一種蜘蛛線粒體coiii基因全序列擴增引物及鑑定方法

2023-06-11 00:38:11 1

一種蜘蛛線粒體coiii基因全序列擴增引物及鑑定方法
【專利摘要】本發明公開了一種蜘蛛的線粒體 COIII 基因全序列擴增引物，並利用其全序列測序信息快速鑑定蜘蛛種類的方法，包括蜘蛛基因組總DNA的提取，COIII基因全序列擴增引物的設計，PCR擴增，測序以及基於 COIII 基因全序列進行蜘蛛種類的快速鑑定。採用本發明的通用擴增引物可以快速高效地擴增多種蜘蛛的線粒體COIII基因的全序列，為蜘蛛種類的快速鑑定，種群多樣性分析，種質資源保護利用等研究提供一種有力的工具，也為蜘蛛線粒體全基因組測序和不同分類階元系統進化的分析研究奠定基礎。
【專利說明】—種蜘蛛線粒體COI / /基因全序列擴增弓I物及鑑定方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種蜘蛛線粒體細胞色素C氧化酶3(cytochrome oxidase subunits 3; C0III)基因全序列的擴增引物及鑑別蜘蛛種類的方法。

【背景技術】
[0002]蜘蛛是一種重要的害蟲捕食性天敵，在害蟲綜合防治過程中具有重要的作用和地位。注意保護種庫，促進天敵群落重建，能有效的控制諸多農業害蟲，諸如飛蝨、葉蟬、螟蟲、棉蚜等的發生和危害。快速而準確的物種鑑定是蜘蛛保護和利用的研究的必要前提和基礎。然而，基於外觀形態及解剖特徵的傳統分類鑑定方法不僅耗時耗力，而且對鑑定人員的專業知識要求較高，常受主觀因素的幹擾，極易混淆出錯。另一方面，蜘蛛種類繁多，對其開展區系分類研究也極為重要，這對蜘蛛種質資源有效保護利用具有重要意義。
[0003]近年來，隨著分子生物學技術的快速發展，利用DNA序列(分子標記)對物種進行分類鑑定和系統發育分析已經成為一種簡單高效的方法。線粒體基因組DNA具有母系遺傳，拷貝數多，重組率低，進化速度較快等優點，所以成為物種鑑定和研究物種進化關係的理想選擇。包括蜘蛛在內的節肢動物線粒體基因組DNA—般由13個蛋白質基因，22個tRNA基因，2個rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)共37個編碼基因及一段非編碼區(控制區)組成。其中細胞色素C氧化酶亞基I (COI)基因已作為公認的分子標記，廣泛應用於節肢動物的群體遺傳學，系統發生學及保護生物學等研究領域。作為線粒體蛋白質編碼基因中3個編碼細胞色素C氧化酶複合體亞基基因之一，進化速率適中，亦可作為重要的遺傳分子標記。然而，目前針對種類繁多，具有重要利用價值的蜘蛛的線粒體基因的通用擴增引物則未曾報導。缺乏擴增效率高的通用引物嚴重阻礙了基因作為分子標記的應用，因此設計特異性擴增蜘蛛線粒體基因的通用引物，對利用分子方法快速鑑定蜘蛛物種和進行種類多樣性調查分析具有重要的意義，同時也為蜘蛛線粒體全基因組序列測定和系統進化分析奠定了基礎。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種一種蜘蛛線粒體基因全序列擴增引物及鑑定方法。
[0005]為實現本發明的目的，發明人提供以下技術方案:
本發明首先提供了一對蜘蛛線粒體基因全序列的通用擴增引物，這對引物是根據GenBank資料庫中已經公布的蜘蛛線粒體全基因組序列設計的，正向引物COII1-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物COII1-R如SEQ ID NO:2所示:
SEQ ID NO:1: 5' - ATGTTCTGAAATTTGTGGT -3/ ;
SEQ ID NO:2: 5' - TACTACATCTACAAAATGTC -3/。
[0006]利用上述一對蜘蛛線粒體⑶//堪因全序列擴增引物，PCR擴增測序後可實現對蜘蛛種類的快速鑑定。具體包括以下步驟:
(I)採用DNA抽提試劑盒提取蜘蛛的總基因組DNA。為避免汙染，捨去頭腹部，只從腿部提取DNA。
[0007](2)利用上述的一對引物，以抽提好的蜘蛛基因組為模板，進行PCR擴增和測序(結果見圖1)。PCR反應體系為50μ 1，其中:2μ I模板DNA (約20ng)，5 μ I 10XPCRbuffer, 4 μ I 2.5mM MgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.5 μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去離子水調至終體積50 μ I ;PCR反應條件為:95° C預變性3分鐘，94° C變性30秒，50° C退火30秒，72° C延伸2分鐘；35個循環後，72° C再延伸7分鐘。
[0008](3) PCR產物測序，對測序結果進行處理分析，截取仍基因全序列，使用ClustalX軟體進行DNA序列比對。達到物種鑑定的目的。
[0009]作為優選，本發明所述的鑑定方法中，其中步驟(I)所述的蜘蛛種類包括但不限於下述:擬水狼蛛{Pira ta subpira ticus)，三突花蛛{Ebrech tella tricuspida ta),橫紋金蛛(Arg1pe bruennichi)，維腹肖蛾(Jetragnatha maxi I 1sa)，華 _ 肖蛾{Tetragnatha,茶色新圓蛛(Afe1scofla iAeisi)、脈蝸蛛(fet/ic1sa venatrix) >黑色妮虎 iPlexippus ,大腹園蛛(Araneus Feflirico1SW1S)、貓跳蛛 iCarrhotusxantho gramma)。
[0010]本發明的優點是:
1.本發明提供的蜘蛛線粒體基因擴增引物，可以高效特異(條帶單一)的擴增多種蜘蛛的線粒體基因的全序列，而不僅僅是部分序列，能應用於蜘蛛不同分類階元系統進化和分類研究；
2.該方法所述的物種鑑定方法可以對多種蜘蛛進行準確鑑定，且不受發育階段和個體殘缺的限制，大大克服了形態鑑定的困難，縮短了鑑定的周期；該種蜘蛛的分子生物學鑑別方法對使用的儀器設備要求較低，且無需複雜的技術步驟和昂貴的試劑，一般的技術人員均可操作，比傳統的形態學鑑別更準確可靠。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發明中蜘蛛線粒體基因擴增引物用以擴增不同種類蜘蛛線粒體基因的電泳圖譜。
[0012]其中，Μ: DNA分子量標準(Mark IV) ; 1_10泳道依次為擬水狼蛛，三突花蛛，橫紋金蛛，錐腹肖蛾，華麗肖蛾，茶色新圓蛛、脈媧蛛、黑色蠅虎，大腹園蛛，貓跳蛛。

【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明實施例1:
(I)蜘蛛樣品的採集，鑑定及保存
實施例中所用蜘蛛種類均用陷阱法採自浙江省餘姚市或桐鄉縣農田。所採標本帶回實驗室進行信息登記，均用體視顯微鏡鑑定，以確定種類，蜘蛛標本用100%的酒精浸泡並保存於4° C冰箱備用。所採集的蜘蛛種類包括:擬水狼蛛，三花突蛛，橫紋金蛛，錐腹肖蛸，華麗肖蛸，茶色新圓蛛、脈媧蛛、黑色蠅虎，大腹園蛛、貓跳蛛。
[0014]蜘蛛基因組總DNA的提取
採用DNA抽提試劑盒提取不同種類蜘蛛的總基因組DNA。為避免汙染，捨去頭腹部，只從腿部提取DNA。DNA提取直接利用DNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)提取。提取的總基因組-20° C保存備用。
[0015]設計合成蜘蛛線粒體COIIim因全序列的擴增弓I物
登陸NCBI網站中的GenBank資料庫收索已公布的蜘蛛全線粒體基因組序列，經ClustalW軟體同源比對,找出基因上下遊保守的序列,利用Premier primer 5.0軟體設計出蜘蛛線粒體基因全序列擴增引物並送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。正向引物COII1-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物COII1-R如SEQ ID Ν0:2所示:
SEQ ID NO:1: 5' - ATGTTCTGAAATTTGTGGT -3/ ;
SEQ ID NO:2: 5' - TACTACATCTACAAAATGTC -3/。
[0016]PCR擴增線粒體COIII基因全序列和序列測定
利用上述的一對引物，以抽提好的蜘蛛基因組為模板，進行PCR擴增。其中，PCR反應體系為 50 μ 1，其中:2 μ I 模板 DNA (約 20ng)，5yl 10XPCR buffer, 4 μ I 2.5mMMgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.5 μ I 5U/μ I TaqDNA 聚合酶，加去離子水調至終體積50 μ I ;
PCR反應條件為:95° C預變性3分鐘，94° C變性30秒，50° C退火30秒，72° C延伸2分鐘；35個循環後，72° C再延伸7分鐘。
[0017]PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(結果見圖1)，擴增片段用凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)割膠回收。回收產物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。
[0018]依據OVJJ全序列信息快速確定蜘蛛的種類。
[0019]對上一步測序結果進行處理分析，截取COIII序列，用ClustalX軟體進行序列信息比對，進行物種鑑定。
[0020]蜘蛛的基因全序列如下:
擬水狼蛛的基因全序列如SEQ ID NO:3所示:
TTGGAAAAGCATTATCATCCTTTTCATATAGTAAATATATCACCTTGACCTTTAGTAACAGGATTTGGAGCATTATTTATAGTTATTGGAATAATTAAAATATTTATATTTTATGATGTTAGATTATTATTATTTTCTTTTGTTATATTATTTGTAGTAGCTATATTATGGTGACGAGATGTAATTCGAGAAAGAACCTTTCAGGGATTCCATTCAAGAATTGTATTAAAAGGGTTGATAGTAGGTATAGTTTTATTTATTGTAAGAGAAATTTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTTTGGGCCTTTTTTCATTCTAGACTAAGACCTACAATTGAATTAGGGTCTTATTGACCTCCAATGGGAATTCATACTTTTAATCCTTTTCAGGTTCCTTTATTAAATACTGTAATTTTATTGTCCTCAGGGGTAAGAGTAACTTGGGCTCATCAGCTTATTTTAAGGGAAGATTGATATGGAGTTGAGATTTCTTTAATAATAACTTGATTGTTAGGATTATATTTTTTAATATTACAAGGGTTTGAATATTATATATCTTCTGTTAGAATTAGAGATTCTGTTTTTGGATCTACTTTTTTTATGTCTACTGGTTTTCATGGATTTCATGTTATTGTTGGTACTTTATTTTTGTTTATTATTTGAATTCGTTTTTTAAATAGACATTTTTCTGGGGGGCATCACTTTGGATTTGAGGCTGCTGTATGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTTGTTTACTGATGGGGGTCTTAA ；
三花突蛛基因全序列如SEQ ID NO:4所示:
TTGGAAAGGCATTATCATCCTTTTCATATAGTTAATATATCCCCTTGACCTTTAATAAGAGGGTTTACAGCTTTGGCTGTGGTTTCAGGTATAATTAAAATGTTTGCGTATTATGATTTTAATTTATTTTTATTTTCTTTTTTTGTGTTAATTTTGGTAGCTTTTTCTTGATGGCGAGATGTAGTACGGGAAAGAACTTATCAGGGATTTCATTCTAGAATAGTGTTAAATGGTTTGATTTGGGGTATGATTTTGTTTATTGTTAGAGAGATTTTTTTTTTCTTTTCTTTTTTTTGGGGATTTTTTCATTCTAGATTGAGACCTTCTATTGAATTAGGATCTCAATGACCTCCTATAGGGGTTTTTTCTTTAAATCCTTTTCAAGTTCCTCTTTTAAATACTATTATTTTATTATCTTCGGGAGTTAGAGTTACTTGGTGCCATCAAATAATTTTAAATGAAAATTGAGATAGAGCTAAATCTTCTTTAATATTAACTTGAATTTTAGGAATTTATTTTTTAATACTTCAAGGATTTGAATATTATATAAGATCTTTTAGAATTAGAGATTCTAGATTTGGTTCAGTTTTTTTTATAGCTACAGGATTTCATGGTTTTCATGTAATTGTAGGTACTTTATTTTTATTTGTAATTTGAACACGATTTAATAGGGAGCATTTTTCTAGAAGTCATCATTTTGGTTTTGAAGCTGCTGCTTGGTATTTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTGTTTTCTGTAGTATATTGATGGGGAACT ；
橫紋金蛛Ο?//?基因全序列如SEQ ID NO:5所示:
TTGGAAAAGACATTTCATCCATTTCATATTGTAACAATTTCTCCGTGGCCTTTATTAATAGGGTTTGGAGTTATATCAGGAGTAATTGGAATAGTAAAAATATTTATATTTATAAAGTTTGATTTGTTATTTTTATCATTTTTAATTGCTGGAATAGTAGCGTTTGGATGATGACGGGATGTAGTTCGTGAAAGAACATTTCAAGGATATCATTCTAGAAATGTTTTGAGAGGATTAATGTTAGGAATAATTTTATTTATTGTAAGTGAGGTTTTCTTTTTTTTATCTTTTTTCTGGGCATTTTTTCATGCGAGATTAAATCCTACTGTAGAGTTAGGCGTAATATGACCTCCCCAGGGAATTAAGGCTTTTAGACCATTTCAAGTTCCCTTATTAAATACAGTGATTTTGTTAGCATCTGGTGTGTCAGTTACTTGAGCTCATCAATCTATTTTAAATGAAAATTGAAAAATAGCAAATTATTCTTTAATAATAACTTGAATATTAGGAATTTATTTTTTATCTTTACAAGGCTTTGAATATTATATAGCAGAATTTAGAATTTCTGATTCTGTATTTGGTTCCGTATTTTTTATAGCAACAGGGTTTCATGGATTTCATGTAATTGTAGGAAGGCTATTTTTATTTTTTATATGAGTTCGTTTAACAAAGAGACATTTTAGAAGAAGCCATCATTTTGGGTTTGAATGTGCTGCTTGATATTGACATTTTGTTGATGTAGTGTGATTATTTTTATTTTCAGTAGTTTATTGATGAGGGACTTAA ；
錐腹肖蛸基因全序列如SEQ ID NO:6所示:
TTGTCAAAAGTTTTTCATATATACCATATAGTAAATGTCTCTCCTTGACCATTTTTAATGGGGTCTGCTTCTTTAAGAGTAGTTCTAGGACTAGTTAAAATATTTGTTTTTTATAGATTTAAATCTTTTTTTTTCTCTCTTTTTTGTGTGGGTTTGGTGTTTCTTTTATGAGAAAAGGATGTGGTTCGAGAGAGAACTTTTCAAGGATTTCATTGTAGCCGAGTAGTAAGAGGATTAATTTATGGGATGATTTTATTTATTGTTAGAGAAGTATTTTTTTTTATTTCATTTTTCTGAACTTTTTTTCATTCTAGTTTAAACCCTGTAACAGATTTAGGGGCTGTTTGACCCCCCATAGGGATTTCCCCTTTAAATCCTTTTAGAGTTCCTTTGTTAAATACTGTAGTTTTATTAGCATCTGGGGTATCAATTACTTTATGTCATCAAGGTATTATCAATGAAGATTGAAAAAAAAGAATTTTGTCTTTAGGTATAACTTGGGGGTTAGGGTTATATTTTTTAATATTACAATATTTTGAGTATAAAATAGCAGGGTTTAGAATATCGGATTCTGTTTACGGATCTGTATTCTTTATATCAACAGGGTTTCATGGATTCCATGTATTAGTAGGAACTTTATTTTTAATAGTAATATTCTTTCGAATAATTAAGTCCCATTTTAGAATAAGACATCATTTAGGATTTGAATGTGCTGCTTGGTATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTTGTTTATTGATGGGGGTCTTAA ；
華麗肖蛸基因全序列如SEQ ID NO:7所示:
TTGATAAAAGTTTTTCATATATATCATATAGTTAATATATCCCCATGACCGTTTTTAATAGGATTCTCTGC
CTTAAGAGTGGTTTTAGGATTAGTAAAGATATTCATTTTTAAAAATATAATCTCTTTTATCGCCAGAATTTGTTGT
ACAATTTTTATTTTCTTTTTATGGGAAAAAGATGTGGTTCGAGAGAGAACTTTTCAAGGAAATCATTGTAGACGTGTTGTTGAAGGTTTAATTTATGGTATAATTTTATTTATTGTTAGAGAAATTTTTTTTTTTCTCTCTTTTTTTTGAGCCTTTTTCCACTCAAGTTTAAATCCCGTAGTAGATTTAGGTTCAGATTGACCTCCTATAGGAATTTCCCCTCTAAACCCCTTTAGAGTTCCTTTGTTAAATACTGTGGTATTATTAGCTTCAGGGGTATCTATTACTTTTTGTCATCAGAGAATTTTAAACCAGGATTGAAAGAAAATAGTAACTTCGTTAATAGTAACTTGGGCACTTGGTCTATATTTCTTAACTTTGCAATATTTTGAATATAAAATAGCAGGATTCAGAATTTCTGATTCTGTATTTGGATCTGTATTTTTTATATCAACTGGATTTCATGGTTTCCATGTAATGGTAGGAACGGGATTTTTATTAATTATATTTATTCGAGGAATTAAGAGACATTTCAGAAGAAGTCATCATTTAGGATTTGAATGTGCTGCTTGGTATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGGTTATTTCTATTTTCAGTAGTATATTGATGGGGTTGTTAATTTAAGTAA ；
茶色新圓蛛基因全序列如SEQ ID NO:8所示:
TTGGAAAAAACTTTTCATCCTTTTCATATTGTAACTATTTCACCATGGCCTTTATTAATAGGGTTTGGAGTTATATCTGGTGTTATTGGAATAATTAAGATATTTATATTTATAAAGTTTGATTTATTATCTATATCATTTTTAATTGTTGTTATAGTAGCTTTTGGGTGGTGACGAGATGTTGTTCGGGAAAGAACTTTTCAGGGATATCATTCAAGAAATGTATTAAGAGGATTAATACTAGGAATAATTTTATTCATTGTAAGAGAAGTATTTTTTTTTTTATCATTTTTTTGAGCTTTTTTTCATTCAAGATTAAATCCTACTGTAGAATTAGGTGTAATTTGACCTCCTCAGGGAATCAAGGCGTTTAGTCCATTTCAAATTCCTTTATTAAATACTATTATTTTATTAGCATCTGGGGTTTCTGTAACATGAGCTCATCAATCTATTTTAAATGAGAATTGAAAGATAGCAAATTATTCTTTAATATTAACGTGAATATTAGGCGTTTATTTTTTAGGGCTTCAAGGTTTCGAATATTATATAGCAGAATTCAGAATTTCTGATTCAGTTTTTGGATCAGTATTTTTTATAGCTACTGGATTTCATGGATTTCATGTAATTGTGGGAAGATTATTTTTATTTGTAATATGAATACGATTAACTAAGAGACATTTTAGAAGAAGTCATCACTTTGGATTTGAAAGAGCTGCTTGATACTGACATTTTGTAGATGTAGTATGGTTATTTTTATTTTCTGTAGTTTATTGATGAGGAACTTAA ；
脈媧蛛基因全序列如SEQ ID NO:9所示:
TTGGAAAAGCATTTTCATCCTTTTCATATAGTAAATATATCTCCTTGACCATTAGTAGTAGGATTTGGGGCTTTATTTATAGTAGTTGGAATAATTAAAATGTTTATATTTTATGATGTAAGTTTATTAATATTGTCTTTTGTAATATTATTTGTGGTAGCTATATTATGGTGGCGAGATGTAATTCGAGAAAGAACCTTTCAGGGATTCCACTCAAGAGTGGTATTGAAGGGATTGATAGTTGGTATAATTTTATTTATTGTAAGAGAAATTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTGAGCTTTTTTTCATTCTAGACTTAGTCCTACAATTGAATTAGGGTCTTATTGACCTCCTATAGGTATTCATCCTTTTAATCCTTTTCAAGTGCCTTTATTAAATACTGTAATTTTACTTTCTTCAGGTGTTAGAGTAACTTGGGCTCATCAGCTTATTTTAAGGGAAGATTGGTATGGGGTTAAGATTTCTTTAATGATGACTTGATTATTGGGATTATATTTTTTAATATTACAAGGATTTGAATATTATATATCTTCTACTGGAATTAGAGATTCTGTTTTTGGATCTACTTTTTTTATATCTACTGGTTTTCATGGGTTTCATGTTATTGTTGGTACTTTATTTTTATTTATTATTTGAATTCGTTTTTTAGGTGGGCATTTTTCTGGCAGACATCATTTTGGATTTGAAGCTGCGGTTTGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTTGTTTATTGGTGAGGTGGATAA ；
黑色蠅虎基因全序列如SEQ ID NO: 10所示:
TTGGAAAAGTTTTTTCATCCTTATCATATAGTAAATATGTCTCCTTGACCTTTAGTTGTTGGATTTGGGGC
TATAAGAGTAGTAATTGGACTAGTTAAAATGTTCTGTTTTTTTGAGACTGATTTATTGTTTGTATCTTTATATTTA
GTAGCAATAGTGGCTTTATTATGATGGCGGGATGTAATTCGGGAGAGTACATTTCAAGGTCTTCATTCTAGAATAGT
TTTAAGAGGATTAATAGTAGGGATAATCTTATTTATTGTAAGAGAGGTATTTTTTTTTATTTCTTTTTTTTGAGCTT
TTTTTCATTCTAGTTTAAGTCCAACTATTGAGCTAGGATCATTTTGGCCTCCATGTGGTATTTTCCCCTTTAATCCT
TTTCAAGTTCCTTTACTAAATACTGTAATTTTATTGGCTTCTGGGGTAACTGTAACTTGAGCCCATCAATTAATATTAAATAATAATTGAAATGGAGCTAAAAGAGCTTTATTAATAACTTGAATGTTGGGTTTATATTTTTTGATATTACAAGGATTTGAATATTATATAGCATCTTTTAGAATTTCAGATTCTGTATATGGATCAACATTTTTTATAGCTACGGGATTTCATGGATTTCATGTAATTGTTGGTACTTTATTTTTATTTTTTATTTGAACCCGATTAGTTAAAAATCAATTAACGAGAGGACATCATTTTGGGTTTGAAGCTGCTGCTTGATATTGACATTTTGTAGATGTGGTTTGGTTATTTTTGTTTTCTGTAGTTTATTGGTGAGGTACTTAA ；
大腹園蛛Ο?//?基因全序列如SEQ ID NO: 11所示:
TTGGAAAAGACTTTTCACCCATTTCATATTGTTACTATCTCTCCTTGACCTTTATTAATAGGATTTGGTGTAATATCTGGGGTGATTGGAATAATTAAAATGTTTATATTTATAAAGTTAGATTTATTATTTATATCTTTTTTTATCGCTGTTTTAGTAGCCATTGGTTGGTGACGAGATGTGGTTCGTGAAAGAACTTTTCAAGGTTTTCATTCTAGAAATGTTTTAAGTGGTTTAATATTAGGAATAATCTTGTTCATTGTAAGAGAAATTTTTTTTTTTTTATCTTTTTTTTGGGCCTTTTTTCACTCTAGGTTGAATCCCACAGTTGAGTTAGGTGTAGTATGACCCCCCGAGGGGATTAGTGCTTTTAGTCCGTTTCAAATTCCATTATTAAATACTGTAATTCTTTTGGCTTCGGGAGTTTCTGTTACTTGAGCTCATCAATCTATTTTGAATGAAAATTGAAAATTAGCTGGTCAATCTTTAATAATAACATGAATGCTAGGAATCTATTTTTTGGGTCTTCAAGGGTTTGAATATTATATAGCGGAGTTTAGAATTTCAGATTCAGTATTTGGATCTGTTTTTTTTATGGCTACTGGTTTTCATGGGTTTCATGTAATTGTTGGAAGATTATTTCTTATTGTAATATGATTACGATTGATCAAGGGTCATTTTAGGAGAAGACATCATTTTGGGTTTGAATGTGCAGCTTGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTCTCGGTAGTATATTGATGGGGAACTTGA ；
貓跳蛛基因全序列如SEQ ID NO: 12所示:
ATGGAAAAGTTTTTTCATCCTTATCATATAGTTAACATGTCTCCTTGACCTTTAATAGCAGGGTTTGGCGGATTAAGAGTGGTTATTGGAATAATTAATATATTTGTATTTTTTGATTTTACAATGTTATATACTTCTTTATTATTAATATTTGTTATTTCTTTTATGTGATGGCGGGATGTAATTCGGGAAAGAACGTATATAGGATATCATTCTAGAACAGTATTAAGTGGCTTAATATTAGGAATAATTTTATTTATTGTAAGAGAGGTATTTTTTTTTATTTCATTTTTTTGAGCTTTTTTCCATTCTAGATTGAGACCAACACTTGAATTAGGATCAGTATGACCTCCTTGCGGTATTTTGCCTTTTAATCCATTTCAGGTTCCACTTTTGAATACTGTTATCTTATTAGCTTCTGGAGTAACAGTTACATGAGCTCATCAATTTATATTAAATAATAATTGAGAAGGATCGAAGAGGGCTTTAATAATTACATGAATGTTAGGTTTATATTTTTTAATATTACAAGGGTTTGAATATTTTACAGCATCGTTTGGAATTTCTGATTCTGTATATGGATCAACTTTTTTTATAGCGACTGGATTTCATGGCTTTCATGTAATTGTTGGAACTTTATTTTTATTATTTATTTGAATGCGTTTAATTAAAAATCAATTAACAAATAGACATCATTTTGGGTTTGAAGCTGCTGCTTGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTGGTATATTGATGAGGAACTTAA。
【權利要求】
1.一種蜘蛛線粒體基因全序列擴增引物，其特徵在於:正向引物COII1-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物COII1-R如SEQ ID NO: 2所示，
SEQ ID NO:1: 5' - ATGTTCTGAAATTTGTGGT -3/ ;
SEQ ID NO:2: 5' - TACTACATCTACAAAATGTC -3/。
2.根據權利要求1所述的擴增引物，其特徵在於，所述擴增引物的設計方法為:登陸NCBI網站中的GenBank資料庫搜索已測定的蜘蛛線粒體全基因組序列，經ClustalX同源比對，在因上下遊找出保守的序列，利用Premier primer 5.0軟體設計出蜘蛛線粒體基因全序列擴增引物。
3.一種基於如權利要求1所述擴增引物的蜘蛛種類鑑定方法，其特徵在於該方法按以下述步驟進行:(I) DNA抽提試劑盒法提取待鑑定蜘蛛的總DNA ； (2)設計蜘蛛線粒體 基因全序列的擴增引物；(3)以蜘蛛總基因組DNA為模板，進行PCR擴增；(4)擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒法割膠回收擴增片段，測序；依據全序列信息快速確定蜘蛛的種類。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(I)中為避免蜘蛛腸道內容物的汙染，捨去頭腹部，只從其腿部提取DNA。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(I)中蜘蛛種類包括:擬水狼蛛，三突花蛛，橫紋金蛛，錐腹肖蛾，華麗肖蛾，茶色新圓蛛、脈媧蛛、黑色蠅虎，大腹園蛛，貓跳蛛。
6.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)的擴增引物為:正向引物COII1-F如SEQ NO:1所示，反向引物COII1-R如SEQ NO: 2所示。
7.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(3)的PCR反應體系為50μ1，其中:2 μ I 模板 DNA，5yl 1XPCR buffer, 4μ I 2.5 mM MgCl2,1 μ I 10 mM dNTPs，各1μ I 10 mM正、反向引物，0.5μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去離子水調至終體積50 μ I ;PCR反應條件如下:95° C預變性5分鐘，94° C變性30秒，50° C退火30秒，72° C延伸2分鐘；35個循環後，72° C再延伸7分鐘。
8.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中凝膠電泳採用1.5%瓊脂糖凝膠電泳；根據全基因序列鹼基信息進行蜘蛛種類鑑定。
【文檔編號】C12N15/11GK104450699SQ201410753854
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】王正亮, 俞曉平, 李超 申請人:中國計量學院