草魚呼腸孤病毒SYBRGreenI實時螢光定量PCR檢測方法

2023-06-10 13:26:41 4

專利名稱：草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測方法
技術領域：
本發明涉及到生物醫藥體外分子診斷技術領域，特別涉及到草魚呼腸孤病毒SYBR GreenI實時螢光定量PCR檢測方法。
背景技術：
草魚出血病(Hemorrhagedisease of grasscarp)是感染草魚的一種嚴重的傳染 性疾病。流行季節長，發病率和死亡率均較高，往往造成大批草魚魚苗死亡；1年足齡青魚 也受害，2齡以上草魚有時也患此病。草魚出血病的病原出於草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reoviry s, GCRV)，是呼腸孤病毒科、水生呼腸孤病毒屬的病毒中毒力最強的病毒。草魚呼 腸孤病毒基因組由11條分節段dsRNA組成，總分子量為15. 46X IO6道爾頓，編碼了 12條 多肽，研究表明，各基因組片段與編碼多肽的關係是大體一一對應。目前對GCRV的檢測方法包括免疫學方法如葡萄球菌A蛋白協同凝集試驗 (SPA-COA)法、螢光抗體技術(FA)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法和斑點酶聯免疫吸附試 驗(Dot-ELISA)法；分子生物學方法如逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。這些方法或者操 作繁瑣，周期長，或者只能進行定性檢測而不能定量分析。最近發展起來的螢光定量PCR技 術，以其靈敏度高，特異性好、快 速、準確等優點，在病原體的定性和定量檢測等方面得到廣 泛應用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於草魚呼腸孤病毒可疑患病草魚肝、脾、腎組織的 草魚出血病基因診斷的SYBR GreenI實時螢光定量PCR檢測方法。為達到上述目的，本發明的具體技術方案為草魚呼腸孤病毒SYBR GreenI實時螢光定量PCR檢測方法至少包括抽提草魚呼 腸孤病毒總RNA、引物設計、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因RT-PCR擴增、草魚呼腸孤病毒 外衣殼蛋白基因的克隆與鑑定、標準品模板的稀釋和螢光定量PCR反應標準曲線的建立。草魚呼腸孤病毒SYBR GreenI實時螢光定量PCR檢測方法的具體步驟如下1、採用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設計根據GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列 (AF403396)設計兩對特異性引物，擴增片段長度為IOObp的片段，所設計的引物如下上遊引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下遊引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴增取1 10 μ g病毒總RNA，加入上遊引物，進行反轉錄，取反轉錄產物cDNA，加入反 應緩衝液，dNTPs、上下遊引物、滅菌雙蒸水，Taq DNA聚合酶，將上述反應體系混勻後進行 PCR擴增，PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，並回收產物；4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑑定
草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴增產物經膠回收純化後於14 25°C過 夜與載體連接，用連接產物轉化感受態細胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種於含氨苄青黴 素的LB液體培養基中，28 37°C震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒， 對重組質粒用上下遊引物進行PCR鑑定；5、標準品模板的稀釋用紫外分光光度計分別測定陽性重組質粒在260和280納米處的吸光度，並根據 公式計算重組質粒的DNA濃度與純度，將重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1 X IO2 1 X IO8 拷貝數/微升作為標準品模板，用於螢光定量PCR反 應條件的優化、標準曲線的建立，所用 公式如下分子拷貝數(個/毫升)=DNA質量濃度/DNA分子量DNA 分子量=DNA 鹼基數 X 324. 5DNA質量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數X 6. 02 X IO23 ；6、螢光定量PCR反應標準曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標準質粒DNA (1 X IO2 1 X IO8拷貝數/微升)為標 準品模板進行螢光定量PCR擴增，每個稀釋度做兩個復孔，測定該方法的檢測靈敏度、分析 實驗的重複性。在上述步驟3和步驟5中PCR擴增的反應條件為(1)、94 °C 預變性 5 分鐘；(2)、94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒，為一個循環，共進行30個循 環；(3)、在 72°C 延伸 10 分鐘。本發明的積極效果為1、該檢測方法對於模板濃度要求較寬，檢測靈敏度高，可進行定量分析；2、該檢測方法一次可同時對72各樣品進行檢測；3、PCR反應結束後，可立即觀察結果，不需要電泳、染色等操作。


圖1、GCRV定量RT-PCR反應的標準曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例進一步說明本發明的
具體實施例方式實施例一1、採用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設計根據GenBank中草魚出血病_873外衣殼蛋白(VP7)基因序列(AF403396)設計兩 對特異性引物，擴增片段長度為98bp，所設計的引物如下上遊引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下遊引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴增
取Iyg病毒總RNA，力卩入20pmol上遊弓丨物，按照Improm- II ReverseTranscription System說明書進行反轉錄。取8微升反轉錄產物cDNA，加入 IOXTaq反應緩衝液5微升，2. 5毫摩爾/升dNTPs 4微升、50微摩爾1/升，上下遊各1微 升、滅菌雙蒸水30. 5微升，5U/微升Taq DNA聚合酶0. 5微升，將上述反應體系混勻後進行 PCR擴增，反應參數94°C預變性5分鐘；94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒為 一個循環，共進行30個循環；最後72°C延伸10分鐘。同時設立無模板的陰性對照，反應結 束後，取5微升PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑑定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴增產物經膠回收純化後於16°C過夜與 載體連接，用連接產物轉化E. coliDH5a感受態細胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種於5毫 升含50微克/毫升氨苄青黴素(Amp+)的LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜，使用質粒 DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組質粒用上下遊弓I物進行PCR鑑定。5、標準品模板的稀釋用紫外分光光度計分別測定陽性重組質粒在260和280納米處的吸光度，並根據 公式計算重組質粒的DNA濃度與純度。將重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1 X 102、1 X 103、 1 X 104、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8拷貝數/微升作為標準品模板，用於螢光定量PCR反 應條件的優化、標準曲線的建立，所用公式如下分子拷貝數(個/毫升)=DNA質量濃度/DNA分子量DNA 分子量=DNA 鹼基數 X 324. 5DNA質量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數X 6. 02 X IO236、螢光定量PCR反應標準曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標準質粒DNA (1 X IO2 1 X IO8拷貝數/微升)為標 準品模板進行螢光定量PCR擴增，PCR的反應條件與步驟3相同，每個稀釋度做兩個復孔， 測定該方法的檢測靈敏度、分析實驗的重複性。實施例二 1、採用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設計根據GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列(AF403396)設計兩 對特異性引物，擴增片段長度為98bp，所設計的引物如下上遊引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下遊引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴增取5yg病毒總RNA，力卩入20pmol上遊弓丨物，按照Improm- II ReverseTranscription System說明書進行反轉錄。取8微升反轉錄產物cDNA，加入 IOXTaq反應緩衝液5微升，2. 5毫摩爾/升dNTPs 4微升、50微摩爾1/升，上下遊各1微 升、滅菌雙蒸水30. 5微升，5U/微升Taq DNA聚合酶0. 5微升，將上述反應體系混勻後進行 PCR擴增，反應參數94°C預變性5分鐘；94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒為 一個循環，共進行30個循環；最後72°C延伸10分鐘。同時設立無模板的陰性對照，反應結 束後，取5微升PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。
4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑑定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴增產物經膠回收純化後於16°C過夜與載體連接，用連接產物轉化E. coliDH5a感受態細胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種於5毫 升含50微克/毫升氨苄青黴素(Amp+)的LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜，使用質粒 DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組質粒用上下遊弓I物進行PCR鑑定。5、標準品模板的稀釋用紫外分光光度計分別測定陽性重組質粒在260和280納米處的吸光度，並根據 公式計算重組質粒的DNA濃度與純度。將重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1 X 102、1 X 103、 1 X 104、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8拷貝數/微升作為標準品模板，用於螢光定量PCR反 應條件的優化、標準曲線的建立，所用公式如下分子拷貝數(個/毫升)=DNA質量濃度/DNA分子量DNA 分子量=DNA 鹼基數 X 324. 5DNA質量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數X 6. 02 X IO236、螢光定量PCR反應標準曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標準質粒DNA(1 X IO2 1 X IO8拷貝數/微升)為標 準品模板進行螢光定量PCR擴增，PCR的反應條件與步驟3相同，每個稀釋度做兩個復孔， 測定該方法的檢測靈敏度、分析實驗的重複性。實施例三1、採用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設計根據GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列(AF403396)設計兩 對特異性引物，擴增片段長度為98bp，所設計的引物如下上遊引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下遊引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴增取IOyg病毒總RNA，力卩入20pmol上遊引物，按照 Improm- II ReverseTranscription System說明書進行反轉錄。取8微升反轉錄產物cDNA， 加入IOXTaq反應緩衝液5微升，2. 5毫摩爾/升dNTPs 4微升、50微摩爾1/升，上下遊各 1微升、滅菌雙蒸水30. 5微升，5U/微升Taq DNA聚合酶0. 5微升，將上述反應體系混勻後 進行PCR擴增，反應參數94°C預變性5分鐘；94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20 秒為一個循環，共進行30個循環；最後72°C延伸10分鐘。同時設立無模板的陰性對照，反 應結束後，取5微升PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑑定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴增產物經膠回收純化後於16°C過夜與 載體連接，用連接產物轉化E. coliDH5a感受態細胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種於5毫 升含50微克/毫升氨苄青黴素(Amp+)的LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜，使用質粒 DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組質粒用上下遊弓I物進行PCR鑑定。5、標準品模板的稀釋用紫外分光光度計分別測定陽性重組質粒在260和280納米處的吸光度，並根據公式計算重組質粒的DNA濃度與純度。將重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1 X 102、1 X 103、 1 X 104、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8拷貝數/微升作為標準品模板，用於螢光定量PCR反 應條件的優化、標準曲線的建立，所用公式如下formula see original document page 76、螢光定量PCR反應標準曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標準質粒DNA (1 X IO2 1 X IO8拷貝數/微升)為標準品模板進行螢光定量PCR擴增，PCR的反應條件與步驟3相同，每個稀釋度做兩個復孔， 測定該方法的檢測靈敏度、分析實驗的重複性。實例檢測結果將重組質粒進行10倍系列稀釋，每個稀釋度做兩個平行，進行定 量RT-PCR。通過作圖可以看出，質粒濃度為IXlO8 IXlO2個拷貝，7個數量級的範圍內 定量RT-PCR有「S」型擴增曲線，即反映了 PCR的指數增長期，線性增長期和平臺期三個階 段。檢測靈敏度為100個病毒粒子。進一步分析擴增曲線，發現指數增長期的曲線平行，反 映了 PCR的擴增效率相近；而不同稀釋度之間的Ct相差均勻，符合定量PCR的Ct值與起始 拷貝數之間嚴格的線性關係。每個稀釋度的兩個重複，其擴增曲線基本吻合在一起，反映了 實驗的平行性好。利用統計軟體STATISTICA 6. 0，對實驗中的Ct值進行統計分析。分析結果表明7 個不同稀釋梯度標準質粒DNA的Ct值變異係數(CV)在0. 08% 3. 26%之間，相同稀釋度 標準質粒Ct值之間差異均不顯著(P > 0. 05)。根據質粒拷貝數與Ct值的相關性，由SDS (Sequence Detection System) 2. 1軟體 得到標準曲線(如圖1)。橫坐標代表質粒拷貝數(χ)，縱坐標為Ct值，點上的數字代表模板 的拷貝數。拷貝數(χ)與Ct的關係為=Ct = -2. 9821gX+31. 038 ；相關係數R2 = 0. 99102。 經過對熔解曲線的分析，可以發現擴增產物的DNA熔解溫度(Tm)值非常均一，無非特異性 擴增產物和弓I物二聚體的出現。以上所述僅是本發明的非限定實施方式，對於本領域的普通技術人員來說，在不 脫離本發明創造構思和不作出創造性勞動的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都 屬於本發明的保護範圍。
權利要求
一種草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測方法至少包括抽提草魚呼腸孤病毒總RNA、引物設計、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因RT-PCR擴增、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因的克隆與鑑定、標準品模板的稀釋和螢光定量PCR反應標準曲線的建立。
2.根據權利要求1所述的草魚呼腸孤病毒SYBRGreen I實時螢光定量PCR檢測方法， 其特徵在於草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測方法的具體步驟如下(1)、採用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA；(2)、引物設計根據GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列 (AF403396)設計兩對特異性引物，擴增片段長度為90 200bp的片段，所設計的引物如 下上遊引物5』 -GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下遊引物5』 -CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；(3)、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴增取1 10ii g病毒總RNA，加入上遊引物，進行反轉錄，取反轉錄產物cDNA，加入反應緩 衝液，dNTPs、上下遊引物、滅菌雙蒸水，Taq DNA聚合酶，將上述反應體系混勻後進行PCR擴 增，PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，並回收產物；(4)、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑑定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴增產物經膠回收純化後於14 25°C過夜與 載體連接，用連接產物轉化感受態細胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種於含氨苄青黴素的 LB液體培養基中，28 37°C震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組 質粒用上下遊引物進行PCR鑑定；(5)、標準品模板的稀釋用紫外分光光度計分別測定陽性重組質粒在260和280納米處的吸光度，並根據公式 計算重組質粒的DNA濃度與純度，將重組質粒進行10倍梯度稀釋，以1 X 102 1 X 108拷貝 數/微升作為標準品模板，用於螢光定量PCR反應條件的優化、標準曲線的建立，所用公式 如下分子拷貝數(個/毫升)=DNA質量濃度/DNA分子量DNA分子量=DNA鹼基數X 324. 5DNA質量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數X6. 02X 1023 ；(6)、螢光定量PCR反應標準曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標準質粒DNA (1 X 102 1 X 108拷貝數/微升)為標準品 模板進行螢光定量PCR擴增，每個稀釋度做兩個復孔，測定該方法的檢測靈敏度、分析實驗的重複性。
3.根據權利要求1和2所述的草魚呼腸孤病毒SYBRGreen I實時螢光定量PCR檢測 方法及具體步驟，其特徵在於上述步驟(3)和步驟(5)中PCR擴增的反應條件為(1)、94°C預變性5分鐘；(2)、94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒，為一個循環，共進行30個循環；(3)、在721延伸10分鐘。
全文摘要
本發明提供了一種草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測方法。該方法至少包括抽提草魚呼腸孤病毒總RNA、引物設計、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因RT-PCR擴增、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因的克隆與鑑定、標準品模板的稀釋和螢光定量PCR反應標準曲線的建立。該檢測方法對於模板濃度要求較寬，檢測靈敏度高，可進行定量分析，一次可同時對72各樣品進行檢測，PCR反應結束後，可立即觀察結果，不需要電泳、染色等操作，因此比常規PT-PCR方法方便、快捷。
文檔編號C12Q1/70GK101831507SQ201010173229
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月10日 優先權日2010年5月10日
發明者周勇, 徐進, 曾令兵, 羅曉松, 範玉頂, 馬傑 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所