一種採用固定化酶生產毛蕊花糖苷的方法

2023-10-17 11:44:39 2

專利名稱：一種採用固定化酶生產毛蕊花糖苷的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用新鮮肉蓯蓉通過工業固定化酶反應器催化轉化生產毛蔬花糖苷的方法。
背景技術：
肉蓯蓉(HerbaCistanches)是列當科(Orobanchaceae)肉灰蓉辱(0^"c/ze Hoffmg.et Link)多年寄 生草本植物，《神農本草經》等歷代經書記載，肉蓯蓉藥性平和，補而不峻，養而不燥，具有補腎陽、 益精血、潤腸通便的作用；用於男子陽痿、女子不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、血枯便秘等症的治療。 現代藥理學研究表明，肉蓯蓉具有廣泛的藥理作用，對提高機體免疫功能，調節神經系統，內分泌系 統，心肌保護，補腎助陽，抗衰老，增強記憶功能和神經保護等作用明顯。
分析表明，肉蓯蓉的主要活性成分為苯乙醇苷類、苯甲醇苷類、環烯醚砲苷類、木脂素苷類、低 聚糖類衍生物、D-甘露醇和甜菜鹼等。苯乙醇苷類(Phenylethanoid Glycosides, Ph Gs)包括松果菊苷 (Echinacoside)、毛蕊花糖苷(Acteoside)等活性物質。通過腸內菌代謝研究發現，苯乙醇苷類成分 在胃腸道中的運動軌跡，包括體內吸收、分布、代謝和排洩過程變化規律，隨個體間腸內菌群的差別 及對藥物前體代謝能力的差別，而顯示出生物利用度與療效存在顯著差異。苯乙醇苷類化合物的主要 成分松果菊苷在胃腸道中運動過程需經大腸內微生物酶催化轉化為毛蕊花糖苷的代謝通道，是導致口 服後苯乙醇苷類成分藥物生物利用度與療效存在顯著差異的主要因素。毛藍花糖苷單體化合物具有小 分子和低極性的特徵，在藥物吸收中展示良好的吸收率和特殊的藥理活性。

發明內容
本發明的目的是提供一種採用新鮮肉蓯蓉通過工業固定化酶反應器催化轉化生產毛森花糖苷的方法。
本發明的方法是，將新鮮肉蓯蓉肉質莖，經高溫滅酶、細胞破碎、漿液提取，將得到的肉灰蓉細 胞漿液作為催化反應底物，以(3-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，進行催化反應，催,
化水解底物中的松果菊苷使其葡萄糖基配體末端斷裂、定向轉化為高活性的毛蔬花糖苷單體化合物； 催化反應過程溫度為38'C 6(TC， pH為4.0 5.8;時間為4h 9h，催化反應過程反應物中的p-葡萄 糖苷酶活力為20U/g 1200U/g;將經催化反應後的肉蓯蓉細胞槳液，再通過分離提純工藝及濃縮、幹 燥工藝，獲得富含毛蕊花糖苷成分的粉狀物或乾燥物。通過調整分離提純工藝條件，收穫的粉狀物或 乾燥物中毛蕊花糖苷成分百分比含量可達36.1 % 89.5%。 本發明方法的具體步驟包括
K挑選新鮮肉蓯蓉肉質莖，進行高溫滅酶，然後置於通常工業破碎碾磨裝置中將肉灰蓉肉質蓮破 碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞；然後採用通常工業壓濾機壓濾或工業離心機分離，獲取肉雙蓉細胞漿液；可再將濾渣經一次至數次(一般為1 3次)加入工業純淨水， 一次至數次經通常工業破 碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，還可同時採用通常工業超聲波提取裝置對破碎細胞進行提取，再經工 業壓濾機壓濾或工業離心機分離進一步獲取肉蓯蓉細胞漿液；
2、 將步驟1得到的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常固定化酶工業生產中的吸附法固 定方式，獲得[3-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，經通常工業固定化酶反應器進行間 斷式或連續式催化反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化 為毛蕊花糖苷單體化合物；催化反應過程溫度為38'C 60'C， pH為4.0 5.8;時間為4h 9h;催化反 應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活力為20U/g 1200U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛慈花糖苷 單體化合物的轉化率達77.5% 95%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用通常工業超濾膜分離，選擇性篩分及截留除去 多糖、蛋白質等大分子雜質以及微粒和亞微粒等雜質；再採用通常工業納濾膜分離，選擇性篩分及截 留除去胺基酸、D-甘露醇、甜菜鹼等小分子雜質；還可再採用通常工業大孔樹脂吸附分離工藝，或/和 採用通常工業層析柱分離純化工藝，或/和採用通常模擬移動床色譜分離系統或通常多功能色譜分離工 藝進一步分離純化；獲得富含毛蕊花糖苷單體化合物的提取液；
4、 將步驟3獲得的提取液，通過通常工業真空濃縮工藝，或工業薄膜蒸發濃縮工藝，獲得尚形物 含量為30% 50%的濃縮物；再通過工業噴霧乾燥工藝或其他乾燥方法，獲得富含毛蕊花糖苷成分的 粉狀物或乾燥物。收穫的粉狀物或千燥物中毛蕊化糖苷成分百分比含量可達36.1% 89.5%。
本發明方法中，催化反應過程可再添加K+、 Na+、 Mn2+或CcZ+作為催化反應的激活劑以促進酶的活性， 添加的激活劑在初始底物濃度為O.lmol/L 2. 5mol/L，最佳濃度為0. 5mol/L 1. 5mol/L;
本發明方法涉及的新鮮肉歡蓉肉質莖，可以是新收穫(未經冷藏或冷凍保鮮)的新鮮肉蓯蓉肉質 莖，或者是置於工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖或置於工業冷凍庫冷藏的速凍肉蓯蓉肉質莖；或 者是上述新鮮肉蓯蓉肉質莖的碎料或切片。本發明所述的肉蓯蓉是符合《中華人民共和國藥典》2005 年版收載的列當科植物肉蓯蓉OstaMc/ze JeseW/co/a Y.C.Ma或管花肉蓯蓉Ostowc/ze加Zw/osa (Schrenk) Wight 。
本發明方法涉及的工業冷藏庫保鮮的庫溫一般為rc i3'c,工業冷凍庫冷藏的庫溫一般為
-52°C -10°C。本發明方法涉及的每次加入工業純淨水的量為肉蓯蓉破碎細胞或濾渣的100% 400% (重量比)。
本發明方法涉及的高溫滅酶的溫度一般為75'C 130'C，時間一般為2min 10min。 本發明方法涉及的工業生產中的吸附法固定方式獲得固定化酶，通常是將(3-葡萄糖苷酶工業酶制 劑酶液與吸附劑接觸，再經洗滌除去不吸附的酶液便可以製得固定化酶。包括物理吸附法、離子吸附 法；吸附劑包括微孔玻璃、羥基磷灰石、賽珞玢、大孔型合成樹脂、特種陶瓷、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、AmberlitelRA-93、 IRA-410、 IRA-900、 Dowex-50、 Amberlite CG-50、 IRC-50、 IR-120, 可選用通常國外及國內商品。本發明方法涉及的p-葡萄糖苷酶工業酶製劑,包括p-葡萄糖苷酶及富含p-葡萄糖苷酶的纖維素酶、 植物提取複合酶、植物水解複合酶。
本發明方法涉及的工業固定化酶反應器可以是通常工業攪拌罐式反應器、固定化床反應器或流化 床反應器。
本發明方法涉及的超濾膜的相對分子質量為1000 4500;納濾膜相對分子質量為200 300;超濾 膜可選用CA或CTA、 PAN、 PS、 PSA、 PES、 PVDF、 PEK、 SPS的系列膜型號；納濾膜可選用 4040-UHT-ESNA或8540-UHY-ESNA、 ESNA-FREE650、 ESNA-FREE1700、 NTR7450HG、 NTR729HG、 NF-CA膜、NF-CA巻式元件及中空纖維件的系列膜型號；大孔吸附樹脂可選用XAD、 Diaion、 SP、 Posapak及Chromosorb及非離子型高分子吸附劑AB-8、 CHA-III、 CAD-40、 D101 、 D301 、 D296、 D396R、 D4006、 D4020、 D3520、 DA201、 DM301、 D130、 GDX104、 HPDIOO、 HPD450、 HPD500、 HPD600、 HPD8、 H107、 JD-KW、 LD601、 LD605、 ME-1、 ME-2、 ME-3、 NKA-2、 NKA-9、 R-A、 S8、 SIP、 WLD及X-5型系列型號；模擬移動床色譜分離系統及多功能色譜分離系統，可以選用MB、 MD、 ME、 MF製備型色譜分離層析儀、SMBC實驗型、SMBC中試型、XZ12E-4L型、XZ20Z-2L型及SMBC工 業化連續製備色譜型的色譜分離系統。本發明方法涉及的超濾膜、納濾膜、大孔吸附樹脂、非離子型 高分子吸附劑、工業層析柱、移動床色譜分離系統、多功能色譜分離系統，可選用通常國外及國內商
本發明方法涉及的工業真空濃縮工藝或工業薄膜蒸發濃縮土藝的溫度為42'C 8(TC;採用的工業 噴霧乾燥工藝的乾燥塔進風溫度為125'C 285'C。 ^
本發明方法涉及的其它工業乾燥的方法包括通常工業滾筒乾燥、氣流乾燥、流化床乾燥、微波真 空乾燥、微波乾燥、真空乾燥或熱風循環乾燥。
本發明方法生產的富含毛蕊花糖苷單體化合物成分的粉狀物或乾燥物，可直接用於醫藥原料，或 作為化妝品原料，也可作為原料或複方原料生產口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑、衝劑、丸劑或袋泡 茶等功能性保健食品。本發明方法的推廣實施，將使肉蓯蓉這一名貴的中藥更好地造福於人類的健康。
本發明方法中涉及的各種量的百分比《)，除了另有說明外，均為重量百分比。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例一
1、 挑選新鮮肉蓯蓉肉質莖，通過工業微波加熱裝置進行高溫滅酶，溫度為95t:,時間為3min; 置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞，水的加入量為破 碎細胞重量的300%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉歡蓉細胞漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的物理吸附法輕基磷灰石作為吸附劑的固定方式，獲得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常固定化床反應器進行連續式催化 反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蘊花糖苷單體 化合物;加入在初始反應物中濃度為2.5mol/L的Na+作為催化反應的激活劑，催化反應過程溫度為47°C ， pH為4.9，每批次催化反應時間為5.5h,連續進行催化反應5批次；催化反應過程反應物中的(3-葡萄 糖苷酶活力為40U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合物的轉化率達95%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為2000的超濾膜分離；再採用 相對分子質量為250的納濾膜進行納濾；然後採用AB-8型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；並經工 業層析柱分離純化工藝，再通過XZ12E-4L型多功能色譜分離系統工藝進一步分離提純；獲得毛森花 糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業真空濃縮工藝，溫度為6(TC，獲得固形 物含量為30%的濃縮物；再通過工業真空乾燥工藝，乾燥溫度為58。C，獲得富含毛蕊花糖苷成分的幹 燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為89.5%。
實施例二
1、 挑選置於庫溫為4'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，通過工業加熱裝置進行高溫滅酶， 溫度為IOO'C，時間為5min;置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗 滌破碎細胞，水的加入量為破碎細胞重量的100%;然後採用工業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞槳液； 並再將濾渣加入工業純淨水，水的加入量為濾渣重量的100%,經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿 狀物，並採用超聲波提取裝置對破碎細胞進行提取，再經工業離心機分離進一步獲取肉蓯蓉細胞漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的物理吸附法賽珞玢作為吸附劑的 同定方式，獲得p-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業固定化反應器進行連續式催化反 應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化 合物；加入在初始反應物中濃度為0.1mol/L的MW作為催化反應的激活劑，催化反應過程溫度為43'C， pH為4.6，每批次催化反應時間為6.0h，連續進行催化反應12批次；催化反應過程反應物中的|3-葡萄 糖苷酶活力為800U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合物的轉化率達91.1%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為3500的超濾膜分離；再採用 相對分子質量為200的納濾膜進行納濾；然後採用XAD型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；並經工 業層析柱分離純化工藝，再通過XZ20Z-ZL型多功能色譜分離系統進一步分離提純；獲得毛蕊花糖苷 單體化合物提取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為55。C，獲得 固形物含量為43%的濃縮物；再通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為55'C，獲得富含毛蕊花糖苷成分 的乾燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為81.3%。
實施例三
1、挑選置於庫溫為-24'C的工業冷凍庫冷藏的新鮮肉蓯蓉肉質莖，通過工業加熱裝置進行高溫滅酶，溫度為IOO'C，時間為4min;置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨 水洗滌破碎細胞，水的加入量為破碎細胞重量的100%;然後將採用工業壓濾機壓濾，獲取肉灰蓉細胞 漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的物理吸附法大孔型合成樹脂作為 吸附劑的固定方式，獲得p-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業流化床反應器進行連續 式催化反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛森花糖 苷單體化合物；催化反應過程溫度為42'C, pH為4.8,每批次催化反應時間為8h，連續進行催化反應 8批次；催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活力為1200U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蔬 花糖苷單體化合物的轉化率達86.1%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為3500的超濾膜分離；採用相 對分子質量為250的納濾膜進行納濾；然後採用NKA-2型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；並經工 業層析柱分離純化工藝進一步分離提純；獲得毛蔬花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業真空濃縮工藝，溫度為6(TC,獲得固形 物含量為43%的濃縮物；進一步通過工業噴霧乾燥工藝，乾燥塔進風溫度為1S5'C，獲得富含毛蕊花 糖苷成分的粉狀物；經分析測定，所收穫的粉狀物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為 67.3%。
實施例四
1、 挑選置於庫溫為l(TC的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉灰蓉肉質莖，通過工業加熱裝置進行高溫滅酶， 溫度為IO(TC,時間為5min;置於工業破碎碾磨裝置中將肉灰蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗 滌破碎細胞，水的加入量為破碎細胞重量的200%;然後採用工業壓濾機壓濾分離，獲取肉歡蓉細胞漿 液；再分別將濾渣經2次加入工業純淨水，每次水的加入量為濾渣重量的100%,再經通常工業破碎碾 磨機進一步碾磨成漿狀物，再經工業壓濾機壓濾分離進一步獲取肉灰蓉細胞漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法DEAE-葡聚糖凝膠作 為吸附劑的固定方式，獲得P-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行 連續式催化反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊 花糖苷單體化合物；加入在初始反應物中濃度為1.5mol/L的C,作為催化反應的激活劑，催化反應過 程溫度為47'C， pH為4.8,每批次催化反應時間為6h，連續進行催化反應12批次；催化反應過程反 應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為120U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛森花糖苷單體化合物的轉化 率達83.2%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為2000的超濾膜分離；採用相 對分子質量為300的納濾膜進行納濾；然後採用CAD-40型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；並經 工業層析柱分離純化工藝進一步分離提純；獲得毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為6(TC，獲得 固形物含量為45%的濃縮物；進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為55'C,獲得富含毛蕊花糖苷
8成分的乾燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為83.1%。 實施例五
1、 挑選置於庫溫為-18'C的工業冷凍庫冷藏的新鮮肉蓯蓉肉質莖，通過工業加熱裝置進行高溫滅 酶，溫度為12(TC，時間為10min;置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨 水洗滌破碎細胞，水的加入量為破碎細胞重量的400%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉灰蓉細胞漿 液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法IRC-50作為吸附劑 的固定方式，獲得p-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行連續式催 化反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單 體化合物；催化反應過程溫度為45'C， pH為4.3，每批次催化反應時間為8h,連續進行催化反應8批 次；催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活力為20U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖 苷單體化合物的轉化率達83.1%;
3、 將經闍定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為2000的超濾膜分離；採用相 對分子質量為250的納濾膜進行納濾；然後採用DM301型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；並經工 業層析柱分離純化工藝進一步分離提純；獲得毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業真空濃縮工藝，溫度為56°C，獲得固形 物含量為35%的濃縮物；進一步通過工業真空乾燥工藝，乾燥溫度為56'C，獲得富含毛蕊花糖苷成分 的乾燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為72.5%。
實施例六
1、 挑選置於庫溫為4'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，通過工業加熱裝置進行高溫滅酶， 溫度為130°C，時間為5min;置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗 滌破碎細胞，水的加入量為破碎細胞重量的150%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉蓯蓉細胞漿液； 再將濾渣加入工業純淨水，水的加入量為濾渣重量的300%，經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀 物，再經工業壓濾機壓濾分離進一步獲取肉灰蓉細胞漿液；
2、 將肉灰蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法IRC-120作為吸附劑 的固定方式，獲得植物水解複合酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行間斷式 催化反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷 單體化合物；催化反應過程溫度為45'C, pH為4.9,每批次催化反應時間為6h，連續進行催化反應9 批次；催化反應過程反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為100U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蕊 花糖苷單體化合物的轉化率達82.5%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為3500的中空纖維超濾膜分離； 採用相對分子質量為200的納濾膜進行納濾；然後採用X-5型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；並 經工業層析柱分離純化工藝，及SMBC中試型色譜分離系統進一步分離提純；獲得毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為70'C，獲得 固形物含量為38%的濃縮物；進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為56。C，獲得富含毛森花糖苷 成分的乾燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為82.4%。
實施例七
1、 挑選肉蓯蓉碎料，通過工業微波加熱裝置進行高溫滅酶，溫度為10(TC，時間為5min;置於工 業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞，水的加入量為破碎細胞 重量的250%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉蓯蓉細胞漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，釆用通常工業生產中的物理吸附法羥基磷灰石作為吸附 劑的固定方式，獲得P-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常固定化床反應器進行連續式催化 反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體 化合物；催化反應過程溫度為52'C， pH為5.8,每批次催化反應時間為8h，連續進行催化反應12批 次；催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活力為100U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖 苷單體化合物的轉化率達81.1%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為1000的超濾膜分離；採用相 對分子質量為250的納濾膜進行納濾；並經工業層析柱分離純化工藝進一步分離提純；獲得毛蕊花糖 苷單體化合物提取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業真空濃縮工藝，溫度為60'C,獲得固形 物含量為50%的濃縮物；進一步通過工業真空乾燥工藝，乾燥溫度為58'C，獲得富含毛蕊花糖苷成分 的乾燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為76.3%。
實施例八
1、 挑選置於庫溫為3'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，通過工業加熱裝置進行高溫滅酶， 溫度為IOO'C，時間為5min;置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗
滌破碎細胞，水的加入量為破碎細胞重量的100%;然後採用工業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；
再分別將濾渣經2次加入工業純淨水，每次水的加入量為濾渣重量的400%,經通常丁業破碎碾磨機進
一步碾磨成漿狀物，再經工業離心機分離進一步獲取肉蓯蓉細胞漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法DEAE-纖維素作為吸 附劑的固定方式，獲得纖維素酶固定化酶作為生物催化劑，經通常流化床反應器進行連續式催化反應， 催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物; 催化反應過程溫度為5(TC， pH為5.0，每批次催化反應時間為4h，連續進行催化反應7批次；催化反 應過程反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為35U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合 物的轉化率達77.5%;
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為2000的超濾膜分離；採用相對分於質量為300的納濾膜進行納濾，然後採用R-A型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；獲得毛森 花糖苷單體化合物提取液；
4、將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為6rc，獲得
固形物含量為38%的濃縮物；進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為65'C，獲得富含毛森花糖苷 成分的乾燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為50.3%。
實施例九
1、 採用新鮮的肉蓯蓉肉質莖，通過工業加熱裝置進行高溫滅酶，溫度為100'C，時間為5min;置 於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞，水的加入量為破碎 細胞重量的200%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉蓯蓉細胞漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，釆用通常工業生產中的離子吸附法DEAE-葡聚糖凝膠作 為吸附劑的固定方式，獲得p-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常固定化床反應器進行連續 式催化反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖 苷單體化合物；催化反應過程溫度為6(TC， pH為4.6，每批次催化反應時間為3.5h,連續進行催化反 應12批次；催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活力為48U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛 蕊花糖苷單體化合物的轉化率達78.3%
3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為3500的超濾膜分離；採用相 對分子質量為250的納濾膜進行納濾；獲得毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業真空濃縮工藝，溫度為60'C，獲得固形 物含量為38%的濃縮物；進一步通過工業噴霧乾燥工藝，乾燥塔進風溫度為185'C，獲得富含毛蕊花 糖苷成分的粉狀物；經分析測定，所收穫的粉狀物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為 36.1%。
實施例十
1、 挑選置於庫溫為l(TC的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，通過工業高溫裝置滅酶，溫度為 125°C,時間為4min;置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎 細胞，水的加入量為破碎細胞重量的150%;然後採用工業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；再將濾 渣加入工業純淨水，水的加入量為濾渣重量的150%，經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，再 經工業離心機分離進一步獲取肉蓯蓉細胞漿液；
2、 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法IR-120作為吸附劑 的固定方式，獲得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行間斷式催 化反應，催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單 體化合物；催化反應過程溫度為38'C， pH為4.0，催化反應時間為6，連續進行催化反應10批次；催 化反應過程反應物中的P-葡萄糖苷酶活力為72U/g;經測定，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體 化合物的轉化率達79.3%;3、 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用相對分子質量為4500的超濾膜分離；並經相 對分子質量為200的納濾膜進行納濾；採用SP大孔樹脂吸附分離提純；獲得毛蔬花糖苷單體化合物提 取液；
4、 將上述獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為49'C,獲得 固形物含量為40%的濃縮物；進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為65'C，獲得富含毛蕊花糖苷 成分的乾燥物；經分析測定，所收穫的乾燥物中(以乾物質計)毛蕊花糖苷成分的百分比含量為50.0%。
權利要求
1.一種採用固定化酶生產毛蕊花糖苷的方法，將新鮮肉蓯蓉肉質莖，經高溫滅酶、細胞破碎、漿液提取，將得到的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，以β-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，催化水解底物中的松果菊苷使其葡萄糖基配體末端斷裂、定向轉化為高活性的毛蕊花糖苷單體化合物；催化反應過程溫度為38℃～60℃，pH為4.0～5.8；時間為4h～9h；催化反應過程反應物中的β-葡萄糖苷酶活力為20U/g～1200U/g；將經催化反應後的肉蓯蓉細胞漿液，再通過分離提純工藝及濃縮、乾燥工藝，獲得富含毛蕊花糖苷成分的粉狀物或乾燥物。
2. 按照權利要求1所述的方法，其特徵是該方法的具體步驟包括(1) 挑選新鮮肉蓯蓉肉質莖，進行高溫滅酶，然後置於通常工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖 破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞；然後採用通常工業壓濾機壓濾或工業離心機分離，獲取肉 蓯蓉細胞漿液；(2) 將肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常固定化酶工業生產中的吸附法固定方式，獲 得的卩-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，經通常工業固定化酶反應器進行催化反應， 催化水解去掉底物中松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物； 催化反應過程溫度為38'C 60'C， pH為4.0 5.8;時間為4h 9h;催化反應過程反應物中的p-葡萄 糖苷酶活力為20U/g 1200U/g;(3) 將經固定化酶催化轉化的肉蓯蓉細胞漿液，採用通常工業超濾膜分離，選擇性篩分及截留除 去多糖、蛋白質大分子雜質以及微粒和亞微粒雜質；再採用通常工業納濾膜分離，選擇性篩分及截留 除去胺基酸、D-甘露醇、甜菜鹼小分子雜質；獲得富含毛蕊花糖苷單體化合物的提取液-，(4) 將步驟3獲得的提取液，通過通常工業真空濃縮工藝，或工業薄膜蒸發濃縮工藝，獲得固形 物含量為30% 50%的濃縮物；再通過工業噴霧乾燥工藝或其他乾燥方法，獲得富含毛蕊花糖苷成分 的粉狀物或乾燥物。
3. 按照權利要求1或2所述的方法，其特徵是在催化反應過程中添加K+、 Na+、 Mn"或C^+作為 催化反應的激活劑，添加的激活劑在初始反應物中濃度為0.1mol/L 2.5mol/L。
4. 按照權利要求3所述的方法，其特徵是在催化反應過程中添加的K+、 Na+、 M,或C激活劑 在初始反應物中濃度為0. 5mol/L 1. 5mol/L。
5. 按照權利要求l或2所述的方法，其特徵是所述的高溫滅酶的溫度為75'C 13(TC，時間為 2min 10min。
6. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(1)中所述的加入工業純淨水洗滌破碎細胞的加 水量為肉蓯蓉破碎細胞重量的100% 400%。
7. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是在步驟(1)中所述的採用通常工業壓濾機壓濾或工業 離心機分離獲取肉蓯蓉細胞漿液之後，再將濾渣經一次至數次加入工業純淨水，每次加入工業純淨水 的量為濾渣重量的100% 400%, —次至數次經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，或者同時 再採用通常工業超聲波提取裝置對破碎細胞進行提取，再經工業壓濾機壓濾或工業離心機分離進一步獲取肉蓯蓉細胞漿液。
8. 按照權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述的的p-葡萄糖苷酶工業酶製劑，包括p-葡萄糖 苷酶、纖維素酶、植物提取複合酶或/和植物水解複合酶。
9. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(3)中所述的超濾膜的相對分子質量為1000 4500， 納濾膜相對分子質量為200 300。
10. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(3)中再採用通常工業大孔樹脂吸附分離工藝， 或/和採用通常工業層析柱分離純化工藝，或/和採用通常模擬移動床色譜分離系統或通常多功能色譜 分離工藝，進一步分離純化。
11. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(4)中所述的工業真空濃縮工藝或工業薄膜蒸發 濃縮工藝的溫度為42'C 8(TC，工業噴霧乾燥工藝的乾燥塔進風溫度為125°C 285°C。
全文摘要
本發明涉及一種採用固定化酶生產毛蕊花糖苷的方法。本發明方法是將新鮮肉蓯蓉經高溫滅酶、細胞破碎、漿液提取，將得到的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，以β-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，催化水解底物中松果菊苷定向轉化為高活性的毛蕊花糖苷單體化合物，轉化率為77.5％～95％；將經催化反應後的肉蓯蓉細胞漿液，再通過分離提純工藝及濃縮、乾燥工藝，獲得富含毛蕊花糖苷成分的粉狀物或乾燥物。通過調整分離提純工藝條件，收穫的粉狀物或乾燥物中毛蕊花糖苷成分百分比含量可達36.1％～89.5％。毛蕊花糖苷單體化合物具有小分子和低極性的特徵，在藥物吸收中展示良好的吸收率和特殊的藥理活性。
文檔編號C12P19/00GK101629199SQ20091004164
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月4日 優先權日2009年8月4日
發明者何秀燕, 昕 劉, 劉小卓, 彭青雲, 招淑燕, 田曉玲, 健 肖, 賈寶國, 陳婭婷 申請人:中山大學;深圳學者健康工程有限公司;廣州綠色盈康生物工程有限公司