一株產α-酮戊二酸重組菌的構建及用其生產α-酮戊二酸的方法

2023-06-10 23:30:16

專利名稱：一株產α-酮戊二酸重組菌的構建及用其生產α-酮戊二酸的方法
一株產ot-酮戊二酸重組菌的構建及用其生產a-酮戊二酸的方法 技術領域一株產a-酮戊二酸重組菌的構建及用其生產a-酮戊二酸的方法，屬於輔因 子代謝調控策略優化發酵過程技術領域。本發明涉及一種分子手段過量表達 ^CS2提高胞內輔酶A的存在形式及其含量，從而調控碳代謝流實現oc-酮戊二酸 ((X-KG)過量積累的方法。通過研究輔因子(乙醯輔酶A)對代謝流流向及相應的代 謝通量的影響，達到oc-酮戊二酸的大量積累。
技術背景ot-酮戊二酸，又稱a-膠酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，是三羧酸 (TCA)循環中重要的中間產物之一，在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，也 是合成多種胺基酸、蛋白質的重要前體物質。其結構式為O Oa-酮戊二酸結構式a-酮戊二酸在醫藥、有機合成、營養強化劑等領域有著重要的應用前景， 目前主要應用領域為作為運動營養飲料的成分；有機中間體；生化試劑和測 肝功能的配套試劑；體格增強補劑；降低術後患者和長期病人的機體損耗；在 腦部作為酪氨酸和穀氨酸的前體；同時研究還表明，a-酮戊二酸具有抗氰作用， 與亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉配合使用可提高抗氰能力，且有抗驚厥作用。a-酮戊 二酸目前主要消費於醫療機構，用來診斷和對神經疾病進行治療。輔因子工程所涉及到的輔因子主要有ATP/ADP/AMP、 NADH/NAD+、 NADPH/NADP+、輔酶A及其衍生物、維生素和微量元素。目前研究主要集中 在調節ATP/ADP/AMP、 NADH/NAD+、 NADPH/NADP+和輔酶A及其衍生物等 輔因子在細胞內的形式和含量對代謝途徑及代謝流量的影響。因此，對輔酶A 如何影響工業微生物中碳代謝和碳代謝流流向分布的研究思路符合國內外研究 的主流方向。 發明內容本發明的目的是通過過量表達乙醯輔酶A合成酶基因，改變胞內輔因子之 一——輔酶A的存在形式和濃度，研究其在細胞中控制代謝流方向和流量分配 的作用機制、物質流和輔因子流的變化規律。提供一種輔因子調控碳代謝流實現a-酮戊二酸(oc-KG)過量積累的方法。本發明的技術方案 一株產OC-酮戊二酸重組菌，其分類命名為光滑球擬酵母7brw/o/w^ g/Wrato WSH-IP303 ACS 2-1 ，已保藏於中國典型培養物保藏中心， 保藏編號CCTCCNO: M 208021。所述的光滑球擬酵母7bra/o戸/s g/a6rato CCTCC NO: M 208021的構建方 法，通過過量表達乙醯輔酶A合成酶的手段，根據NCBI網站發表的釀酒酵母 S288C的乙醯輔酶A合成酶基因的序列，設計一對引物S: 5 ，國ggATTggAATTCCgCggTTAgTgATTgTTA丁AC隱3 ， A: 5'-gTTAgCggCCgCTTTCCTAgCTgACCAgTAAAA-3' 用於從釀酒酵母總DNA中擴增JC^基因，然後將其插入穿梭質粒pYES2的 04"-promoter後的多克隆位點中，得到表達質粒pYES2-ACS2，轉化7bnJop^ g/Wrato WSH-IP303的尿嘧啶缺陷型菌株，篩選獲得重組菌WSH-IP303 ACS2-1， 艮卩CCTCCNO: M 208021。一種a-酮戊二酸的生產方法，採用CCTCCNO: M208021為出發菌株，經 種子培養和液體發酵生產a-酮戊二酸；種子培養種子培養基以g/L計葡萄糖30，蛋白腖10，硫酸銨10，磷酸 二氫鉀l，七水硫酸鎂0.5， pH5.5，自來水定容至1L;培養條件從新鮮斜面 上接一環菌入種子培養基，500 mL錐形瓶中種子培養基為50 mL，溫度為 28-30°C，轉速200r/min，培養時間為30-32 h;液體發酵培養發酵培養基以g/L計葡萄糖100-120，氯化銨7，磷酸二 氫鉀5，七水硫酸鎂0.8，乙酸鈉4-6，碳酸鈣40-60，微量元素液10mL，維生 素液10mL;培養條件10M接種量(v/v)將種子液接種於發酵培養基，搖瓶發 酵500mL錐形瓶中發酵培養基為50mL，溫度為28-3(TC，轉速200r/min， 發酵時間為48 h-72 h;所述微量元素液CaCl2'2H20 2 g， FeS04 '7H20 2 g， ZnCl2 0.5 g， MnCl2. 4H20 12 g， CuS04.5H20 0.05 g， 2 mol/L HC1溶解後定容至1 L; 所述維生素液煙酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核 黃素10mg，自來水定容至1L。所生產的a-酮戊二酸產量達到18.7 g/L。以下是本發明技術方案的詳細描述。目的基因^CS2擴增與表達質粒的構建以Sacc/zaramycas ce^Ww'ae全基因組序列為模板，PCR擴增得到與預期大 小相符的^CS2目的片段(2Kbp)。將其克隆入質粒pYES2，得到^GS2基因表達 質粒pYES2-ACS2，構建好的重組質粒pYES2-ACS2經酶切分析，並進行DNA 測序證明。5V2aM單酶切得到大小為1671bp和6431bp的兩條條帶，克隆的JCS2 基因與預期結果一致，表明重組質粒構建正確。過量表達^GS2的ronz/op* g/Wrato重組菌的篩選將連接好的大小為1000 bp的左右臂片段電轉化7bra/opwi g/a6rato WSH-IP303感受態細胞，將能在FOASM平板生長的菌落在SM、 MM平板上劃 線分離，篩選得到在SM上生長良好而不在MM平板生長的轉化子即為尿嘧啶 營養缺陷型菌株rora/o/w^ g/a6rato Aura3。將重組質粒pYES2-ACS2電轉化 7bra/o戸&g/a6ratoAura3感受態細胞。將在含有尿嘧啶的MM平板上篩選到陽 性重組菌株，挑取陽性重組子若干進行菌落PCR，得到2kb大小的片段。所得 重組菌命名為Tbrw/o/w/s g/Wrato WSH-IP303 ACS2-1 ，即CCTCC NO: M 208021 。 該菌在以葡萄糖為碳源的培養基上生長時，JCS2酶活為1.20 U/mg protein—1 ，是 出發菌株ronJo/w/s g/a6rato WSH-IP303的9.2倍。微生物菌株的種子培養與發酵種子培養基(g/L):葡萄糖30g，蛋白腖10g，硫酸銨10，磷酸二氫鉀lg，七水硫酸鎂0.5g，瓊脂20g(斜面用)，pH5.5，自來水定容至1L。發酵培養基(g/L):葡萄糖100-120 g，氯化銨7g，磷酸二氫鉀5g，七水硫 酸鎂0.8g，乙酸鈉4-6g/L，碳酸鈣40-60 g(搖瓶時添加)，微量元素液10mL， 維生素液10mL， pH5.0,自來水定容至1L。微量元素液CaCl2'2H20 2 g， FeS04 .7H20 2 g， ZnCl2 0.5 g， MnCl2 .4H20 12 g， CuS04.5H20 0.05 g， 2 mol/L HCl 溶解後定容至1L。維生素液煙酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40 mg， 生物素4mg，核黃素10mg，自來水定容至1L。種子培養基和發酵培養基的滅菌溫度為115-121 °C， 15min。維生素等熱敏 性材料配製後0.2 pm膜濾除菌，接種前加入。將實驗菌株接種到種子培養基中，500 mL搖瓶裝液50 mL，於30 °C ， 200 rpm 條件下培養20-24 h。按10 %的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，30 °C， 200 rpm條件 下培養48-72 h。細胞乾重的測定取一定量的菌懸液置於10mL容量瓶中，加2mL鹽酸 溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10 mL，搖勻，用UV 7500型可 見分光光度計，於660nm處比色測OD值，用細胞乾重標準曲線算得細胞乾重。 丙酮酸(pyr)和a-KG濃度的測定高效液相色譜(HPLC)。 儀器Agilentll00高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、視差折光檢測器 和工作站)。色譜條件色譜柱Agilent ZORBAXSB-Aq柱，5 pm， 4.6 mm x250 mm; 流動相甲液取磷酸16.6mL，加水至1L;乙液取磷酸氫二鈉71.63 g，加 水至1L;混合比例甲液72.5mL，乙液27.5mL，混和搖勻；99%上述溶液加 1%乙腈為最終流動相。流速lmL/min，柱溫28 。C，進樣量5 pL，紫外檢測器波長210 nm。樣品製備500 pL發酵液在10000 rpm下離心10min，取上清液移入試管 中以備測a-KG。測a-KG時，取100 上清液移入5 mL容量瓶中，去離子水 定容至刻線，經0.45 pm濾膜過濾後，濾液供液相色譜分析用。本發明的有益效果本發明的特點是以高產光滑球擬酵母(7bnz/o戸^ g/"6rato) WSH-IP303為出發菌，利用分子手段構建了一株過量表達^GS7的重 組菌g/"6rato WSH-IP303 ACS2國1 ， g卩CCTCC NO: M 208021 ，通過 輔因子角度調控工業微生物中碳代謝和碳代謝流流向分布，使碳代謝流從積累 丙酮酸轉向大量積累a-KG，其中丙酮酸節點從35.6 g/L下降到23.6 g/L ， a-KG 節點從4.5 g/L提高到18.7 g/L。這一調節微生物細胞中關鍵輔因子的濃度，促 進流向目標代謝產物的代謝流的最大化和快速化，實現代謝產物過量積累的策 略，為工業生物技術特別是發酵過程優化提供了新的技術思路。與出發菌株ronz/o/w^ g/a6rato WSH-IP303相比，重組菌7bnz/o;w^ g/Wrato WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO: M 208021: (l)能以乙酸為唯一碳源在胞內積 累0.94 mM/ g DCW的乙醯輔酶A; (2)以葡萄糖為唯一碳源時胞內乙醯輔酶A 濃度、a-酮戊二酸產量和a.KG/Cpyr是出發菌株WSH-IP303的3.22、 2.05和2.52 倍；(3)在葡萄糖培養基中添加4g/L乙酸，導致乙醯輔酶A濃度、oc-酮戊二酸 產量和Ca-Ktj/Cpyr是出發菌株WSH-IP303的4.55、 2.47和3.75倍，a-酮戊二酸 濃度達到17.8 g/L。結果表明，提高細胞內乙醯輔酶A水平能將碳代謝流最大化、 快速化地導向目標代謝產物。 生物材料樣品保藏一株產a-酮戊二酸重組菌，其分類命名為光滑球擬酵母7bw/o;^^ g/Wrato WSH-IP303 ACS 2-1，已保藏於中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏 日期2008年1月27日，保藏編號CCTCC NO: M 208021。


圖1重組質粒酶切鑑定2尿嘧啶缺陷型平板篩選結果圖3 rorw/op^g/a6rato WSH-IP303 ACS2-1菌落PCR電泳圖具體實施方式
實施例1重組菌的構建及鑑定以^cc/zaram少c^ caeWw'ae全基因組序列為模板，PCR擴增得到與預期大 小相符的^CS2目的片段(2Kbp)。將其克隆入質粒pYES2，得到^CS2基因表達 質粒pYES2-ACS2，構建好的重組質粒pYES2-ACS2經酶切分析，並進行DNA 測序證明。5Vw萬I單酶切得到大小為1671bp和6431bp的兩條條帶(圖1),克隆 的^CS2基因與預期結果一致，表明重組質粒構建正確。將連接好的大小為1000bp的光滑球擬酵母t/W3基因的左右臂片段電轉化7bn/fopw、 g/Wrato WSH-IP303感受態細胞，將能在FOASM平板生長的菌落在SM、 MM平板上劃 線分離，篩選得到在SM上生長良好而不在MM平板生長的轉化子即為尿嘧啶 營養缺陷型菌株rora/o/ w^ g/Wrato Aura3 (圖2)。將重組質粒pYES2-ACS2電 轉化7bra/o戸^ g/Wrato Aura3感受態細胞。將在含有尿嘧啶的MM平板上篩 選到陽性重組菌株，挑取陽性重組子若干進行菌落PCR，得到2Kbp大小的片 段(圖3)。所得重組菌命名為7: g/"6rato WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO: M 208021。該菌在以葡萄糖為碳源的培養基上生長時，^GS2酶活為1.20 U/mg protein—1 ，是出發菌株的9.2倍。其中基本培養基MM(g/L):葡萄糖30，蛋白腖10，磷酸二氫鉀l， MgSO47H2O0.5， (NH4)2SO410，維生素液10mL，微量元素液10mL，固體培養基添加瓊脂20。 補充培養基SM(g/L): MM+60尿嘧啶，固體培養基添加瓊脂20。 選擇性培養基FOASM(g/L): SM+5-FOA (5-氟乳清酸)500。 完全培養基CM(g/L):葡萄糖20，蛋白腖20，酵母膏10，固體培養基添加瓊脂20。 實施例2乙酸為唯一碳源時重組菌與原菌發酵特性比較 在以乙酸為唯一碳源時重組菌7:g/Wrato WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO: M208021和出發菌株WSH-IP303均不利用乙酸合成丙酮酸，但對於重組菌，卻 能分泌5.4 mM (0.8 g/L)的a-酮戊二酸；重組菌73 WSH-IP303 ACS2-1CCTCC NO: M 208021能以乙酸為唯一碳源在胞內積累0.94 mM/ g DCW的乙 醯輔酶A，而出發菌株WSH-IP303卻不能利用乙酸合成乙醯輔酶A。實施例3添加不同濃度乙酸對胞內乙醯輔酶A含量及a-KG產量的影響 在發酵液中添加乙酸鈉0g/L、 4g/L、 6g/L、 8g/L時，重組菌7: g/Wrato WSH-IP303 ACS2-1 CCTCCNO: M 208021和出發菌株WSH-IP303的代謝特性 不同(1)以葡萄糖為唯一碳源時，儘管重組菌的丙酮酸產量僅為出發菌株的 80%，但a-KG產量和Ca《ci/Cpyr值比菌株WSH-IP303分別高105%和152%; (2) 在葡萄糖培養基中添加4 g/L乙酸，重組菌株7: g/a6rato WSH-IP303 ACS2畫1 CCTCCNO: M 208021的丙酮酸產量、a-KG產量和Ca.K(j/Cpyr值分別是出發菌 株的0.66、 2.47和3.75倍；(3)與以葡萄糖為唯一碳源比較，添加4 g/L乙酸則 使重組菌7: g/a6rato WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO: M 208021的a-KG產量和 Ca.KG/CpyJ直分別提高27.1%和56.2%。但乙酸的添加並不改變出發菌株的代謝特 性。進一步對胞內輔酶A的考察結果:(1)葡萄糖為唯一碳源時重組菌7:g/Wrato WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NO: M 208021中乙醯輔酶A的濃度是出發菌株 WSH-IP303的3.22倍。(2)添加4 g/L乙酸並不增加出發菌株WSH-IP303胞內 乙醯輔酶A濃度，但使重組菌WSH-IP303ACS2-1 CCTCC NO: M 208021乙醯 輔酶A濃度增加到13.07 mM/gDCW，是出發菌株WSH-IP303的4.55倍。
權利要求
1、一株產α-酮戊二酸重組菌，其分類命名為光滑球擬酵母Torulopsisglabrata WSH-IP303 ACS 2-1，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM 208021。
2、 一株權利要求1所述的光滑球擬酵母ronz/op^g/"6ratoCCTCCNO: M 208021的構建方法，其特徵是通過過量表達乙醯輔酶A合成酶的手段，根據 NCBI網站發表的釀酒酵母S288C的乙醯輔酶A合成酶基因的序列，設計一對 引物S: 5 ，-ggATTggAATTCCgCggTTAgTgATTgTTATAC畫3, A: 5，-gTTAgCggCCgCTTTCCTAgCTgACCAgTAAAA-3' 用於從釀酒酵母總DNA中擴增JCS2基因，然後將其插入穿梭質粒pYES2的 04ZJ-promoter後的多克隆位點中，得到表達質粒pYES2-ACS2，轉化7brw/op^ g/Wrato WSH-IP303的尿嘧澱缺陷型菌株，篩選獲得重組菌WSH-IP303 ACS 2-1，即CCTCCNO: M 208021。
3、 一種a-酮戊二酸的生產方法，其特徵是採用CTCC NO: M208021為出 發菌株，經種子培養和液體發酵生產a-酮戊二酸；種子培養種子培養基以g/L計葡萄糖30，蛋白腖10，硫酸銨10，磷酸 二氫鉀l,七水硫酸鎂0.5， pH5.5，自來水定容至1L;培養條件從新鮮斜面 上接一環菌入種子培養基，500 mL錐形瓶中種子培養基為50 mL，溫度為 28-30°C，轉速200r/min，培養時間為30-32 h;液體發酵培養發酵培養基以g/L計葡萄糖100-120，氯化銨7，磷酸二 氫鉀5，七水硫酸鎂0.8，乙酸鈉4-6，碳酸鈣40-60，微量元素液10mL，維生 素液10mL;培養條件10。/。接種量(v/v)將種子液接種於發酵培養基，搖瓶發 酵500mL錐形瓶中發酵培養基為50mL，溫度為28-30'C,轉速200 r/min， 發酵時間為48h-72h;所述微量元素液CaCl2'2H20 2 g， FeS04'7H20 2 g， ZnCl20.5g， MnCl2'4H20 12g， CuS04'5H20 0.05 g， 2 mol/L HC1溶解後定容至1 L;所述維生素液煙酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40 mg，生物素4 mg， 核黃素10mg，自來水定容至1L。
4、 根據權利要求3所述的生產方法，其特徵是所生產的a-酮戊二酸產量達 至U 18.7 g/L。
全文摘要
一株產α-酮戊二酸重組菌的構建及用其生產α-酮戊二酸的方法，屬於輔因子代謝調控策略優化發酵過程技術領域。本發明採用分子手段，將來源於釀酒酵母中編碼乙醯輔酶A合成酶ACS2基因過量表達於發酵法生產丙酮酸的工業菌株Torulopsis glabrata WSH-IP303中，獲得了一株乙醯輔酶A合成酶過量表達的重組菌WSH-IP303 ACS2-1 CCTCC NOM 208021。通過研究輔因子乙醯輔酶A對代謝流流向及相應的代謝通量的影響，達到α-酮戊二酸的大量積累。過量表達ACS2提高胞內輔酶A的存在形式及其含量，從而調控碳代謝流實現α-酮戊二酸過量積累。結果表明，提高細胞內乙醯輔酶A水平能將碳代謝流最大化、快速化地導向目標代謝產物。
文檔編號C12N15/81GK101245323SQ200810019989
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月18日 優先權日2008年3月18日
發明者劉立明, 堵國成, 楠 梁, 堅 陳 申請人:江南大學