巰基聚乙二醇，可以在生物環境中保持良 好的分散性，僅在酸性環境下可被細胞大量吞噬，且具有近紅外光吸收和光熱轉化功能。
[0005] 技術方案：為解決上述技術問題，本發明的一種pH敏感的納米金星材料，包括納 米金星本體，納米金星本體的形狀為多枝狀星形，納米金星本體表面修飾有氨基功能化和 羧基功能化的巰基聚乙二醇，納米金星材料的水合粒徑為70?120nm。
[0006] 進一步的，所述納米金星材料的水合粒徑為80?llOnm。
[0007] 作為優選，所述羧基功能化和氨基功能化的巰基聚乙二醇的摩爾比為1:3?5,在 該比例下所得pH敏感的納米金星材料pH響應範圍在6. 4?7. 4，具有腫瘤弱酸性微環境革巴 向性。
[0008] 進一步的，所述羧基功能化和氨基功能化的巰基聚乙二醇的摩爾比為1:4。
[0009] -種pH敏感的納米金星材料的製備方法，包括以下步驟：
[0010] 將球形納米金顆粒加入氯金酸溶液，在室溫攪拌條件下，向該混合液中同時加入 硝酸銀和抗壞血酸；球形納米金顆粒表面附有銀離子的部位比其它部位發生金還原的速度 更快，這些部位生長的速度更快，形成納米金星本體；加入氨基功能化和羧基功能化的巰基 聚乙二醇溶液，通過金-巰配位作用，在納米金星本體表面形成一層巰基聚乙二醇保護。 [0011] 由於該巰基聚乙二醇層末端同時含有氨基和羥基，在不同pH條件下質子化程度 不同，可使納米金星的zeta電位隨pH改變而變化，從而獲得pH敏感的納米金星。
[0012] 具體來說包括以下步驟：
[0013] (1)在20mL去離子水中加入500yL0.01mol/L氯金酸，在10?30°C攪拌條件下 加入200 μ L檸檬酸鈉穩定的球形納米金顆粒，並同時滴加80 μ L0. 01?0. 05mol/L硝酸銀 溶液和100 μ L0. lmol/L抗壞血酸溶液，反應lOmin後，加入40 μ L0. 1?0· 5mol/L氨基功 能化和羧基功能化的巰基聚乙二醇，反應1?12h ;
[0014] (2)將步驟（1)所得產物於室溫下離心、水洗、轉移至水中分散，形成pH敏感的納 米金星材料。
[0015] 作為優選，所述步驟（1)中攪拌條件為800?1200轉/分鐘；氨基功能化和羧基功 能化的巰基聚乙二醇的摩爾比為1:3?5 ;所述球形納米金顆粒的粒徑範圍是14?16nm。
[0016] 一種pH敏感的納米金星材料在腫瘤光熱治療中的應用，在可吸收近紅外光並轉 化熱能的納米金星材料表面，同時修飾氨基功能化和羧基功能化的巰基聚乙二醇，利用巰 基聚乙二醇的親水性保持納米金星材料在不同pH生物環境中的分散性，並利用氨基和羥 基在不同pH環境下質子化程度的變化，改變納米金星材料的zeta電位，以控制細胞對納米 金星材料的吞噬量，實現靶向腫瘤微酸性環境的光熱治療。
[0017] 在本發明中，pH敏感的納米金星材料在紫外-可見光吸收光譜峰值在620? 850nm之間，在近紅外雷射照射下溫度迅速升高。
[0018] pH敏感的納米金星材料，在pH小於或等於6. 4的情況下，zeta電位大於-10mV, 可被細胞大量吞噬，並在近紅外雷射照射下顯著抑制細胞生長；在pH大於或等於7. 4的情 況下，zeta電位小於-10mV，不易被細胞吞噬，在近紅外雷射照射不會顯著抑制細胞生長。
[0019] 有益效果：本發明的pH敏感的納米金星材料及其製備方法和應用，與現有技術相 t匕，具有以下優點：
[0020] 1、該納米金星材料的zeta電位隨pH改變而變化，在pH小於或等於6. 4時可被細 胞大量吞噬，在pH大於或等於7. 4時不易被細胞吞噬，這種性質可用於識別腫瘤特徵性微 酸環境；
[0021] 2、該納米金星材料具有多枝狀星形形貌和均一的尺寸；粒子之間無團聚，在 pH6. 4和ph7. 4的含血清培養基均具有良好的分散性能和生物相容性；
[0022] 3、該納米金星材料的紫外-可見光吸收光譜峰值在620?850nm之間，在近紅外 雷射照射下溫度迅速升高，在腫瘤光熱治療方面具有巨大的應用潛力；
[0023] 4、該納米金星材料的製備方法可操作性強，製備效率高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1本發明在實施例1的工藝條件下製得的pH敏感的納米金星的電子顯微鏡照 片；
[0025] 圖2本發明在實施例1的工藝條件下製得的pH敏感的納米金星的紫外-可見光 吸收光譜；
[0026] 圖3本發明在實施例1的工藝條件下製得的pH敏感的納米金星在2W/cm2的808nm 近紅外雷射照射下溫度變化曲線；
[0027] 圖4在實施例1的工藝條件下製得的pH敏感的納米金星在pH6. 4條件下對細胞 生長抑制作用；
[0028] 圖5在實施例1的工藝條件下製得的pH敏感的納米金星在pH7. 4條件下對細胞 生長抑制作用。

【具體實施方式】
[0029] 下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。
[0030] 實施例1 :水合粒徑為90nm左右的pH敏感的納米金星材料的製備和鑑定。
[0031] (1)在20mL去離子水中加入500yL0.01mol/L氯金酸，在25°C、1200轉每分鐘攪 拌條件下加入200 μ L檸檬酸鈉穩定的納米金顆粒，並同時滴加80 μ L0. 02mol/L硝酸銀溶 液和100 μ L0. lmol/L抗壞血酸溶液，反應lOmin後，加入40 μ L0. 2mol/L氨基功能化和羧 基功能化的巰基聚乙二醇混合液，反應3h。其中羧基功能化和氨基功能化的巰基聚乙二醇 的摩爾比為1:4 ;
[0032] (2)將步驟⑴所得產物室溫下離心、水洗、轉移至水中分散，形成pH敏感的納米 金星材料，如圖1所示；採用Brook haven zetaPALS粒度儀測量水合粒徑；
[0033] (3)測定步驟（2)所得的pH敏感的納米金星材料的紫外-可見光吸收光譜，如圖 2所示；
[0034] (4)將步驟（2)所得的pH敏感的納米金星材料置於2W/cm2的波長為808nm的近 紅外雷射照射下，記錄溫度變化如圖3所示。
[0035] 本實施例中得到的pH敏感的納米金星材料，如圖1所示其形貌為多枝狀星形，其 水合粒徑約90nm，如圖2所示紫外-可見光吸收光譜峰值在720nm左右，如圖3所示在近紅 外雷射照射下溫度迅速升高。
[0036] 實施例2 :水合粒徑為70nm左右的pH敏感的納米金星材料的製備和鑑定。
[0037] (1)在20mL去離子水中加入500μ L0. 01mol/L氯金酸，在10°C、800轉每分鐘攪拌 條件下加入200 μ L檸檬酸鈉穩定的納米金顆粒，並同時滴加80 μ L0. 01mol/L硝酸銀溶液 和100 μ L0. lmol/L抗壞血酸溶液，反應lOmin後，加入40 μ L0. 5mol/L氨基功能化和羧基 功能化的巰基聚乙二醇混合液，反應lh。其中羧基功能化和氨基功能化的巰基聚乙二醇的 摩爾比為1:3 ;
[0038] (2)將步驟⑴所得產物室溫下離心、水洗、轉移至水中分散，形成pH敏感的納米 金星材料；採用Brook haven zetaPALS粒度儀測量水合粒徑；
[0039] (3)測定步驟（2)所得的pH敏感的納米金星材料的紫外-可見光吸收光譜；
[0040] (4)將步驟（2)所得的pH敏感的納米金星材料置於2W/cm2的波長為808nm的近 紅外雷射照射下，記錄溫度變化。
[0041] 本實施例中得到的pH敏感的納米金星材料，其形貌為多枝狀星形，其水合粒徑約 70nm，紫外-可見光吸收光譜峰值在620nm左右，在近紅外雷射照射下溫度迅速升高。
[0042] 實施例3 :水合粒徑為120nm左右的pH敏感的納米金星材料的製備和鑑定。
[0043] (1)在20mL去離子水中加入500 μ L0. 01mol/L氯金酸，在30°C、1200轉每分鐘攪 拌條件下加入200 μ L檸檬酸鈉穩定的納米金顆粒，並同時滴加80 μ L0. 05mol/L硝酸銀溶 液和100 μ L0. lmol/L抗壞血酸溶液，反應lOmin後，加入40 μ L0. lmol/L氨基功能化和羧 基功能化的巰基聚乙二醇混合液，反應12h。其中羧基功能化和氨基功能化的巰基聚乙二醇 的摩爾比為1:5 ;
[0044] (2)將步驟⑴所得產物室溫下離心、水洗、轉移至水中分散，形成pH敏感的納米 金星材料；採用Brook haven zetaPALS粒度儀測量水合粒徑；
[0045] (3)測定步驟（2)所得的pH敏感的納米金星材料的紫外-可見光吸收光譜；
[0046] (4)將步驟⑵所得的pH敏感的納米金星材料置於2W/cm2的波長為808nm的近 紅外雷射照射下，記錄溫度變化。
[0047] 本實施例中得到的pH敏感的納米金星材料，其形貌為多枝狀星形，其水合粒徑約 120nm，紫外-可見光吸收光譜峰值在850nm左右，在近紅外雷射照射下溫度迅速升高。
[0048] 除上述實施例之外，納米金星材料的水合粒徑還可以為80nm、85nm、100nm、llOnm、 115nm等規格。
[0049] 實施例4 :pH6. 4條件下本發明zeta電位、細胞吞噬量及抑制腫瘤生長作用的鑑 定。
[0050] (1)配置ρΗ6· 4的0· IX PBS緩衝液：取lmL PBS，逐滴加入lmol/L HCl，pH穩定在 6. 4後，定容到10ml ;
[0051] (2) zeta電位測量：將pH敏感的納米金星材料溶於ρΗ6· 4的0· IX PBS緩衝液中， 取lmL樣品於比色皿中，採用Brook haven zetaPALS粒度儀進行測量，結果顯示zeta電位 為-5. 96±0· 77mV ;
[0052] (3)配置溶於pH6. 4DMEM培養基中的納米金星：無菌條件下，緩慢攪拌條件下將 DMEM培養基幹粉溶於950mL去離子水，加入4. 93ml7. 5% NaHC03溶液和44. 37ml5. 2% NaCl 溶液，定容至1L，加入100ml新鮮胎牛血清，即獲得pH6. 4的DMEM培養基。將pH敏感的納 米金星水溶液6000g離心10min後，棄上清，重新溶解於pH6. 4的DMEM培養基中，調整培養 基量，獲得濃度為80pM的溶於pH6. 4DMEM培養基中的納米金星。
[0053] (3)細胞培養：宮頸癌細胞株HeLa細胞置於10%胎牛血清的DMEM培養基、37°C、 5% C02飽和溫度細胞培養箱中培養。細胞長至約90%融合時，棄舊培養液，加入濃度為 80pM的溶於pH6. 4DMEM培養基中的納米金星，培養4h。
[0054] (4)測定納米金星細胞吞噬量：用胰酶消化與納米金星培養4h的細胞，重分散在 lml PBS液中。取0. 5ml細胞PBS懸液，1000轉每分鐘離心3min後，棄上清，加入200 μ L細 胞裂解液，4°C下超聲lmin後，12000轉每分鐘離心10min，取上清用考馬斯亮藍法測定蛋白 濃度。剩餘細胞PBS懸液加入鮮制王水消化後，用ICP測定金濃度。納米金星細胞吞噬量= 金濃度/蛋白濃度。測量得PH6. 4條件下，HeLa細胞納米金星細胞吞噬量為0. 103±0. 041 毫克金每克蛋白。
[0055] (5)細胞存活實驗：將對數生長期的HeLa細胞接種於96孔培養板，培養16h，待 細胞完全貼壁後，每孔加入濃度為80pM的溶於pH6. 4DMEM培養基中的納米金星，終體積為 200 μ L，設三個復孔，培養4h後，棄上清，PBS漂洗3遍後，加入新鮮培養基，用2W/cm2的 808nm近紅外雷射照射3min (暗對照組不照射雷射），之後每孔加入四甲基偶氮唑藍（5mg/ mL) 20 μ L，繼續培養4h，小心吸棄上清液，加二甲基亞碸（200 μ L/孔），震蕩10min後，檢 測A570光密度值。陰性對照組細胞不與納米金星共培養，不照射雷射。腫瘤細胞生存率= (實驗組或暗對照組平均光密度值/陰性對照組平均光密度值）*1〇〇%。結果如圖4所示。
[0056] 本實施例中pH敏感的納米金星材料在pH6. 4條件下，zeta電位為-5. 96±0. 77mV， 可被HeLa細胞大量吞噬，雷射照射後可以抑制腫瘤細胞生長（如圖4)。
[0057] 實施例5 :pH7. 4條件下本發明zeta電位、細胞吞噬量及抑制腫瘤生長作用的鑑 定。
[0058] (1)配置 ρΗ7· 4 的 0· IX PBS 緩衝液：取 lmL PBS，逐滴加入 lmol/L HC1 或 lmol/ LNaOH，pH穩定在7· 4後，定容到10ml。
[0059] (2) zeta電位測量：將pH敏感的納米金星材料溶於ρΗ7· 4的0· IX PBS緩衝液中， 取lmL樣品於比色皿中，採用Brook haven zetaPALS粒度儀進行測量，結果顯示zeta電位 為-13. 51±0· 87mV。
[0060] (3)配置溶於pH7. 4DMEM培養基中的納米金星：無菌條件下，緩慢攪拌條件下將 DMEM培養基幹粉溶於950mL去離子水，加入49. 3ml7. 5 % NaHC03溶液，定容至1L，加入 100ml新鮮胎牛血清，即獲得pH7. 4的DMEM培養基。將pH敏感的納米金星水溶液6000g離 心10min後，棄上清，重新溶解於pH7. 4的DMEM培養基中，調整培養基量，獲得濃度為80pM 的溶於pH7. 4DMEM培養基中的納米金星。
[0061] (3)細胞培養：宮頸癌細胞株HeLa細胞置於10%胎牛血清的DMEM培養基、37°C、 5% C02飽和溫度細胞培養箱中培養。細胞長至約90%融合時，棄舊培養液，加入濃度為 80pM的溶於pH7. 4DMEM培養基中的納米金星，培養4h。
[0062] (4)測定納米金星細胞吞噬量：用胰酶消化與納米金星培養4h的細胞，重分散在 lml PBS液中。取0.5ml細胞PBS懸液，1000轉每分鐘離心3min後，棄上清，加入200 μ L 細胞裂解液，4°C下超聲lmin後，12000轉每分鐘離心10min，取上清用BF液測定蛋白濃度。 剩餘細胞PBS懸液加入鮮制王水消化後，用ICP測定金濃度。納米金星細胞吞噬量=金濃 度/蛋白濃度。測量得PH7. 4條件下，HeLa細胞納米金星細胞吞噬量為0. 343±0. 024毫 克金每克蛋白。
[0063] (5)細胞存活實驗：將對數生長期的HeLa細胞接種於96孔培養板，培養16h，待 細胞完全貼壁後，每孔加入濃度為80pM的溶於pH7. 4DMEM培養基中的納米金星，終體積為 200 μ L，設三個復孔，培養4h後，棄上清，PBS漂洗3遍後，加入新鮮培養基，用2W/cm2的 808nm近紅外雷射照射3min (暗對照組不照射雷射），之後每孔加入四甲基偶氮唑藍（5mg/ mL) 20 μ L，繼續培養4h，小心吸棄上清液，加二甲基亞碸（200 μ L/孔），震蕩10min後，檢 測A570光密度值。陰性對照組細胞不與納米金星共培養，不照射雷射。腫瘤細胞生存率= (實驗組或暗對照組平均光密度值/陰性對照組平均光密度值）100%。結果如圖5所示。
[0064] 本實施例中pH敏感的納米金星材料在pH7. 4條件下，zeta電位 為-13. 51 ±0. 87mV，不易被HeLa細胞吞噬，雷射照射後不會抑制細胞生長，如圖5所示。 [0065] 本發明的金納米星材料在弱酸性環境中可被腫瘤細胞大量攝入，經近紅外雷射照 射後，將吸收的光能轉化為熱能，使局部溫度升高，殺死腫瘤細胞，達到治療目的。而在弱鹼 性環境中不被細胞攝入，在近紅外雷射照射下不會損傷細胞。該納米金星材料對環境pH敏 感，可以通過腫瘤組織環境偏酸性的特點特異性靶向腫瘤細胞，在體外弱酸性環境下對宮 頸癌細胞有顯著的抑制生長作用，將來還可應用於其它腫瘤的治療。
[〇〇66] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對於本【技術領域】的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1. 一種pH敏感的納米金星材料，其特徵在於：包括納米金星本體，所述納米金星本體 的形狀為多枝狀星形，納米金星本體表面修飾有氨基功能化和羧基功能化的巰基聚乙二 醇，納米金星材料的水合粒徑為70?120nm。
2. 根據權利要求1所述的pH敏感的納米金星材料，其特徵在於：所述納米金星材料的 水合粒徑為80?llOnm。
3. 根據權利要求1所述的pH敏感的納米金星材料，其特徵在於：所述羧基功能化和氨 基功能化的巰基聚乙二醇的摩爾比為1:3?5。
4. 根據權利要求3所述的pH敏感的納米金星材料，其特徵在於：所述羧基功能化和氨 基功能化的巰基聚乙二醇的摩爾比為1:4。
5. -種pH敏感的納米金星材料的製備方法，其特徵在於包括以下步驟： 將球形納米金顆粒加入氯金酸溶液，在室溫攪拌條件下，向該混合液中同時加入硝酸 銀和抗壞血酸； 球形納米金顆粒表面附有銀離子的部位比其它部位發生金還原的速度更快，這些部位 生長的速度更快，形成納米金星本體； 加入氨基功能化和羧基功能化的巰基聚乙二醇溶液，通過金-巰配位作用，在納米金 星本體表面形成一層巰基聚乙二醇保護層。
6. 根據權利要求5所述pH敏感的納米金星材料的製備方法，其特徵在於具體包括以下 步驟： (1) 在20mL去離子水中加入500 μ LO. Olmol/L氯金酸，在10?30°C攪拌條件下加入 200 μ L檸檬酸鈉穩定的球形納米金顆粒，並同時滴加80 μ L0. 01?0. 05mol/L硝酸銀溶液 和100 μ LO. lmol/L抗壞血酸溶液，反應lOmin後，加入40 μ L0. 1?0· 5mol/L氨基功能化 和羧基功能化的巰基聚乙二醇溶液，反應1?12h ; (2) 將步驟（1)所得產物離心、水洗、轉移至水中分散，形成pH敏感的納米金星材料。
7. 根據權利要求6所述pH敏感的納米金星材料的製備方法，其特徵在於：所述步驟 (1)中攪拌條件為800?1200轉/分鐘。
8. 根據權利要求6所述pH敏感的納米金星材料的製備方法，其特徵在於：所述步驟 (1)中，氨基功能化和羧基功能化的巰基聚乙二醇的摩爾比為1:3?5。
9. 根據權利要求5或6所述pH敏感的納米金星材料的製備方法，其特徵在於：所述球 形納米金顆粒的粒徑範圍是14?16nm。
10. -種pH敏感的納米金星材料在腫瘤光熱治療中的應用。
【文檔編號】A61K41/00GK104083760SQ201410310232
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月1日 優先權日:2014年7月1日
【發明者】王守巨, 盧光明, 滕兆剛, 劉瑩, 田迎, 孫晶, 唐玉霞, 盧楠, 謝媛, 趙豔娥, 曹新志 申請人:中國人民解放軍南京軍區南京總醫院