新型抗腫瘤類化合物及其製造方法

2023-05-29 15:35:11

專利名稱：新型抗腫瘤類化合物及其製造方法
技術領域：
本發明涉及到一類新型的化合物及其製造方法，具體地說，就是由屬於殼二孢屬的黴菌產生的具有抗腫瘤作用的一類化合物。
背景技術：
以前有報告說，蒽環類抗生素、絲裂黴素等很多的化合物可以用作抗腫瘤類抗生素。

發明內容
本發明是以提供新穎抗腫瘤物質及其製造方法作為研究課題的。
本發明者們發現了殼二孢屬黴菌所產生的新型化合物類，並且發現這些化合物具有抗腫瘤活性，從而完成了本發明。
本發明所提供的化合物用下面的結構式表示。

上面的結構式所示的化合物存在數個互變異構體。這幾個互變異構體中，第1個化合物命名為FE399-P1，它是具有下面物理化學性質的互變異構體平衡混合物作為主成分而形成的。
①乾燥物的外觀白色粉末②熔點260～265℃(分解)③溶解性易溶於吡啶、醋酸；可溶於二甲基亞碸、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈中；難溶於水。
④紫外吸收光譜在乙腈溶液中200nm附近有末端吸收。
⑤1H核磁共振光譜(600MHz，氘代吡啶)的化學位移值(δ,單位ppm):9.55(1H,s)、7.97(1H,d)、5.84(1H,t)、5.19(1H,brs)、4.88(1H,s)、4.04(2H,m)、3.65(1H,d)、3.47(1H,d)、2.56(1H,t)、2.37(1H,t)、2.12(1H,m)、1.11～1.51、0.83(1H,t)⑥13C核磁共振光譜(150MHz，溶劑氘代吡啶)的化學位移值(δ，單位ppm):176.001、174.731、171.733、75.383、55.235、55.114、47.820、45.354、36.572、35.866、32.780、26.992、26.932、25.349、22.492、19.208、14.109⑦13C核磁共振光譜(100MHz，溶劑氚代二甲基亞碸)的化學位移值(δ，單位ppm):174.8、173.1、170.3、74.2、53.5、52.6、47.4、44.1、36.0、34.9、32.3、26.9、26.6、26.6、24.8、21.6、18.3、13.7⑧呈色反應磷鉬酸顯色呈陽性茴香醛顯色呈陽性⑨利用薄層層析色譜方法，用下面的展開條件分離。
吸附劑 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展開溶劑氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大約0.32本發明所提供的第2個化合物命名為FE399-P2，它與FE399-P1一起構成一種互變異構平衡混合物。利用薄層層析色譜法，用以下的展開條件分離得到。
吸附劑 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展開溶劑氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大約0.42本發明的第3個化合物命名為FE399-P3，它很可能與上述的FE399-P1及/或FE399-P2一起形成一種互變異構平衡混合物，但也不能排除它是FE399-P1或FE399-P2的部分分解產物的可能性。FE399-P3通過薄層層析色譜法，用以下的展開條件分離得到。
吸附劑 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展開溶劑氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大約0.54另外，本發明也提供含有上述FE399-P1、FE399-P2及FE399-P3中的2種或3種化合物的互變異構平衡混合物。
本發明還提供以在培養基中培養殼二孢屬黴菌，然後從培養基中獲取含有FE399-P1、FE399-P2或FE399-P3或它們的2種或3種的互變異構平衡混合物為特徵的上述化合物或混合物的製造方法。
本發明還提供含有以上述FE399-P1、FE399-P2及FE399-P3中1種或2種以上的混合物作為有效成分的藥物組合物。
以下的內容中把FE399-P1、FE399-P2或FE399-P3稱為「FE399化合物」，把其中的含有2種或3種的互變異構平衡混合物稱為「FE399化合物類」。
下面詳細說明本發明。
本發明的FE399化合物類是從殼二孢屬黴菌的培養物中獲取的。作為殼二孢屬黴菌，例如有本發明者分離得到的殼二孢屬AJ117309菌株(FERM BP-5517)。AJ117309菌株是從紅豆杉科植物紫杉的新鮮葉子中通過下面的方法而分離得到。
紫杉的健康葉子採集於神奈川縣川崎市，用流水洗去表面的汙垢後，用60％乙醇進行表面殺菌1分鐘。立即用消毒水將葉子洗淨後，用消毒刀細切成1平方釐米的切片。將2個這樣的切片放在LCA培養基(葡萄糖1g/L、KH2PO4lg/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、KCl0.2g/L、NaNO32g/L、酵母浸膏0.2g/L、瓊脂15g/L、PH6.5)中，間隔3～4cm，室溫下培養。在第4天或第5天，用細針將培養基上伸長出來的菌絲的尖端挑出來，移植到新的培養基中純化。下面記錄了這樣分離得到的AJ117309菌株的細菌學性質。
(a)在各種培養基中的生長形態在麥芽浸膏瓊脂培養基中的生長旺盛且迅速，25℃條件下5天內菌落直徑為45mm。菌落的表面呈白色綿毛狀，內部先呈白色，後一部分呈暗綠色。沒有發現培養基中有滲出色素和液滴的生成。
在馬鈴薯·葡萄糖瓊脂培養基中的生長旺盛且迅速，25℃條件下5天內菌落直徑為42mm。菌落的表面呈白色綿毛狀，內部剛開始呈白色，後一部分呈暗綠色。沒有發現色素和液滴的生成。
在玉米粉瓊脂培養基中的生長良好，25℃條件下5天內菌落直徑為43mm。菌落的表面呈白色綿毛狀，具有一層比較薄的底層菌絲層。培養基中沒有發現滲漏色素和液滴的生成。
在這些培養基中，沒有發現分生孢子體的形成(但是，在瓊脂中偶爾能見到分生孢子體的形成)。但是，如果在培養基中加入天然基質(滅菌植物葉)後再進行培養，在葉片上就能顯著觀察到分生孢子器的形成。另外，在上述各種培養條件下都無法觀察到完整的世代。
(b)形態狀況放置在麥芽浸膏瓊脂培養基中的葉片上產生的分生孢子器呈暗綠色，球形或類球形，直徑為0.3-0.5mm，中央有孔。發育成熟後由孔口滲漏出白色膏狀孢子。分生孢子呈無色，橢圓-卵圓形，雙細胞(中間有隔)，大小為(6.0～10.0)×(2.0～2.5)um。
生長溫度為10～35℃，最佳生長溫度為22～27℃。另外，生長pH值為3～10。
從以上的細菌學性質來看，根據「腔孢類細菌」(TheCoelomycetes；1980、Commonwealth Mycological Institute公司(英國)，B.C.Sutton著)，該菌可明確地歸類為半知菌亞門、腔孢綱、殼二孢屬，本菌株可命名為殼二孢屬AJ117309。本菌株於1996年4月23日由工業技術院生命工學工業技術研究所(郵政編碼305，日本茨城縣筑波市東一條1段3號)根據布達佩斯條約向申請了國際保藏，並得到保藏號FERM BP-5517。
FE399化合物類是由上述AJ117309菌株等殼二孢屬黴菌在培養基中培養後，從培養基中獲取得到的。
殼二孢屬黴菌的培養例如可按下面的方法進行。在麥芽浸膏瓊脂培養基中接種殼二孢屬黴菌，25℃條件下培養7天。將麥芽浸膏瓊脂培養基切成小塊，接種到含有下列組成的生產培養基的Roux型燒瓶中，25℃條件下靜置培養3周左右。
表1(生產培養基組成/ROux型燒瓶)燕麥粉 20g液體培養基*28ml*液體培養基組成 葡萄糖 2g/l果糖 5蔗糖 8NZ胺 2MgSO4·7H2O0.5KCl 0.5ZnSO4·7H2O0.5KH2PO41(PH6.0)如上方法培養殼二孢屬黴菌後，向每隻Roux型燒瓶中添加100ml丙酮，室溫下萃取30分鐘。分出丙酮層後，減壓濃縮，蒸去丙酮，向剩餘物中加水成水溶液。然後再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，所得到的乙酸乙酯萃取液用飽和氯化鈉水溶液洗淨後，用無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮。剩餘物溶於甲醇中，向其中加入1.2倍體積的正己烷萃取，分出正己烷層後，濃縮甲醇層至幹，剩餘物溶於乙酸乙酯中，4℃條件下靜置數天。待析出結晶後，通過離心操作除去乙酸乙酯溶液。這樣得到的剩餘物再用少量的甲醇洗滌，就得到以FE399-P2為主成分，含有少量FE399-P1和FE399-P3的粗提物。
然後，將上述方法得到的粗提物懸浮於乙腈中，室溫放置一天左右後FE399-P1就成為主成分，含有少量FE399-P2和FE399-P3。
上述粗提物中的FE399化合物例如可以通過薄層層析色譜法來證明。作為吸附劑，可以使用Kieselgel60F254(厚度0.25MM,Merk公司生產)；作為展開溶劑，可以使用氯仿∶甲醇=93∶7，此時FE399-P1、FE399-P2及FE399-P3的Rf值分別為大約0.32,0.42,0.54。
FE399化合物類例如可通過反相高效液相色譜法來進行分離。用表2所示的條件進行反相高效液相色譜層析時，各個FE399化合物的保留時間如下。此時的色譜圖如

圖1所示。圖1中，峰1,2,3分別對應於FE399-P1、FE399-P2、FE399-P3。
表2使用儀器紫外檢測器Waters991(Waters公司生產)泵HITACHIL-6200(日立製造公司生產)層析柱分析用反相高效液相色譜層析柱(CAPCELLPAKC18UG1205um、4.6mmφ×250mm(資生堂(株)生產)洗脫溶劑50％乙腈流速0.8ml/分保留時間(單位分鐘)FE399-P1 大約9.1FE399-P2 大約11.7FE399-P3 大約12.1FE399化合物在乙腈、氯仿、醋酸等有機溶劑中能夠形成至少2種或3種互變異構平衡混合物，根據溶劑、溫度等條件的不同，混合物的主成分亦變化。而且，在這些化合物中，FE399-P1比較穩定。前面所說的FE399化合物的物理化學性質(薄層層析色譜法的Rf值項除外)雖然是關於用高效液相色譜法分離得到的FE399-P1的性質，但所用的原料中也可能含有少量FE399-P2和FE399-P3。
FE399化合物中，至少FE399-P1和FE399-P2是可以用同一個平面結構式(前述的結構式)來表示的互變異構體。FE399-P3也很有可能是互變異構體，但也不能排除它是FE399-P1或FE399-P2的部分分解產物的可能性。
FE399化合物類及精製的FE399化合物的保存條件，例如可以採取乾燥狀態-20℃條件保存的方法。
本發明的FE399化合物具有抗腫瘤作用，可期望用作治療實體癌症及白血病藥品的有效成分。
附圖的簡要說明圖1是FE399化合物類的反相高效液相色譜圖。
圖2是以FE399-P1作為主成分的互變異構平衡混合物的紫外吸收光譜。
圖3是以FE399-P1作為主成分的互變異構平衡混合物的紅外吸收光譜。
圖4是以FE399-P1作為主成分的互變異構平衡混合物的1H核磁共振譜。
圖5是以FE399-P1作為主成分的互變異構平衡混合物的13C核磁共振譜。
本發明的最佳實施方案下面通過實施例具體說明本發明。
實施例1FE399化合物的製備在麥芽浸膏瓊脂培養基中接種殼二孢屬AJ117309菌株，25℃條件下培養7天。另外配製前面表1所列的物質組成的生產培養基，把該培養基放入133隻500ml Rroux型燒瓶中，120℃下加熱滅菌20分鐘。接著，如前所述，把已經培養好的麥芽浸膏瓊脂培養基切成小塊(直徑8mm)，接種到上述生產培養基中，25℃下靜置培養21天。
按照上面的步驟培養AJ117309菌株後，每隻Roux型燒杯中加入100ml丙酮，室溫下萃取30分鐘。收集丙酮層後，減壓濃縮，蒸去丙酮，向剩餘物中加水配成2升水溶液。然後再用2升乙酸乙酯萃取該水溶液3次，所得到的乙酸乙酯萃取液用飽和氯化鈉水溶液洗滌後，用無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮。
剩餘物溶解於500ml甲醇中，加入600ml正己烷萃取，除去正己烷層後，濃縮甲醇層至幹。剩餘物溶解於100ml乙酸乙酯中，4℃條件下靜置2天。待析出結晶後，再通過離心操作除去乙酸乙酯溶液。這樣得到的剩餘物再用少量的甲醇洗滌，得到粗提物190mg。該粗提物用Kieselgel60F254(厚度0.25mm,Merk公司生產)作吸附劑進行薄層層析色譜法(展開溶劑氯仿∶甲醇=93∶7)分離後，5％磷鉬酸乙醇溶液顯色，得到Rf值分別為0.32、0.42、0.54的3個斑點。按次序分別命名為FE399-P1、FE399-P2、FE399-P3。上述粗提物的主成分是FE399-P2。若把該粗提物懸浮於乙腈中室溫放置20小時後，主成分則變為FE399-P1。
將上述得到的以FE399-P1為主成分的混合物減壓濃縮，濃縮液經反相高效液相色譜法(色譜柱Capeell pak C18 S6120、10mmφ×250mm、資生堂(株)公司生產，洗脫溶劑53％乙腈溶液(流速3.5ml/分鐘)，紫外檢測器Waters991(Waters公司生產)，泵HITACHI L-6200(日立製造公司生產))分離，得到FE399-P1及FE399-P2組分。FE399-P1的保留時間為7.5分鐘，FE399-P2為9.7分鐘。
實施例2FE399化合物的結構解析用實施例1的方法分離得到的FE399-P1溶解於氯仿中，室溫放置數小時後，再用和上面相同的條件進行薄層層析展開，分離得到FE399-P1、FE399-P2、FE399-P33個斑點。將每個斑點分別從薄層板上刮下來，用溶劑(氯仿∶甲醇=50∶50)洗脫，得到的FE399化合物再分別在同一條件下進行薄層層析分離，就得到FE399-P1、FE399-P2和FE399-P33個斑點。另外，如前所述，溶解於氯仿中室溫放置數小時後的FE399-P1可以採用前面表2所示的條件進行分析型反相高效液相色譜層析，就可以得到對應於各個FE399化合物的吸收峰。此時各個FE399化合物的保留時間見表2。
從這個結果及實施例1的結果可以判斷，FE399-P1、FE399-P2、FE399-P3形成了互變異構平衡混合物。但是也不能排除FE399-P3是FE399-P1或FE399-P2的部分分解產物的可能性。
實施例1中得到的FE399-P1(以其為主成分的互變異構平衡混合物)的物理性質如前所述。圖2表示的是它的紫外吸收光譜(用島津公司生產的UV-160測定)，圖3表示的是它的溴化鉀壓片紅外吸收光譜(用日本分光生產的IR-810測定)，圖4和圖5分別表示的是它的1H核磁共振光譜(NMR)和13C核磁共振光譜(都是用Brucker公司生產的DMX600，在氚代吡啶中測定)。
根據上述各分析值及13C核磁共振光譜(100MHz，溶劑氘代二甲基亞碸)，可推斷FE399-P1的結構式如下式。13C核磁共振光譜(100MHz，溶劑氘代二甲基亞碸)的歸屬見表3。
表3


實施例3FE399化合物對各種細胞的生長抑制作用精製而得的FE399化合物對各種細胞的增殖抑制作用可以通過以下的條件來測定。
在二氧化碳細胞孵箱中，37℃條件下於含有50IU/ml青黴素(FlowLaboratories公司生產，蘇格蘭)、50ug/ml鏈黴素(公司同前)、10％胎牛血清的100ul RPMI-1640培養基(Sigma公司生產)中培養表3所示濃度的各種細胞20小時。然後向其中加入適當濃度的FE399-P1或FE399-P2，繼續培養3天。但是對P388和K562T來說，在配製完細胞培養液後直接向其中加入FE399化合物類。接著在每個培養基中都加入10ulMTT(溴化3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓)溶液(5mg/ml Dulbecco PBS(-)),37℃下於二氧化碳孵箱內培養4小時。再加入50ul0.01N鹽酸/20％SDS，然後用微板讀數儀(Microplate reader)在570nm處測其吸光度(對照波長630nm)。細胞增殖被抑制50％時的受試藥物濃度(IC50)如表4所示。
表4

表4清楚地說明本發明的FE399化合物對各種癌細胞及腫瘤細胞增殖具有抑制作用。
實施例4FE399化合物類對實體癌的抑癌效果把用體內實驗方法培養於CDF1小鼠皮下的小鼠大腸癌細胞colon-266由皮下取出，在培養皿中破碎，用套針將細胞皮下移植至CDFI小鼠(雌性，4周齡)，濃度為10mg/小鼠。以此為第0天，在第7天測定腫瘤大小和體重，然後將小鼠分組，n=4。腫瘤大小可以根據下面的方程式換算成腫瘤重量。
腫瘤重量(mg)=腫瘤體積(mm3)=1/2×長直徑(mm)×短直徑(mm)2把用實施例1的方法分離得到的FE399-P1的乙腈溶液減壓乾燥後所得的FE399按照下面的步驟給上面的小鼠用藥。給藥量為0.2ml/小鼠，腹腔給藥。FE399溶解於二甲基亞碸中，配製成100mg/ml濃度，再用含有5％吐溫80的生理鹽水調節濃度，最終給藥量為4mg/kg或8mg/kg。
若給藥量為4mg/kg，則在第7天～第11天及第14天～第18天給藥，共10次；若給藥量為8mg/kg，則在第7天、第11天、第14天及第18天給藥，共4次。
不給藥的小鼠作為空白組。另外，作為對照組，在第7天、第11天及第15天給藥順氯氨鉑。這裡所用的FE399是FE399-P1和FE399-P2的混合物。
抑癌效果可以用由腫瘤重量換算成的腫瘤增殖抑制率(IR)來表示。IR可以通過下面的方程式換算。
IR(％)=(1-給藥組的腫瘤重量/空白組的腫瘤重量)×100表5所示的是不同給藥量的IR(第15天及第21天)。從該結果可以看出，FE399化合物在體內亦顯示抗癌作用。
表5

工業上的應用領域本發明提供的是具有抗腫瘤作用的新型化合物。
權利要求
1．下面結構式所示的化合物。
2．權利要求1的化合物，其特徵是，在如下的展開條件下進行薄層色譜分析，吸附劑 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展開溶劑 氯仿∶甲醇=93∶7Rf值 大約0.32。
3．權利要求1的化合物，其特徵是，在如下的展開條件下進行薄層色譜分析，吸附劑 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展開溶劑氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大約0.42。
4．權利要求1的化合物，其特徵是，在如下的展開條件下進行薄層色譜分析，吸附劑 Kieselgel60F254，厚度0.25mm展開溶劑氯仿∶甲醇=93∶7Rf值大約0.54。
5．一種變異構平衡混合物，含有選自權利要求2～4項所示的化合物的2種或3種。
6．上述化合物或混合物的製備方法，其特徵在於，在培養基中培養殼二孢屬黴菌，然後從培養基中獲取含有權利要求1～4項記載的化合物的2種或3種的互變異構平衡混合物。
7．醫藥品組合物，含有以權利要求1～4項的化合物中的1種或1種以上的混合物作為有效成分。
全文摘要
在培養基中培養殼二孢屬黴菌,從培養基中獲取具有下式所示結構,有抗腫瘤作用,可形成互變異構平衡混合物的化合物或它們的混合物。
文檔編號A61K38/00GK1225688SQ97196537
公開日1999年8月11日 申請日期1997年3月14日 優先權日1996年5月20日
發明者大林洋子, 吉村敏彥, 池上由佳, 不藤亮介, 村田正弘, 安東敏彥 申請人:味之素株式會社