梨PbrmiR397a及其應用的製作方法
2023-05-29 15:05:46
本發明屬於植物基因工程領域，涉及梨pbrmir397a及其應用，具體涉及從『碭山酥梨』中分離、克隆得到一個調控梨果實石細胞發育的microrna基因(pbrmir397a)及其應用。
背景技術：
中國每年的梨產量佔到了全球產量的60％以上。但由於果實品質較差，梨的出口量只佔全世界梨出口量的15％左右，而且出口價格明顯低於平均出口價格。梨石細胞含量是影響梨果實品質的重要因素之一。梨果實石細胞是由薄壁細胞在其細胞壁上沉積了大量木質素而形成的厚壁細胞。因此木質素的合成是影響石細胞發育的關鍵因素[1]。
木質素的含量與組成在不同植物、組織、細胞和亞細胞位置差異很大，且受發育階段和環境的影響[2]。雙子葉植物中主要是g-木質素和s-木質素，並有微量的h-木質素；單子葉植物中g-木質素和s-木質素含量差不多，並含有比雙子葉植物多的h-木質素。通常g-木質素和s-木質素的含量要比h-木質素多。木質素不易進行化學降解，其含量直接影響作物轉化為生物燃料和纖維質產物的能力[3]。
木質素的研究已在多種植物中廣泛開展，包括模式植物擬南芥、林木植物(楊樹、桉樹)、作物(玉米、苜蓿、水稻、柳枝稷、甘蔗)以及少量的果蔬(竹筍、枇杷)等，但不同植物的木質素相關研究目的不盡相同。擬南芥作為模式植物，主要用於開展一些基礎研究；桉樹等林木植物作為造紙原料，柳枝稷、甘蔗等作為生物能源植物，木質素含量是制約其產物轉化的重要因素，因此，研究目標在於獲得積累較少木質素的植株或是形成更容易被化學方法降解的木質素[4]。
micrornas(mirnas)是近年來備受關注的一類非編碼rna，它在生物中廣泛存在，長度為19-25nt。在植物中，由具有莖環結構的mirna前體經過dcl1(dicer-like1)酶的兩步切割產生成熟mirna。成熟mirna與argonaute蛋白結合進入rna誘導沉默複合體(rna-inducedsilencingcomplex,risc)，通過鹼基互補配對的方式與靶基因的mrna結合導致靶基因的表達被抑制，其作用機制主要包括引起靶基因mrna降解和抑制翻譯兩種情況。mirna在生物體的不同發育階段和不同部位，存在著時間上和空間上的特異表達，對生物體的轉錄後基因調控起著關鍵作用[5]。隨著園藝植物mirnas研究的不斷深入，越來越多的證據表明mirna在園藝植物生長發育，以及響應生物脅迫與非生物脅迫方面都起著重要的調節作用。
有關mirnas調控木質素的研究最早出現在acaciamangium上。通過對acaciamangium高木質素含量(41％)和低木質素含量(21％)次生木質部的兩個樣品進行高通量測序，得到了兩個mirnas資料庫。經過比較發現這些mirnas預測的靶基因為一些轉錄因子，而這些轉錄因子在木質素的合成過程中，起著重要的作用[6]。隨後又發現在acaciamangium中，有6個高度保守的mirnas家族參與次生細胞壁的合成。其中mir166家族在韌皮部和木質部中表達量上存在著巨大的差異。mir166家族的mirnas預測的靶基因(hd-zipiii、c4h、cad、ccoaomt)在木質素的合成過程中，擔任著重要的角色[7]。在木本植物的模式植物毛果楊(populustrichocarpa)中，mir397的靶向基因為49個漆酶基因。mir397過量表達的轉基因毛果楊中，漆酶基因的表達量全部下調，而且與野生型相比莖幹中木質素含量下降40％[8]。
有關mirnas的大部分信息來源於模式作物，如擬南芥、楊樹等，但有關果樹的mirnas的研究則非常有限。本發明以『碭山酥梨』為試材，利用同源克隆技術，克隆得到梨pbrmir397a基因的前體序列，構建過量表達載體，通過農桿菌介導法遺傳轉化菸草使其過量表達，證明其可能參與菸草莖杆維管束的發育，從而擴展了梨果實石細胞形成的分子調控途徑。另外，克隆梨中調控木質素合成的基因很大程度上提高作物改良和育種的效率，對農業生產也具有非常重要的理論和實踐意義。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種調控梨果實木質素合成的pbrmir397a基因。
本發明的另一目的是提供該基因的應用。
本發明的目的可通過以下技術方案實現：
分離來自『碭山酥梨』具有調控梨果實木質素合成的pbrmir397a基因，其核苷酸序列為seqidno.1所示，包含107nt的前體核苷酸序列。
含有本發明所述pbrmir397a基因的重組表達載體。
所述的重組表達載體，優選以pcambia1301為出發載體，所述pbrmir397a基因的插入位點為bglii和bsteii之間。
含有本發明所述pbrmir397a基因的宿主菌。
克隆本發明所述pbrmir397a基因序列的引物對，上遊引物pbrmir397a-f1序列如seqidno.2所示，下遊引物pbrmir397a-r1序列如seqidno.3所示。
本發明所述的pbrmir397a重組過量表達載體在減少菸草木質素合成的應用。
有益效果
與現有技術相比，本發明具有以下優點和效果：
1.pbrmir397a基因的發現，為減少木質素合成的分子育種提供新的基因資源，為實施綠色農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利於降低農業成本和實現環境友好。
2.通過農桿菌介導遺傳轉化方法將mirna轉化菸草，獲得的轉基因植株，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的pbrmir397a基因具有同時靶向抑制多個基因表達的功能，從而減少菸草木質素合成的功能。pbrmir397a基因這種能同時調控多個基因的優點，為分子育種提供更高效地途徑。
附圖說明
圖1為本發明pbrmir397a基因前體序列形成的stem-loop結構圖。
圖2為本發明pcambia1301-pbrmir397a載體結構示意圖。
圖3為pbrmir397a基因轉基因植株pcr鑑定圖。其中，利用pbrmir397a基因特異引物pcr鑑定菸草轉基因植株。m：dl2000marker，1：陽性對照，2：陰性對照，3，野生型菸草，4-23：轉基因株系；具有特異條帶的為轉基因植株，沒有特定條帶的為假陽性植株。
圖4為本發明pbrmir397a基因在轉基因植株的基因表達量分析圖。wt為野生型，其餘編號：轉基因株系。
圖5野生型及轉基因菸草植株組織學分析。其中：wt：野生型；397a為轉基因株系。
(a)-(d)為甲苯胺藍染色，(e)-(f)405nm下木質素的自發螢光，(g)-(h)透射電鏡示意圖
圖6野生型及轉基因菸草植株木質部切片分析。
(a)木質部寬度，(b)木質部細胞次生細胞壁厚度。*表示差異顯著，**表示差異極顯著。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明做出詳細的描述。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例1pbrmir397a基因分離克隆
從『碭山酥梨』葉片中抽提dna，用於擴增pbrmir397a基因前體序列。
dna抽提使用植物基因組提取試劑盒(購自成都福際，按照該試劑盒提供的操作說明書操作)。擴增基因引物對為seqidno.2和seqidno.3。50μl的反應體系中包括200ngdna，1×緩衝液(transstartfastpfubuffer)，10mmdntp，1utaq聚合酶(transstartfastpfudnapolymerase)(前述緩衝液和taq聚合酶購自trans公司)，500nm上述引物。pcr反應在eppendorf擴增儀上按以下程序完成：95℃，預變性2分鐘，95℃變性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒，35個熱循環，72℃延伸10分鐘，4℃保存。產生一條單一pcr條帶產物。
pcr產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測後，用小量膠回收試劑盒(購自康為世紀，按照該試劑盒提供的操作說明書操作)回收dna片段。回收純化的dna溶液與peasy載體(購自trangen公司)進行連接反應，按說明書步驟操作。連接反應體系總體積是5μl，其中包括4.5μl純化的pcr產物，0.5μlt載體。16℃連接10分鐘。取5μl連接產物，採用熱擊法(參照《分子克隆實驗手冊》第三版，科學出版社，2002)轉化大腸桿菌dh5α，在含有50mg/l氨苄黴素的lb固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個陽性克隆測序(由上海英俊生物技術有限公司完成)。測序結果表明，pbrmir397a基因前體序列全長為107nt，其核苷酸序列為seqidno.1所示，用在線軟體sfold(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl)預測二級結構，發現能夠形成莖環結構(圖1)。
實施例2植物轉化超表達載體的構建
對pcambia-1301載體的多克隆位點和pbrmir397a基因的前體序列上的酶切位點分析，選擇bglii和bsteii作為內切酶。按照一般設計引物的原則用primerprimer3.0軟體設計出帶有酶切位點的引物，其引物對序列為seqidno.4和seqidno.5。以測序正確的保存菌液提取質粒為模板，進行含限制性酶切位點基因的克隆。pcr擴增的退火溫度為60℃，pcr反應體系及擴增程序同實施例1。回收目的條帶，再連接peasy載體上。雙酶切體系總體積為40μl，其中含有peasy-pbrmir397a質粒12μl，10×kbuffer(購自neb公司)4μl，bglii0.8μl，bsteii0.8μl及水22.2μl。pcambia1301載體的雙酶切體系總體積為40μl，其中含有經過質粒提取獲得的pcambia1301載體dna8μl，10×kbuffer(購自neb公司)4μl，bglii0.8μl，bsteii0.8μl及水26.2μl。於37℃酶切2小時後回收。經過限制性內切酶消化過的表達載體pcambia1301與pbrmir397a基因使用t4dna連接酶(購自neb公司)於16℃連接14-16小時。反應總體積5μl，其中含有10×t4dnaligasebuffer0.5μl，t4dnaligase0.5μl，pbrmir397a基因的雙酶切回收產物3.5μl，pcambia1301載體的雙酶切回收產物0.5μl。取連接產物5μl轉化大腸桿菌感受態dh5α，在含有50mg/l卡那黴素的lb固體平板中篩選出陽性克隆，抽提質粒進行酶切及pcr鑑定，測序結果確定鹼基突變，獲得含有插入目的片段的重組載體，將其命名為pcambia1301-pbrmir397a重組載體，構建完成的載體圖見圖2所示。應用凍融法將重組載體導入到農桿菌gv3101中。
實施例3菸草的遺傳轉化及轉化植株分子鑑定
根癌農桿菌介導的菸草遺傳轉化具體步驟參照黃小三博士畢業論文(2012)[9]。按照上述方法得到轉pbrmir397a的菸草植株，採用小量法提取菸草植株葉片的總dna，以此為模板，採用克隆引物對進行pcr擴增，鑑定陽性苗。反應程序：94℃變性3分鐘，94℃預變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個循環，循環完成後72℃延伸10分鐘。菸草轉基因植株鑑定見圖3。
轉基因菸草pbrmir397a表達水平分析：
轉基因菸草外源基因表達量採用螢光定量q-pcr進行表達水平分析。選取相同發育階段的經pcr鑑定為陽性菸草植株與野生型菸草植株莖幹的第二個節為材料，提取總rna並反轉錄為cdna，螢光定量檢測靶基因的表達量。所用引物為基因特異引物對：seqidno.2和seqidno.3；以u6為內參基因，引物由試劑盒提供(購自takara公司)。real-timepcr所用儀器為roche480定量pcr儀，反應體系為：2×sybrgreenimastermix10μl，上下遊引物(10μm)0.4μl，2μlcdna，7.2μlpcr級別的水。反應條件為95℃變性5min；95℃預變性5s，60℃退火5s，72℃延伸10s重複45個循環；熔解曲線分析65℃到95℃，每5s升高1℃：。螢光定量pcr分析結果如圖4所示，目的基因在轉基因株系中超量表達，野生型中沒有表達。可以看出，目的基因確實已經整合到了菸草植株中，選取397a-3、4、8、11用於隨後的功能的研究。
實施例4轉基因植株的表型觀察
(1)轉基因植株表型觀察
本專利對轉基因菸草莖幹的木質素含量進行測定，發現超表達植株莖杆木質素含量下降了19％-34％(表1)。
表1pbrmir397a過表達菸草植株木質素含量測定
以wt1的木質素含量為100，標準化其他株系的木質素含量。
(2)轉基因菸草莖幹解剖結構觀察
本實驗選取轉基因陽性植株和野生型植株莖幹的第二個節為材料，製備石蠟切片及電鏡切片，用於觀察轉基因菸草與野生型菸草植株莖幹解剖結構的差異。結果表明，pbrmir397a過表達植株中維管束組織細胞數目減少(圖5a-d和圖6a)。405nm紫外光下，發現野生型菸草的木質部有更多的木質素自發螢光(圖5e,f)。pbrmir397a過表達植株木質部細胞的次生細胞壁更薄(圖5g,h和圖6b)。
(3)pbrmir397a超表達影響木質素合成相關基因的表達
為了從木質素合成出發，尋找控制其產生的分子機理，以野生型菸草為對照，對正常生長條件下的轉基因菸草株系397a-8的木質素合成相關基因進行q-pcr檢測(表2),引物序列見表3。結果顯示，轉基因株9個laccase基因表達量相對於野生型菸草下降28-90％，但與laccase基因有相似功能的prx、pod基因表達量有所上升，其他木質素合成結構基因表達量差別不大。因此推測pbrmir397a基因的過表達主要抑制多個laccase基因的表達，使其不能氧化木質素單體使其形成高聚合的木質素，從而影響木質素的合成。
表2轉基因株系397a-8和野生型菸草木質素合成相關基因表達量檢測
表3用於q-pcr檢測的引物
主要參考文獻
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南京農業大學
梨pbrmir397a及其應用
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『碭山酥梨』
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