基於硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法
2023-06-10 20:45:31 4
專利名稱：基於硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法
技術領域：
本發明涉及一種新的基因克隆方法，尤其涉及一種基於硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法，可以用於重組蛋白表達載體構建，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
基因克隆技術的出現極大地促進了現代基因工程、蛋白質工程的發展。傳統基因克隆技術涉及目標基因DNA片段與質粒載體的限制性核酸內切酶消化、連接酶連接環化目標基因與質粒兩步必不可少的操作。由於限制性核酸內切酶消化反應與DNA連接酶反應，特別是限制性核酸內切酶消化反應，效率的高低直接決定著目標基因克隆能否成功。雖然利用鹼性磷酸單酯酶除去線性化載體的5』磷酸基團，會大大提高陽性克隆百分比，但該操作異常繁瑣，手法難於掌握，經常起不到應有作用。為了克服常規基因克隆方法的缺陷，開發了連接酶非依賴性克隆方法。其中基於T4DNA聚合酶的連接酶非依賴性克隆方法是其中的一種方法(Nucleic Acids Research，Vol.18，No.20p6069-6074)，該方法通過在擴增目標基因的引物5』端添加一段特殊的鹼基序列(一般為12-15個鹼基)，該段特殊鹼基序列的3』端最後一個鹼基是此段序列中唯一的一個該種鹼基(例如dG)，在dCTP的存在下目標基因與線性質粒載體與T4DNA聚合酶一起溫育，產生長的5』單鏈突出端，帶有5』單鏈突出端的目標基因與線性質粒載體互補配對後，轉化大腸桿菌修複目標基因與線性質粒載體間的缺口，完成目標基因的克隆。該方法操作缺點主要有1)需要在目標基因與線性質粒載體的5』端引入一段特定的鹼基序列，導致克隆的目標基因的兩端附加了一段人為的鹼基序列；2)引入的一段特定鹼基序列有時較難設計，造成目標基因克隆困難。
發明內容
本發明的目的在於針對現有基因克隆技術的不足，提供一種新的連接酶非依賴性基因克隆方法，這種基因克隆技術不需要限制性核酸內切酶消化與連接酶反應，使得基因克隆操作簡便、克隆效率與通量大大提高，可用於大規模基因克隆。
為實現這樣的目的，在本發明中，用於擴增目標基因與質粒載體的引物片段(寡核苷酸片斷)具有如下特徵引物5』端第11-21位間的某一磷酸二酯鍵為硫代修飾；擴增目標基因的正向引物5』端的第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列與擴增載體的反向引物5』端的第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列互補配對，擴增目標基因的反向引物5』端的第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列與擴增載體的正向引物5』端的第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列互補配對；正向引物與反向引物擴增目標基因與質粒載體，然後用限制性內切核酸酶Dpn I消化環形質粒模板，最後純化PCR產物，如此製備的DNA片段5』端第11-21位間含有一處硫代修飾。5』外切核酸酶從雙鏈DNA的5』端降解DNA鏈，用其消化PCR擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA分子，會產生3』單鏈突出端，硫代修飾的存在使得5』外切核酸酶在消化DNA過程中會終止在硫代修飾處，從而產生長10-20個核苷酸的3』單鏈突出端。由於目標基因與質粒載體的3』突出端鹼基序列互補配對，二者形成穩定的完全配對雙鏈，不需要進行DNA連接反應，可以直接轉化大腸桿菌。轉化後，大腸桿菌DNA修復系統可以修複目標基因與質粒載體間的DNA缺口，形成完整的含有目標基因的重組DNA分子。
本發明的具體步驟如下1、設計合成用於擴增目標基因與質粒載體的引物序列。引物的序列特徵是(1)5』端第11-21位間的某一磷酸基團為硫代修飾；(2)擴增目標基因的正向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列與擴增質粒載體的反向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列互補配對，擴增目標基因的反向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列與擴增質粒載體的正向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列互補配對；(3)3』端下遊鹼基序列與待擴增DNA片段兩端鹼基序列配對。
2、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目標基因與線性化質粒載體DNA片段。將用於擴增DNA片段(目標基因與質粒載體)的正向引物與反向引物、目標核酸模板分子(含目標基因的基因組DNA或質粒載體DNA)、高忠實度耐高溫DNA聚合酶(例如pfu DNA聚合酶)、4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)加入PCR反應緩衝液，進行反應。PCR條件同一般的液相聚合酶鏈式反應。
3、純化擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA片段。對擴增的線性化質粒載體PCR產物，先用限制性核酸內切酶Dpn I(其特異性識別切割雙鏈DNA中A甲基化的GmATC序列)消化質粒模板，由於質粒模板具有多處GmATC序列，DpnI處理使得質粒模板變成很多段短的DNA雙鏈，這些短的DNA雙鏈轉化大腸桿菌不能夠產生克隆，從而消除了野生型質粒模板產生的假陽性克隆，回收經Dpn I處理的線性化質粒載體以及目標基因的擴增產物。
4、利用5』外切核酸酶(例如λ外切核酸酶與T7基因6蛋白)消化PCR擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷。5』外切核酸酶特異性從5』端水解雙連DNA中帶有5』磷酸基團的DNA鏈。用5』外切核酸酶消化製備的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷2-5分鐘。5』外切核酸酶消化和硫代修飾(阻礙核酸酶消化)的存在使得DNA片段的兩端產生長為10-20個核苷酸的3』突出端。
5、5』外切核酸酶處理的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷間的雜交配對。將5』外切核酸酶消化的兩種DNA片斷混合後，室溫放置15分鐘，使二者的3』突出端雜交配對，形成含目標基因的帶缺口重組質粒。
6、含目標基因的帶缺口重組質粒轉化大腸桿菌。雜交混合物(該混合物中含有含目標基因的帶缺口重組質粒)轉化大腸桿菌感受態細胞，在固體培養基上37度培養過夜。在大腸桿菌的繁殖過程中，帶缺口重組質粒中目標基因與質粒載體間的缺口會被修復，形成含目標基因的完整重組質粒。
7、含目標基因的完整重組質粒的鑑定。挑取單菌落，利用擴增目標基因的引物與Taq DNA聚合酶進行菌落PCR，鑑定含目標基因的完整重組質粒的陽性克隆。培養陽性克隆，並抽提含目標基因的完整重組質粒DNA。
本發明與現有的基因克隆技術相比有顯著的進步。主要優點如下(1)含有目標基因的陽性克隆率高。由於採用PCR擴增質粒載體，消除了限制性核酸內切酶消化質粒造成的假陽性克隆(不含目標基因的質粒載體)，從而極大地提高了陽性克隆比例。(2)操作通量大，適宜於多個目標基因同時克隆。基於硫代修飾的連接酶非依賴性基因克降方法在整個操作過程中不需要特異性的限制性核酸內切酶，操作統一僅需要外切核酸酶消化生成長粘性末端，因此可以簡單的擴大克隆通量，進行大規模基因克隆。(3)插入目標基因兩端用於與載體互補的鹼基序列隨意。硫代修飾的存在保證了各種5』外切核酸酶消化反應能夠有效地終止在硫代修飾處，使得3』突出端可以隨意設計，大大方便了操作。(4)目標基因PCR擴增忠實性高。由於硫代修飾不影響各種DNA聚合酶催化的PCR反應，因此可以採用忠實性最高的pfu DNA聚合酶擴增目標基因，降低在PCR中引入突變的頻率。此優點在構建目標基因(特別是長基因)的表達克隆中優勢尤為明顯，可以保證構建的表達載體能夠表達出正確的重組蛋白。
本發明可用於基因克隆，基因片段拼接、目標基因定點突變等領域。目標基因與質粒載體無需限制性核酸內切酶消化，因此可以大大降低假陽性克隆(空質粒)百分比，提高目標基因克隆成功率。
圖1為本發明基於硫代修飾引物與5』外切核酸酶消化的連接酶非依賴性基因克隆方法的原理圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明的技術方案作進一步詳細描述。以下實施例不構成對本發明的限定。
本發明方法如圖1所示，首先利用5』端第11-21位間某一磷酸二酯鍵是硫代修飾的引物片段分別擴增目標基因與質粒載體，獲得5』端第11-21位間某一磷酸二酯鍵是硫代修飾的目標基因與線性化質粒載體的DNA片段；然後利用5』外切核酸酶消化製備的DNA分子，硫代修飾的存在使得5』外切核酸酶在消化DNA過程中會終止在硫代修飾處，從而產生長10-20個核苷酸的3』單鏈突出端；由於目標基因與線性化質粒載體的3』單鏈突出端互補配對，二者混合雜交會形成含目標基因的帶缺口重組質粒；該質粒轉化大腸桿菌後，目標基因與質粒載體間的缺口會被大腸桿菌修復好，形成含目標基因的完整重組質粒，從而完成目標基因的克隆。
本發明一個實施例中的目標基因是衣原體內切核酸酶IV基因，要將其克隆到pUC18載體，使用的5』外切核酸酶為T7基因6蛋白，硫代修飾存在於引物5』端第15位的磷酸二酯鍵，具體實施步驟如下第一步，設計合成用於擴增衣原體內切核酸酶IV基因與pUC18質粒的引物序列。4條引物分別為pUC-18-U-F、pUC-18-U-R、CpendoIV-F、CpendoIV-R。其中pUC-18-U-F與pUC-18-U-R用於擴增pUC18質粒載體，CpendoIV-F、CpendoIV-R用於擴增衣原體內切核酸酶IV基因。4條引物鹼基序列如下pUC-18-U-F5』ATCACCACCATTGAg-aagcttggcactggccgtcgpUC-18-U-R5』ACCAGGCCGCTGCTg-gaattcgtaatcatggtcatagCpendoIV-F5』AGCAGCGGCCTGGTc-atatgaaagtacttcctcctccctcCpendoIV-R5』TCAATGGTGGTGATg-ctaactatctctgttttttgaaaac其中，符號-表示硫代修飾，小寫字母鹼基序列與擴增DNA片斷互補配對，大寫字母鹼基為目標基因與線性化質粒載體互補配對區。引物可以自己利用DNA合成儀合成或由各DNA合成公司合成。
第二步，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體DNA片段。PCR反應組成(50微升反應體積)正向引物與反向引物，0.5μM；DNA模板(100納克衣原體基因組DNA，或10納克pUC18質粒載體DNA)；pfu DNA聚合酶，2.5個單位；dNTPs，200μM；1×PCR反應緩衝液。PCR反應條件95℃×5分鐘；(95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×4分鐘)×20個循環；72℃×10分鐘。
第三步，純化衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體PCR擴增產物。衣原體內切核酸酶IV基因擴增產物直接用PCR產物純化試劑盒純化。由於線性化pUC18質粒載體PCR擴增產物中含有環狀的pUC18質粒模板，可以利用限制性核酸內切酶Dpn I處理PCR產物，將pUC18質粒模板消化成短的DNA片斷，再利用PCR產物純化試劑盒純化Dpn I處理的線性化pUC18質粒載體PCR擴增片段。Dpn I特異性識別切割雙鏈DNA中A甲基化的GmATC序列，由於質粒模板具有多處GmATC序列，Dpn I處理把質粒模板變成很多段短的DNA雙鏈，這些短的DNA雙鏈轉化大腸桿菌時不能夠產生克隆，從而消除了野生型質粒模板產生的假陽性克隆。Dpn I處理與PCR產物純化試劑盒操作按產品操作說明進行。
擴增的衣原體內切核酸酶IV基因鹼基序列如下，其中省略號代表衣原體內切核酸酶IV基因中間的鹼基序列，符號-表示硫代修飾5』AGCAGCGGCCTGGTc-atatgaaagtacttcctcctccctc..............
TCGTCGCCGGACCAg tatactttcatgaaggaggagggag..............
..............gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA..............caaaagttttttgtctctatcaatc-gTAGTGGTGGTAACT5』擴增的線性化pUC18質粒載體鹼基序列如下，其中省略號代表線性化pUC18質粒載體中間的鹼基序列，符號-表示硫代修飾5』ATCACCACCATTGAg-aagcttggcactggccgtcg...................
TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc...................
.............ctatgaccatgattacgaattc cAGCAGCGGCCTGGT.............gatactggtactaatgcttaag-gTCGTCGCCGGACCA 5』第四步，利用T7基因6蛋白消化衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體的PCR擴增的DNA片斷。
將純化的衣原體內切核酸酶IV基因與線性化pUC18質粒載體的PCR擴增片斷進行T7基因6蛋白消化處理，由於硫代修飾會將T7基因6蛋白消化反應終止在硫代修飾位置(5』端第十五位磷酸二酯鍵)，因此可以產生長為14個核苷酸的3』突出端。T7基因6蛋白消化反應組成(50微升反應體積)1個單位的T7基因6蛋白，1個皮克摩爾的衣原體內切核酸酶IV基因或線性化pUC18質粒載體DNA片斷，1×T7基因6蛋白反應緩衝液。反應條件37度溫育5分鐘，70度處理15分鐘失活T7基因6蛋白。
T7基因6蛋白消化後的衣原體內切核酸酶IV基因鹼基序列如下，其中省略號代表衣原體內切核酸酶IV基因中間的鹼基序列，符號-表示硫代修飾5』c-atatgaaagtacttcctcctccctc.............
TCGTCGCCGGACCAg tatactttcatgaaggaggagggag.............
.............gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA.............caaaagttttttgtctctatcaatc-g 5』T7基因6蛋白消化後的線性化pUC18質粒載體鹼基序列如下，其中省略號代表線性化pUC18質粒載體中間的鹼基序列，符號-表示硫代修飾5』g-aagcttggcactggccgtcg...................
TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc...................
...................ctatgaccatgattacgaattc cAGCAGCGGCCTGGT...................gatactggtactaatgcttaag-g 5』第五步，T7基因6蛋白處理過的衣原體內切核酸酶IV基因片段與線性化pUC18質粒載體DNA片斷互補配對。將T7基因6蛋白消化後的衣原體內切核酸酶IV基因片段與線性化pUC18質粒載體片斷等摩爾(各0.1個皮克摩爾)混合於1×T7基因6蛋白反應緩衝液，室溫或冰上放置15分鐘，使二者3』突出端互補配對，形成插入了衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒。
插入了衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒鹼基序列如下，其中省略號代表帶缺口pUC18重組質粒中間的鹼基序列，符號_代表衣原體內切核酸酶IV基因與pUC18質粒間的缺口，符號-表示硫代修飾..........ctatgaccatgattacgaattc c AGCAGCGGCCTGGT_c-atatgaaagtacttcctcctccctc..........gatactggtactaatgcttaag-g_TCGTCGCCGGACCA g tatactttcatgaaggaggagggag...........................................................................
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第六步，含衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒轉化大腸桿菌。將第五步製備的插入了衣原體內切核酸酶IV基因的帶缺口pUC18重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞(氯化鈣法製備的感受態細胞即可)，轉化後菌體塗布於含100微克/毫升氨苄青黴素的LB平板，於37度培養過夜。大腸桿菌的DNA修復系統會修復好衣原體內切核酸酶IV基因與pUC18質粒間的缺口，形成沒有缺口的插入了衣原體內切核酸酶IV基因的完整pUC18重組質粒。轉化按標準操作進行。
第七步，含衣原體內切核酸酶IV基因的pUC18重組質粒的鑑定。從第六步的平板上挑取單菌落，進行菌落PCR，鑑定含有衣原體內切核酸酶IV基因的單菌落，若能擴增出衣原體內切核酸酶IV基因的特異性DNA條帶，該菌落即為插入了衣原體內切核酸酶IV基因的pUC18重組質粒的陽性克隆，培養陽性克隆並從中抽提重組質粒。菌落PCR組成(10微升反應體積)衣原體內切核酸酶IV基因特異性引物，0.5μM；Taq DNA聚合酶，0.5單位；dNTPs，200μM；1×Taq聚合酶反應緩衝液；單菌落菌體。反應條件95℃×10分鐘；(95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×1分鐘)×30個循環；72℃×5分鐘。質粒抽提按標準操作進行。
權利要求
1.一種基於硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法，其特徵在於包括以下步驟1)設計合成用於擴增目標基因與質粒載體的引物序列；引物序列的特徵是(1)5』端第11-21位間的某一磷酸基團為硫代修飾；(2)擴增目標基因的正向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列與擴增質粒載體的反向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列互補配對，擴增目標基因的反向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列與擴增質粒載體的正向引物的5』端第1位至硫代修飾上遊第2位間的連續鹼基序列互補配對；(3)3』端下遊鹼基序列與待擴增DNA片段兩端鹼基序列配對；2)將用於擴增目標基因與質粒載體的正向引物與反向引物、目標基因與質粒載體的DNA模板分子、DNA聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸的混合物dNTPs加入聚合酶鏈式反應緩衝液，進行反應；3)對擴增的線性化質粒載體PCR產物，先用DNA限制性核酸內切酶DpnI消化去除質粒模板；分別回收目標基因與經Dpn I處理的線性化質粒載體的PCR擴增產物；4)5』外切核酸酶處理PCR擴增的目標基因與線性化質粒載體DNA片斷，5』外切核酸酶特異性從5』端降解雙連DNA的一條DNA鏈，DNA中的硫代修飾阻斷5』外切核酸酶消化，因此經5』外切核酸酶消化使得DNA片段的兩端產生長為10-20個核苷酸的3』突出端；5)將5』外切核酸酶消化的兩種DNA片斷混合，使二者的3』突出端雜交配對，形成含目標基因的帶缺口重組質粒；6)將含目標基因的帶缺口重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，37度培養，修復重組質粒中的缺口，形成含目標基因的完整重組質粒；7)利用擴增目標基因的引物與Taq DNA聚合酶進行菌落PCR，鑑定含目標基因的完整重組質粒的陽性克隆，從陽性克隆中抽提含目標基因的完整重組質粒DNA。
全文摘要
本發明涉及一種基於硫代修飾的連接酶非依賴性基因克隆方法，其中擴增目標基因與質粒載體的引物的5』端第11－21位間的某一磷酸二酯鍵為硫代修飾；目標基因的正向引物和載體的反向引物，目標基因的反向引物和載體的正向引物，每對引物5』端至硫代修飾上遊第2位的連續鹼基序列互補配對。PCR擴增目標基因與質粒載體後，純化PCR產物。5』外切核酸酶從5』端降解DNA鏈，硫代修飾與5』外切核酸酶消化DNA雙鏈的共同作用會生成長10－20個核苷酸的3』單鏈突出端。由於目標基因與質粒載體的3』突出端鹼基序列互補，形成穩定的完全配對雙鏈，不需要進行DNA連接反應，直接轉化大腸桿菌。本發明目標基因克隆不依賴於限制性核酸內切酶與DNA連接酶，操作通量大，可用於大規模基因克隆。
文檔編號C12N15/10GK101067133SQ20071003938
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月12日 優先權日2007年4月12日
發明者劉喜朋, 劉建華 申請人:上海交通大學