防治新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑的製備方法及應用的製作方法

2023-06-10 13:19:06

專利名稱：防治新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑的製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種防治新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑的製備方法及應用。
背景技術：
新型鴨呼腸孤病毒病(俗稱鴨出血壞死性肝炎)是2005年以來，在中國福建、 廣東和浙江等省番鴨、半番鴨和麻鴨群發生的一種以肝臟不規則壞死和出血混雜、心肌出血、脾臟腫大斑塊狀壞死、腎臟和法氏囊出血等為主要特徵的疫病，該病無明顯季節性，各種品種鴨(如番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨等)均可發生，並有逐年增加的趨勢；發病日齡約為3 25日齡，其中以5 10日齡居多，病程5 7d，發病率5% 20%、死亡率2% 15%,日齡愈小或並發感染時其發病率死亡率愈高，給養鴨業造成一定的經濟損失。福建省農業科學院畜牧獸醫研究所從病毒理化生物學、動物回歸試驗、基因組特性及分子水平上首次證實鴨出血性壞死性肝炎的病原是一種有別於番鴨呼腸孤病毒(MDRV)、禽呼腸孤病毒 (ARV)的新型鴨呼腸孤病毒(Novel Duck Reovirus, NDRV)。至今為止，該病尚無有效的防治方法。

發明內容
本發明的目的之一是提供鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株，系新型鴨呼腸孤病毒經生物技術傳代致弱選育而成，保藏在中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC)，保藏日2011年7月29日，保藏編號CCTCC NO :V201127。保藏單位CCTCC地址在中國武漢市武漢大學。本發明的目的之二是提供用鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株製備防治新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑的方法。所述的製備方法如下鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株在番鴨胚成纖維細胞(MDEF)或11日齡番鴨胚中培養，收穫病毒液滅活後與油佐劑製備新型鴨呼腸孤病毒病滅活疫苗。應用該疫苗3次免疫蛋雞，收穫3免後21天至63天的雞蛋，提取卵黃與適量滅菌生理鹽水製備成新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑。本發明的目的之三是提供用鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株製備的防治新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑的應用無NDRV母源抗體的雛鴨在1-2日齡，每羽肌注05ml的免疫製劑；含NDRV母源抗體的雛鴨在10日齡左右注射免疫製劑，1. Oml/羽；小鴨在注射免疫製劑後能夠抵抗NDRV 的感染。雛鴨接種適量本發明的免疫製劑，能夠預防鴨出血壞死性肝炎(新型鴨呼腸孤病毒病)本發明的優點本發明首次製成新型鴨呼腸孤病毒製備免疫製劑，該製劑製備簡便，成本低，安全性好，為防制新型鴨呼腸孤病毒病提供了一種安全有效的方法。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明進一步說明。(但不是對本發明的限制)。鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株，系新型鴨呼腸孤病毒經生物技術傳代致弱選育而成。保藏在CCTCC，保藏日2011年7月四日，保藏編號CCTCC NO :V201127。將上述的鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株為種毒，接種番鴨胚尿囊腔，尿囊腔接種 11日齡番鴨胚增殖病毒，收穫含毒尿囊液；或接種番鴨胚成纖維細胞單層，當細胞病變達 75%以上時收穫細胞毒；將上述病毒用甲醛滅活後，按適當比例(如1 1比例)與油佐劑混勻，研製成滅活疫苗。將滅活疫苗免疫開產蛋雞，1. Oml/羽，共免疫3次，每次間隔21天。 收穫3免後21天至63天的雞蛋，無菌提取卵黃與適量滅菌生理鹽水混勻並過濾分裝，即為新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑。具體方法如下(1)抗原製備將JM85病毒株接種番鴨胚成纖維細胞(MDEF)或11日齡的番鴨胚， 收穫細胞病變達75%的細胞毒或24h後死亡番鴨胚的尿囊液毒，-20°C凍存。當病毒對番鴨胚成纖維細胞(MDEF)的TCID5tl彡10,/0. Iml時，可用於病毒的滅活。將收穫的尿囊液或細胞毒，按總體積的0.06%加入純甲醛，37°C滅活Mh。取滅活後的病毒液接種9日齡SPF 雞胚或11日齡番鴨胚，雞胚及番鴨胚應全部存活。(2)疫苗製備將滅活病毒液與油佐劑按1 1混合，攪拌均勻製成油包水型乳劑疫苗。該疫苗無菌檢驗應無菌生長。7日齡健康易感番鴨，每羽頸部皮下注射1. Oml的疫苗後，接種鴨應全部存活，採食、飲水、生長發育等均正常；隨機剖殺鴨，心、肝、脾等內臟應未見異常。(3)免疫製劑的製備應用以上製備的疫苗免疫蛋雞3次，每次間隔21天，每羽每次注射1. Oml0收集3免後21天至63天含新型鴨呼腸孤病毒抗體的高免雞蛋，蛋殼洗淨消毒後，無菌操作，分離蛋黃，加入一定比例的滅菌生理鹽水(根據蛋黃中的抗體效價而定)進行勻漿，並每毫升加入青黴素、鏈黴素各1000單位，硫柳汞1. 0/萬，過濾，分裝消毒瓶內，-20°C冷藏備用，製備成卵黃抗體免疫製劑。(4)免疫製劑相關指標的測定4. 1無菌檢驗按現行中華人民共和國《獸藥典》進行，均無細菌、黴菌、支原體等生長。4. 2安全性檢驗用1日齡健康易感雛番鴨10羽，每羽腿部肌肉注射1. 0毫升，觀察20天，全部健活。4. 3攻毒保護檢驗1-2日齡番鴨分成2組，每組10羽，其中免疫製劑組腿肌注射製劑0. 5ml/羽，對照組腿肌注射滅菌hanks液0. 5ml/羽；於注射後第3天，兩組分別接種 NDRV強毒，0. 5ml/羽，觀察各組試驗番鴨的採食、飲水、發病、死亡等情況，並於攻毒後第7 天每組隨機剖殺3羽，觀察心、肝、脾等病變。結果免疫製劑組人工感染強毒後在整個觀察期，採食、飲水等均正常，並隨機剖殺3羽，各器官均未見異常。對照組人工感染強毒後，番鴨表現為吃料、飲水減少或死亡，整個觀察期間體重明顯小於製劑組；剖檢可見肝臟、脾臟明顯的出血及壞死，心臟出血等病變。(5)免疫製劑的應用
無NDRV母源抗體的小鴨在1-2日齡，每羽肌注0. 5ml的製劑；有NDRV母源抗體的小鴨可在10日齡左右注射免疫製劑，1. Oml/羽。(6)臨床應用效果試驗結果在NDRV流行疫區挑選3個肉鴨養殖場進行免疫製劑的防治試驗。小鴨在1_2日齡，每羽接種NDRV製劑0. 5ml，跟蹤觀察45天，試驗雛鴨未出現不良反應，小鴨在整個飼養期內均無NDRV感染。而周邊未採取以上措施的養殖場一直存在NDRV發病和死亡。進一步證明該製劑安全、有效，可用於臨床上預防鴨出血壞死性肝炎(新型鴨呼腸孤病毒病)。
權利要求
1.鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株，保藏在CCTCC，保藏日期2011年7月四日，保藏編號 CCTCC NO :V201127。
2.用權利要求1所述的鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株製備防治新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑的方法，其特徵在於，所述的製備方法如下用鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株尿囊腔接種11日齡番鴨胚增殖病毒，收穫含毒尿囊液； 或接種番鴨胚成纖維細胞單層，當細胞病變達75%以上時收穫細胞毒；將上述病毒用甲醛滅活後，按適當比例與油佐劑混勻，研製成滅活疫苗；將滅活疫苗免疫開產蛋雞，1. Oml/ 羽，共免疫3次，每次間隔21天。收穫3免後21天至63天的雞蛋，無菌提取卵黃與適量滅菌生理鹽水混勻並過濾分裝，即為新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑。
3.用權利要求1所述的鴨呼腸孤病毒NDRV-JM85株製備的防治新型鴨呼腸孤病毒病免疫製劑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新型鴨呼腸孤病毒株NDRV-JM85，保藏編號CCTCC NOV201127)，以此為種毒，接種番鴨胚尿囊腔，收穫含毒尿囊液；或接種MDEF細胞，收穫CPE達75％時的細胞毒。以上病毒液用甲醛滅活後按比例加入白油佐劑，混勻後即成安全、有效的新型鴨呼腸孤病毒病油乳劑滅活疫苗。應用疫苗3次免疫產蛋雞，免疫間隔21天，每次每羽注射1.0ml。收穫3免後21天至63天的雞蛋，提取卵黃與適量滅菌生理鹽水製備成新型鴨呼腸孤病毒病高免抗體製劑。無NDRV母源抗體的雛鴨在1-2日齡注射0.5ml/羽的抗體製劑，或含母源抗體的雛鴨在10日齡左右注射1.0ml/羽的抗體製劑，即可預防和控制新型鴨呼腸孤病毒病。本發明適合於GMP條件下的規模化生產。
文檔編號C12N7/00GK102492661SQ20111046106
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者朱小麗, 李兆龍, 林鋒強, 王劭, 程曉霞, 陳仕龍, 陳少鶯 申請人:福建省農業科學院畜牧獸醫研究所, 陳少鶯