一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒及其製備方法

2023-05-30 04:18:46

專利名稱：一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及兩種結核菌蛋白抗原，尤其是涉及一種檢測結核菌蛋白抗原的酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒及其製備方法。
背景技術：
結核病已被列為我國重大傳染病之一，有近一半的人是結核病帶菌者，估計病人數為450萬，年發病人數約為130萬，約佔全球發病的16%。疫情嚴峻的原因與臨床診斷技術和新藥研製滯後、防治不力、結核桿菌與人類免疫缺陷病毒(HIV)雙重感染以及耐藥結核病人數的急劇增加等有關。目前，已有的結核菌ELISA檢測試劑盒主要用於檢測人血清中由結核菌感染所產生的抗體的存在來診斷結核病，例如吳雪瓊等人在申請號為200810224021.6的中國專利申請中，公開了一種結核抗體多抗原ELISA檢測試劑盒及其製備方法。但由於這類診斷方法是建立在正常人體對結核菌入侵能夠產生正常免疫反應並導致血清中出現抗體的基礎上，它對免疫缺陷、免疫力低下的老人與兒童的感染以及結核菌與愛滋病雙重感染等常常造成誤診或漏診，尤其對肺外感染，如結核性腦膜炎、骨結核和腎結核等更加困難，特別對兒童結核性腦膜炎早期的腦脊液中的結核陽性檢出率很低。因此，建立一種簡易可行，敏感特異，可以直接檢測結核病菌蛋白抗原的診斷方法，對於防治結核病將具有重大的經濟和社會效益。抗原檢測一直是確認或評估病原體感染及感染狀況較為可靠的方法，且有早期診斷價值，在其他許多疾病診斷方面獲得廣泛應用。使用此方法檢測結核桿菌，必須獲得結核桿菌特異性抗原。張彩勤等(張彩勤，張海，趙勇，等.結核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B Hspl6. 3和ESAT6在血清學檢測中的初步應用，現代生物醫學進展，2011，3 (11) =401-404) 探討了結核分枝桿菌分泌蛋白Hspl6. 3 Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10 Ag85B_Hspl6. 3 和Ag85B-ESAT6用於TB病人血清學檢測的意義。高源等(高源，萬康林.對結核分支桿菌蛋白抗原研究進展的綜述，中國媒介生物學及控制雜誌，2005 :16(1),74-77)對結核分支桿菌蛋白抗原研究進展進行了綜述。李紅霞(李紅霞，結核分枝桿菌特異性抗原/抗體 ELlSA檢測試劑盒的初步研究，四川大學博士學位論文，2007年5月30日，1-125頁)建立了以多克隆抗體作為包被抗體檢測結核病人血清中特異性抗原的雙抗體夾心ELlSA檢測方法，在我們發明試劑盒過程中結核桿菌特異性抗原的選擇方面具有一定的參考價值。

發明內容
本發明的目的在於提供一種檢測結核菌蛋白抗原的酶聯免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(簡稱為檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒)及其製備方法。本發明採用雙抗體夾心法。所述檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒設有盒體、PBST洗液瓶、四甲基聯苯胺(TMB)顯色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶、PPD蛋白標準樣品瓶、樣品稀釋液瓶、聚苯乙烯酶聯檢測板、終止液瓶、酶標二抗瓶和上層檢測抗體瓶；所述PBST洗液瓶、四甲基聯苯胺顯色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶、PPD蛋白標準樣品瓶、樣品稀釋液瓶、聚苯乙烯酶聯檢測板、終止液瓶、酶標二抗瓶和上層檢測抗體瓶設在盒體內；所述四甲基聯苯胺顯色液瓶包括顯色A液瓶和顯色B液瓶；所述上層檢測抗體瓶包括CFP10-ESAT6多克隆抗體瓶和陽性抗結核菌體多克隆抗體瓶；所述顯色A液的組成為液醋酸鈉(CH3C00Na)0. 272g，檸檬酸 (C6H8O7 · H2O) 0. 032g,雙氧水(H2O2 30% )6μ 1，蒸餾水加至IOml ；所述顯色B液的組成為 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)0. 004g，檸檬酸(C6H8O7 · H2O) 0. 019g，甘油(C3H8O3) 1ml，四甲基聯苯胺(TMB)O. 004g，蒸餾水加至IOml ；所述終止液為2M H2SO4終止液。所述聚苯乙烯酶聯檢測板可採用真空包裝的聚苯乙烯酶聯檢測板；所述2M H2SO4終止液瓶可採用20ml/支。所述酶標二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠抗體20 μ 1/支分裝。所述一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的製備方法包括以下步驟1)配製實驗試劑(1)包被液(0. IM碳酸鹽緩衝液)ρΗ 9. 6碳酸鈉(Na2CO3)0. 0318g碳酸氫鈉(NaHCO3)0. 0586g蒸餾水加至20ml(2)磷酸鹽緩衝液(PBS) (10 X濃縮)
氯化鈉(NaCl)16g
氯化鉀(KCl)OAg
磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.48g
磷酸氫二鈉(Na2HP04.12H20)7.16g
蒸餾水加至200ml用HCL/NaOH 調 pH 至 7. 4(3)封閉液 BSA/PBS)正常牛血清白蛋白(BSA)0. 5gIXPBS25ml(4)0. 2% BSA/PBS(樣品稀釋液)2% BSA/PBS2ml蒸餾水加置20ml( PBST 洗液10XPBSIOOml吐溫-200. 5ml蒸餾水加至IOOOml (6)辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(已商品化)，20 μ 1/支分裝。
(7)顯色 A 液
液醋酸鈉(CH3COONa) 檸檬酸(C6H8OrH2O) 雙氧水(H2O2 30%)
蒸餾水加至(8)顯色 B 液
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 檸檬酸(C6H8OrH2O) 甘油(C3H8O3) 四甲基聯苯胺(TMB)
蒸餾水加至(9) 2MH2SO4 終止液取&S04 1. 105ml，加入到18. 92ml的水中，混勻即可。2)捕獲抗體(CFP10-ESAT6單克隆抗體)的包被將捕獲抗體用包被液稀釋至2 4 μ g/ml，按50 100 μ 1/孔的體積加入聚苯乙烯酶聯檢測板(以下簡稱酶標板)中，4°C過夜或37°C孵育2 4h後，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹；在步驟2、中，所述包被液可採用pH 9. 6的碳酸鹽溶液；所述過夜前可用保鮮膜包裹防止蒸發，過夜的溫度可為4°C ；所述PBST洗液可採用含有0. 05%吐溫-20的PBS緩衝溶液，所述洗滌可洗滌3 5次。3)酶標板的封閉與保存將步驟2、中拍幹後的酶標板上的每孔加200 μ 1或加滿封閉液，37°C孵育1 池後，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹，真空包裝後保存於4°C冰箱(經此步驟操作得到的酶標板為檢測試劑盒的組成部分之一)；在步驟幻中，所述每孔加封閉液的量可為每孔加200 μ 1或加滿，所述封閉液可採用 2% BSA，所述孵育的時間可為1 濁，所述PBST洗液可採用含有0. 05%吐溫-20 的PBS緩衝溶液，所述洗滌可洗滌3 5次。4)製備試劑盒其它試劑樣品(1)製備CFP10-ESAT6蛋白標準樣品和PPD蛋白標準樣品將CFP10-ESAT6蛋白用 PBS 稀釋成 2000 4000ng/ml，PPD 蛋白用 PBS 稀釋成 2000 4000ng/ml，300 μ 1/ 支分裝。(2)製備上層檢測抗體上層檢測抗體包括CFP10-ESAT6多克隆抗體和陽性抗結核菌體多克隆抗體，20 μ 1/支分裝。本發明針對目前所廣泛採用的結核病免疫學檢測方法的局限，選定以檢測結核病菌蛋白抗原為主攻方向，提供了一種能夠快速，敏感特異地鑑定結核菌蛋白抗原的ELISA檢測試劑盒。本發明所述的雙抗體夾心法檢測結核菌蛋白抗原的ELISA試劑盒及製備方法具有快速、簡易、較好的靈敏度和特異性，儘管尚需對不同結核病人樣品加以進一步研究與確定，但這一試劑盒及其製備方法的建立無疑為檢測結核病菌的特異蛋白抗原，提供結核病輔助診斷，保護人群健康開闢了新的思路和方法。本試劑盒可成為結核病的診斷手段之一， 為結核病的防治提供技術支持。


圖1為ELISA法篩選能識別結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)的多克隆抗體。在圖 1中，橫坐標為抗體稀釋度，縱坐標為吸光值G50nm)；標記▲為HspX多抗， 為CE6多抗， ■為陽性兔血清， 為陰性兔血清。圖2為ELISA法篩選能識別結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)的單克隆抗體。在圖2中，橫坐標為抗體稀釋度，縱坐標為吸光值G50nm)；標記■為mAg^b，▲為mCE6，M為 mET6， 為mHspX, 為ρ陰性多抗。圖3為ELISA法篩選能識別結核菌特異融合蛋白CFP10-ESAT6的多克隆抗體。在圖3中，橫坐標為抗體稀釋度，縱坐標為吸光值G50nm)；標記■為CE6多抗， 為Ag^b多抗，▲為陽性兔血清， 為陰性兔血清，■為HspX多抗。圖4為ELISA法篩選能識別結核菌特異融合蛋白CFP10-ESAT6的單克隆抗體。在圖4中，橫坐標為抗體稀釋度，縱坐標為吸光值G50nm)；標記 為HspX單抗，■為ET6單抗，▲為CE6單抗， 為Ag^b單抗。圖5為CFP10-ESAT6單克隆抗體(mCE6)與陽性抗結核菌體多克隆抗體組合配對檢測結核菌素蛋白(PPD)。在圖5中，橫坐標為抗原濃度(ng/ml)，縱坐標為吸光值050歷)； 標記 為1實驗組， 為2陰性對照組，▲為3陰性對照組。圖6為CFP10-ESAT6多克隆抗體作為捕獲抗體與其單克隆抗體配對檢測結核菌特異蛋白CFP10-ESAT6。在圖6中，橫坐標為抗原濃度(ng/ml)，縱坐標為吸光值G50nm)；標記 為1實驗組，■為2陰性對照組，▲為3陰性對照組， 為4陰性對照組。圖7為CFP10-ESAT6單克隆抗體作為捕獲抗體與其多克隆抗體配對檢測結核菌特異蛋白(抗原)CFP10-ESAT6。在圖7中，橫坐標為抗原濃度(ng/ml)，縱坐標為吸光值 (450nm)；標記 為1實驗組， 為2陰性對照組，▲為3陰性對照組，■為4陰性對照組。圖8為本發明所述檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒實施例的結構組成示意圖。
具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。圖8給出本發明所述檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒實施例的結構組成示意圖。所述檢測結核菌蛋白(抗原)的試劑盒實施例設有盒體P、PBST洗液瓶1、顯色A液瓶21、顯色B液瓶22、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶3、PPD蛋白標準樣品瓶4、樣品稀釋液瓶5、聚苯乙烯酶聯檢測板6、2M H2SO4終止液瓶7、酶標二抗瓶8、CFP10-ESAT6多克隆抗體瓶91 和陽性抗結核菌體多克隆抗體瓶92 ；所述PBST洗液瓶1、顯色A液瓶21、顯色B液瓶22、 CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶3、PPD蛋白標準樣品瓶4、樣品稀釋液瓶5、聚苯乙烯酶聯檢測板6、2M H2804終止液瓶7、酶標二抗瓶8、CFP10-ESAT6多克隆抗體瓶91和陽性抗結核菌體多克隆抗體瓶92設在盒體P內。所述聚苯乙烯酶聯檢測板6可採用真空包裝的聚苯乙烯酶聯檢測板。所述2M H2SO4終止液瓶採用ianl/支。所述酶標二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠抗體20 μ 1/支分裝。以下給出所述一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的製備方法，包括以下步驟1)配製實驗試劑(1)包被液(0. IM碳酸鹽緩衝液)ρΗ 9.6碳酸鈉(Na2CO3)0. 0318g碳酸氫鈉(NaHCO3)0. 0586g蒸餾水加至20ml(2)磷酸鹽緩衝液(PBS) (10 X濃縮)
氯化鈉(NaCl)16g
氯化鉀(KCl)0.4g
磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.48g
磷酸氫二鈉(Na2HP04.12H20)7.16g
蒸餾水加至200ml用HCL/NaOH 調 pH 至 7. 4(3)封閉液 BSA/PBS)正常牛血清白蛋白(BSA)0. 5gIXPBS25ml(4)0. 2% BSA/PBS(樣品稀釋液)2% BSA/PBS2ml蒸餾水加置20ml( PBST 洗液10XPBSIOOml吐溫-200. 5ml蒸餾水加至IOOOml(6)辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(商品化)，20μ 1/支分裝。(7)顯色 A 液
液醋酸鈉(CH3COONa)0.272g
檸檬酸(C6H8OrH2O)0.032g雙氧水(H2O2 30%)6 μ 1
蒸餾水加至IOml(8)顯色 B 液
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)0.004g
檸檬酸(C6H8OrH2O)0.019g
甘油(C3H8O3)Iml
四甲基聯苯胺(TMB)0.004g
蒸餾水加至IOml(9) 2M H2SO4 終止液取H2SO4 1. 105ml，力口入至Ij 18. 92ml的水中，混勻即可。2)捕獲抗體(CFP10-ESAT6單克隆抗體)的包被將捕獲抗體用包被液稀釋至2 4 μ g/ml，按50 100 μ 1/孔的體積加入酶標板中，4°C過夜或37°C孵育2 4h後，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹；在步驟幻中，所述包被液可採用pH 9. 6的碳酸鹽溶液；所述過夜前可用保鮮膜包裹防止蒸發，過夜的溫度可為4°C ；所述PBST洗液可採用含有0. 05%吐溫-20的PBS緩衝溶液，所述洗滌可洗滌3 5次。3)酶標板的封閉與保存將步驟2、中拍幹後的酶標板上的每孔加200 μ 1或加滿封閉液，37°C孵育1 池後，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹，真空包裝後保存於4°C冰箱(經此步驟操作得到的酶標板為檢測試劑盒的組成部分之一)；在步驟幻中，所述每孔加封閉液的量可為每孔加200 μ 1或加滿，所述封閉液可採用1 2% BSA，所述孵育的時間可為1 濁，所述PBST洗液可採用含有0. 05%吐溫-20 的PBS緩衝溶液，所述洗滌可洗滌3 5次。4)製備試劑盒其他實際樣品(1)製備CFP10-ESAT6蛋白標準樣品和PPD蛋白標準樣品將CFP10-ESAT6蛋白用 PBS 稀釋成 2000 4000ng/ml，PPD 蛋白用 PBS 稀釋成 2000 4000ng/ml，300 μ 1/ 支分裝。(2)製備上層檢測抗體上層檢測抗體包括CFP10-ESAT6多克隆抗體和陽性抗結核菌體多克隆抗體，20 μ 1/支分裝。圖1給出ELISA法篩選能識別結核菌素蛋白(PPD)的多克隆抗體。利用所獲得和純化的，針對CFP10-ESAT6 (CE6)、HspX抗原的多克隆抗體，以及抗結核菌體蛋白陽性兔多克隆抗體(陽性兔血清)進行識別結核菌素蛋白(PPD)的測試，以陰性兔血清為陰性對照，用2 μ g/ml的PPD包被，每個抗體採用梯度稀釋法進行測試(稀釋範圍從1 400至 1 51200)。結果顯示這些多克隆抗體都可以識別人結核菌素蛋白PPD，其中以抗結核菌陽性多克隆抗體識別PPD的效價最高。圖2給出ELISA法篩選能識別結核菌素蛋白(PPD)的單克隆抗體。利用所獲得的抗Ag85b，CFP10-ESAT6 (CE6)，ESAT6 (ET6)和抗HspX結核菌蛋白的單克隆抗體進行識別人結核菌素蛋白PPD的測試。用2μ g/ml的PPD包被酶標板，各個抗體做梯度稀釋(稀釋範圍從1 1600至1 51200)檢測，陰性多克隆抗體為對照。結果顯示，CFP10-ESAT6 (CE6) 單克隆抗體識別結核菌素蛋白(PPD)的效果最好。
圖3給出ELISA法篩選能識別結核菌特異融合蛋白CFP10-ESAT6的多克隆抗體。用2μ g/ml純化好的結核菌特異融合蛋白CFP10-ESAT6包被酶標板，對各個採用梯度稀釋法(稀釋範圍從1 400至1 51200)稀釋的多克隆抗體如CFP10-ESAT6(CE6)， Ag85b，HspX，結核菌體蛋白陽性兔多克隆抗體進行檢測，用陰性兔血清為對照。結果顯示， CFP10-ESAT6多克隆抗體識別CFP10-ESAT6融合蛋白的效價最高，其次為結核菌體蛋白陽性兔多克隆抗體，其餘為陰性。圖4給出ELISA法篩選能識別結核菌特異融合蛋白CFP10-ESAT6的單克隆抗體。用2 μ g/ml純化了的結核菌特異融合蛋白CFP10-ESAT6包被酶標板，將抗融合蛋白 CFP10-ESAT6，HspX，ESAT6，Ag^b的單克隆抗體分別梯度稀釋後檢測(稀釋範圍從1 400 至1 51200)，結果顯示CFP10-ESAT6單克隆抗體識別CFP10-ESAT6融合蛋白的效價最高， 其餘單克隆抗體識別該融合蛋白的效價都比較低。圖5給出CFP10-ESAT6單克隆抗體(mCE6)與陽性抗結核菌體多克隆抗體組合配對檢測結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)。以3μ g/ml的CFP10-ESAT6單克隆抗體做捕獲抗體，陽性抗結核菌體多克隆抗體為上層檢測抗體，其稀釋度為1 2500。用該組合配對檢測結核菌素純化蛋白衍生物 (PPD)的效果比用陽性多克隆抗體做捕獲抗體和用CFP10-ESAT6單克隆抗體做檢測抗體要好，可以分辨出結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)的最低濃度約為125ng/ml。圖中1號為實驗組，用3μ g/ml的CFP10-ESAT6單克隆抗體包被，檢測抗原為經梯度稀釋的人結核菌素 PPD (稀釋範圍從4000ng/ml到Ong/ml)，上層檢測抗體為陽性抗結核菌體多克隆抗體(稀釋度為1 2500)。2號為陰性對照組，用3 μ g/ml的CFP10-ESAT6單克隆抗體包被；檢測抗原為經梯度稀釋的結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)(稀釋範圍從4000ng/ml到Ong/ml)； 上層檢測抗體為陰性多克隆抗體(稀釋度為1 2500)。3號為陰性對照組，用3μ g/ml的 CFP10-ESAT6單克隆抗體包被，檢測抗原為經梯度稀釋的Ag^b蛋白(稀釋範圍從4000ng/ ml到Ong/ml)，上層檢測抗體為陽性多克隆抗體(稀釋度為1 2500)。圖6和圖7給出以CFP10-ESAT6多克隆抗體和CFP10-ESAT6單克隆抗體配對組合檢測結核菌特異蛋白CFP10-ESAT6。其中圖6給出以CFP10-ESAT6多克隆抗體為捕獲抗體， CFP10-ESAT6單克隆抗體為檢測抗體配對檢測結核菌特異蛋白CFP10-ESAT6。以稀釋2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗體做捕獲抗體，3 μ g/ml的CFP10-ESAT6 單克隆抗體為上層檢測抗體檢測結核菌融合蛋白CFP10-ESAT6，測出其最低濃度可達約 15ng/ml。圖中1號為實驗組，以稀釋2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗體包被，檢測抗原為 CFP10-ESAT6蛋白(稀釋範圍從1000ng/ml到Ong/ml)，上層檢測抗體為CFP10-ESAT6單克隆抗體(稀釋濃度為3 μ g/ml)。2號為陰性對照組，以稀釋2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗體包被，檢測抗原為結核菌特異蛋白Ag85b (稀釋範圍從lOOOng/ml到Ong/ml)，上層檢測抗體為CFP10-ESAT6單克隆抗體(稀釋濃度為3 μ g/ml)。3號為陰性對照組，以稀釋 2500倍的CFP10-ESAT6多克隆抗體包被，檢測抗原為CFP10-ESAT6 (稀釋範圍從1000ng/ml 到Ong/ml)；上層檢測抗體為Ag^b單克隆抗體(稀釋濃度為3 μ g/ml)。4號為陰性對照組，以稀釋2500倍的陰性多克隆抗體包被，檢測抗原為CFP10-ESAT6(稀釋範圍從IOOOng/ ml到Ong/ml)；上層檢測抗體為CFP10-ESAT6單克隆抗體(稀釋濃度為3 μ g/ml)。圖7給出以CFP10-ESAT6單克隆抗體為捕獲抗體，CFP10-ESAT6多克隆抗體為檢測抗體配對檢測結核菌特異蛋白CFP10-ESAT6。以3 μ g/ml的CFP10-ESAT6單克隆抗體做捕獲抗體，稀釋2500倍的CFP10-ESAT6 多克隆抗體做為上層檢測抗體檢測結核菌融合蛋白CFP10-ESAT6比以CFP10-ESAT6多克隆抗體做為捕獲抗體的效果更好，可以分辨出結核菌素蛋白(PPD)的最低濃度可達約 lOng/ml。圖中1號為實驗組，用3 μ g/ml的CFP10-ESAT6單克隆抗體包被，檢測抗原為 CFP10-ESAT6(稀釋範圍從2000ng/ml到Ong/ml)，上層檢測抗體為CFP10-ESAT6多克隆抗體(稀釋度為1 2500)。2號為陰性對照組，用3 μ g/ml的CFP10-ESAT6單克隆抗體包被，檢測抗原為CFP10-ESAT6 (稀釋範圍從2000ng/ml到Ong/ml)，上層檢測抗體為陰性多克隆抗體(稀釋度為1 2500)。3號為陰性對照組，用3 μ g/ml的CFP10-ESAT6單克隆抗體包被，檢測抗原為結核菌特異抗原Ag85b (稀釋範圍從2000ng/ml到Ong/ml)；上層檢測抗體為CFP10-ESAT6多克隆抗體(稀釋度為1 2500)。4號為陰性對照組，用3 μ g/ml的 Ag85b單克隆抗體包被；檢測抗原為CFP10-ESAT6 (稀釋範圍從2000ng/ml到Ong/ml)，上層檢測抗體為CFP10-ESAT6多克隆抗體(稀釋度為1 2500)。經過大量的實驗測試，篩選出了兩對適合用夾心ELISA配對檢測結核菌蛋白(抗原)的抗體，它們分別為CFP10-ESAT6單克隆抗體和CFP10-ESAT6多克隆抗體配對，用於檢測CFP10-ESAT6結核菌融合蛋白(圖7) ；CFP10-ESAT6單克隆抗體和陽性抗結核菌體多克隆抗體配對，用於檢測結核菌素蛋白(PPD)(圖5)。並對抗體配對條件，結核菌蛋白(抗原)包被濃度，捕獲抗體和檢測抗體的稀釋比例，結核菌特異蛋白的檢測濃度，抗體位置， 標準曲線的製備等條件進行摸索和優化。發明了這個檢測結核菌蛋白(抗原)的ELISA試劑盒。本發明中所檢測的兩種結核桿菌特異性抗原標誌物為結核菌素蛋白(PPD)和 CFP10-ESAT6結核菌融合蛋白。其中，結核菌素蛋白(PPD)是從結核桿菌培養濾液中獲得的複合蛋白質，含有多種抗原成分，是較早就被用於建立ELISA方法檢測結核病的混合抗原，雖然用作為檢測抗原存在特異性低的缺點，但是目前還沒有發現在檢測效果上可以完全取代PPD的其他抗原。CEPlO和ESAT6都是結核桿菌早期分泌的蛋白，用於檢測結核桿菌的特異性較強，而且據文獻報導，以CFP10-ESAT6結核菌融合蛋白作為檢測抗原的靈敏度可達到77.3%。因此，我們的試劑盒採用雙抗體ELISA夾心法對結核菌素蛋白(PPD)和 CFP10-ESAT6結核菌融合蛋白進行聯合檢測，能有效地提高對結核桿菌檢測的特異性和靈敏度。本發明利用基因工程和蛋白重組技術，獲得了一些重組的結核菌特異蛋白如結核分枝桿菌培養濾過蛋白10 (Culture filtrate protein 10，簡寫為CFP10)和早期分泌性抗原靶6(Early secretory antigen target 6，簡寫為ESAT6)的融合蛋白(簡寫為 CFP10-ESAT6)；抗原85複合蛋白質b (簡寫為Ag85b)和熱休克蛋白X (Heat shock protein X，簡寫為HspX)，結核菌素蛋白(PPD)等，並利用這些結核菌特異蛋白以及滅活的結核菌株免疫動物製備了相應的多克隆和單克隆抗體，分別獲得了針對Ag85b、CFP10-ESAT6、ESAT6、 HspX抗原的單克隆抗體和多克隆抗體，以及陽性抗結核菌體兔多克隆抗體(陽性兔血清)， 和陰性抗結核菌體兔多克隆抗體(陰性兔血清)並對這些單克隆和多克隆抗體進行了純化。將純化後的這些單克隆和多克隆抗體進行各種優化組合配對並測試不同抗體的靈敏度和效價，旨在尋找一對能識別同一結核菌蛋白的抗體並配製檢測試劑盒。經反覆篩選，根據圖1 4的結果，本發明篩出了兩對適合用夾心ELISA配對檢測結核菌蛋白的抗體，分別為 CFP10-ESAT6單克隆抗體和CFP10-ESAT6多克隆抗體配對可用於檢測CFP10-ESAT6結核菌融合蛋白；CFP10-ESAT6單克隆抗體和陽性抗結核菌體多克隆抗體配對可用於檢測結核菌素蛋白(PPD)。本發明針對這兩對抗體組合進行了結核菌蛋白抗原包被濃度，捕獲抗體和檢測抗體的稀釋比例，結核菌特異蛋白的檢測濃度，抗體位置等條件的摸索和優化。結果表明， CFP10-ESAT6單克隆抗體和CFP10-ESAT6多克隆抗體配對可以達到檢測結核菌融合蛋白 CFP10-ESAT6的效果(圖6，7)，而以CFPl0-ESAT6單克隆抗體做捕獲抗體，CFP10-ESAT6 多克隆抗體做檢測抗體的組合檢測效果更好，最微量的CFP10-ESAT6蛋白檢測濃度可達 lOng/ml (圖7) ；CFP10-ESAT6單克隆抗體和陽性抗結核菌體多克隆抗體配對可以達到檢測人結核菌素蛋白(PPD)的效果，而以CFP10-ESAT6單克隆抗體做捕獲抗體，陽性抗結核菌體多克隆抗體做檢測抗體的檢測效果更好，最微量的結核菌素蛋白(PPD)檢測濃度可達 125ng/ml (圖5)。我們採用配對效果最好的兩對抗體組合，發明了這個檢測結核菌蛋白(抗原)的ELISA試劑盒。它的特點是採用雙抗體ELISA夾心法同時進行聯合檢測兩種結核菌蛋白(抗原)，能有效地提高對結核桿菌檢測的特異性和靈敏度。以下給出所述檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的使用方法1)加入標準樣品及待測樣品取出製作的已封閉的酶標板，前4列每孔預先加入ΙΟΟμ 1樣品稀釋液，取 100μ 1CFP10-ESAT6蛋白標準樣品加入第1列的第1孔，在第1孔混勻後取100 μ 1加入第 2 ？L依次向下倍比稀釋，第2列操作重複第1列；取100 μ 1 PPD蛋白標準樣品加入第3列的第1孔，在第1孔混勻後取100μ 1加入第2孔，依次向下倍比稀釋，第4列操作重複第3 列；其餘各孔可用於加待測樣品(如病人血清，痰液等)，每孔加50 100μ 1，每個待測樣品加樣2次。37°C孵育1 池，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹。2)加上層檢測抗體將上層檢測抗體(抗體A :CFP10-ESAT6多克隆抗體；抗體B 抗陽性結核菌體多克隆抗體)分別用樣品稀釋液稀釋2500倍。向上述用CFP10-ESAT6蛋白標準樣品孵育過的第1、2列中按100μ 1/孔的量加入稀釋的CFP10-ESAT6多克隆抗體；向用PPD蛋白標準樣品孵育過的第3、4列中按100 μ 1/孔的量加入稀釋的陽性抗結核菌體多克隆抗體；用同一待測樣品孵育的兩個孔，其中一個加100μ 1稀釋後的CFP10-ESAT6多克隆抗體，另一孔加陽性抗結核菌體多克隆抗體。37°C孵育1 1.證，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹。幻加入酶標二抗將試劑盒中的二抗用樣品稀釋液稀釋5000 8000倍，按100μ 1/孔的量加入上一步的酶標板中，37°C孵育45 60分鐘，用PBST洗液洗滌4 5次，拍幹；4)顯色反應 將含顯色A液和顯色B液等體積混合，按100 μ 1/孔的體積加入酶標板，避光顯色 5 IOmin ；5)終止反應將終止液，按100 μ 1/孔的體積加入酶標板以終止顯色反應；
6)讀數:用酶標儀以450nm單波長測定各孔吸光值，作圖分析。將酶標板第1、2兩排的讀值取平均值，繪製吸光值隨CFP10-ESAT6蛋白濃度變化的標準曲線；同理將第3、4兩排的讀值取平均值，繪製吸光值隨PPD蛋白濃度變化的標準曲線；根據讀取的待測樣品吸光值分別帶入在所對應的標準曲線，計算出樣品中CFP10-ESAT6蛋白和PPD蛋白的含量，以此作為診斷結核病的參考值。
權利要求
1.一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特徵在於設有盒體、PBST洗液瓶、四甲基聯苯胺顯色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶、PPD蛋白標準樣品瓶、樣品稀釋液瓶、聚苯乙烯酶聯檢測板、終止液瓶、酶標二抗瓶和上層檢測抗體瓶；所述PBST洗液瓶、四甲基聯苯胺顯色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶、PPD蛋白標準樣品瓶、樣品稀釋液瓶、聚苯乙烯酶聯檢測板、終止液瓶、酶標二抗瓶和上層檢測抗體瓶設在盒體內；所述四甲基聯苯胺顯色液瓶包括顯色A液瓶和顯色B液瓶；所述顯色A液的組成為液醋酸鈉(CH3COONa) 0. 272g，檸檬酸(C6H8O7 -H2O) 0. 032g，雙氧水(H2O2 30% ) 6 μ 1，蒸餾水加至IOml ；所述顯色B液的組成為乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)0.004g，檸檬酸(C6H8O7 · H2O) 0. 019g，甘油(C3H8O3) Iml, 四甲基聯苯胺(TMB)O. 004g，蒸餾水加至IOml ；所述上層檢測抗體瓶包括CFP10-ESAT6多克隆抗體瓶和陽性抗結核菌體多克隆抗體瓶；所述終止液為2MH2S04終止液。
2.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特徵在於所述聚苯乙烯酶聯檢測板採用真空包裝的聚苯乙烯酶聯檢測板。
3.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特徵在於所述2MH2SO4 終止液瓶採用20ml/支。
4.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特徵在於所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體，20 μ 1/支分裝。
5.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)配製實驗試劑(1)包被液0.IM碳酸鹽緩衝液，PH 9. 6，所述碳酸鹽緩衝液的組成為碳酸鈉 0. 0318g，碳酸氫鈉0. 0586g，蒸餾水加至20ml ；(2)磷酸鹽緩衝液10X濃縮，所述磷酸鹽緩衝液的組成為氯化鈉16g，氯化鉀0.4g， 磷酸二氫鉀0. 48g，磷酸氫二鈉7. 16g，蒸餾水加至200ml，用HCL/NaOH調pH至7. 4 ；(3)封閉液2% BSA/PBS,所述封閉液的組成為正常牛血清白蛋白0. 5g， lXPBS25ml ；(4)樣品稀釋液0.2% BSA/PBS，所述樣品稀釋液的組成為2% BSA/PBS^il，蒸餾水加置 20ml ；(5)PBST洗液所述PBST洗液的組成為10XPBSlOOml,吐溫-200.5ml，蒸餾水加至 IOOOml (6)辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG，20y1/支分裝；(7)顯色A液所述顯色A液的組成為液醋酸鈉0.272g，檸檬酸0. 032g,雙氧水6 μ 1， 蒸餾水加至IOml ；(8)顯色B液所述顯色B液的組成為乙二胺四乙酸二鈉0.004g,檸檬酸0. 019g,甘油1ml，四甲基聯苯胺0. 004g，蒸餾水加至IOml ；(9)2MH2SO4終止液取H2SO4 1. 105ml，加入到18. 92ml的水中，混勻即可；2)捕獲抗體CFP10-ESAT6單克隆抗體的包被將捕獲抗體用包被液稀釋至2 4 μ g/ml，按50 100 μ 1/孔的體積加入聚苯乙烯酶聯檢測板中，4°C過夜或37°C孵育2 4h後，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹；3)聚苯乙烯酶聯檢測板的封閉與保存將步驟幻中拍幹後的聚苯乙烯酶聯檢測板上的每孔加200 μ 1或加滿封閉液，37°C孵育1 池後，用PBST洗液洗滌3 5次，拍幹，真空包裝後保存於4°C冰箱；4)製備試劑盒其它試劑樣品(1)製備CFP10-ESAT6蛋白標準樣品和PPD蛋白標準樣品將CFP10-ESAT6蛋白用PBS 稀釋成2000 4000ng/ml，PPD蛋白用PBS稀釋成2000 4000ng/ml，300 μ 1/支分裝；(2)製備上層檢測抗體上層檢測抗體包括CFP10-ESAT6多克隆抗體和陽性抗結核菌體多克隆抗體，20 μ 1/支分裝。
6.如權利要求5所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的製備方法，其特徵在於在步驟幻中，所述包被液採用PH 9. 6的碳酸鹽溶液；所述過夜前用保鮮膜包裹防止蒸發，過夜的溫度為4°C。
7.如權利要求5所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的製備方法，其特徵在於在步驟2~)中，所述PBST洗液採用含有0. 05 %吐溫-20的PBS緩衝溶液。
8.如權利要求5所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的製備方法，其特徵在於在步驟幻中，所述每孔加封閉液的量為每孔加200μ1或加滿，所述封閉液採用 2% BSA。
9.如權利要求5所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的製備方法，其特徵在於在步驟幻中，所述孵育的時間為1 池，所述PBST洗液採用含有0. 05%吐溫-20的PBS緩衝溶液。
全文摘要
一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒及其製備方法，涉及兩種結核菌蛋白抗原。試劑盒設有盒體、PBST洗液瓶、四甲基聯苯胺顯色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶、PPD蛋白標準樣品瓶、樣品稀釋液瓶、聚苯乙烯酶聯檢測板、終止液瓶、酶標二抗瓶和上層檢測抗體瓶；配製實驗試劑；捕獲抗體的包被；酶標板的封閉與保存；製備試劑盒其它試劑樣品。採用的雙抗體夾心法檢測結核菌蛋白抗原的ELISA試劑盒及製備方法具有快速、簡易、較好的靈敏度和特異性，建立無疑為檢測結核病菌的特異蛋白抗原，提供結核病輔助診斷，保護人群健康開闢了新的思路和方法。試劑盒可成為結核病的診斷手段之一，為結核病的防治提供技術支持。
文檔編號G01N21/31GK102426232SQ20111026215
公開日2012年4月25日 申請日期2011年9月6日 優先權日2011年9月6日
發明者於佔嬌, 李曉彤, 楊贇 申請人:廈門大學