具有增強的產量相關性狀和/或提高的非生物脅迫抗性的植物和製備該植物的方法

2023-05-29 19:20:01

專利名稱：具有增強的產量相關性狀和/或提高的非生物脅迫抗性的植物和製備該植物的方法
具有增強的產量相關性狀和/或提高的非生物脅迫抗性的植物和製備該植物的方法本申請是中國專利申請200880003705.1的分案申請，原申請的申請日是2008年I月31日，發明名稱是「具有增強的產量相關性狀和/或提高的非生物脅迫抗性的植物和製備該植物的方法」。本發明總體上涉及分子生物學領域並且涉及用於增強植物中多種經濟重要的產量相關性狀和/或提高非生物脅迫抗性的方法。更具體地，本發明涉及用於通過調節植物中編碼產量增加蛋白(Yield Enhancing Protein ；YEP)的核酸表達而增強植物中產量相關性狀的方法。所述YEP選自核小體裝配蛋白I樣多肽(NAP1樣)、Sm樣多肽(Lsm蛋白)、截短的細胞周期蛋白H(CycHft)多肽、Remorin多肽和DREB蛋白。本發明還涉及具有編碼這種YEP的核酸的受調節表達的植物，其中所述植物相對於對照植物具有增強的產量相關性狀。本發明也提供了在實施本發明方法中有用的迄今未知的編碼YEP的核酸和包含該核酸的構建體。世界人口持續增長和農業用可耕地供應萎縮刺激了有關提高農業效率的研究。作物和園藝學改良的常規手段利用選擇性育種技術來鑑定具有受歡迎特徵的植物。然而，此類選擇育種技術具有幾個缺陷，即這些技術一般耗費巨大的勞動並且導致經常含有異源性遺傳成分的植物，其中所述的異源性遺傳成分可能不總是導致從親代植物傳遞下去的受歡迎性狀。分子生物學的進展已經允許人類改良動物和植物的種質。植物的遺傳工程引起遺傳物質(一般處於DNA或RNA形式)的分離和操作並且隨後導入該遺傳物質至植物中。此類技術具有能力產生具備多種改良的經濟學、農學或園藝學性狀的作物或植物。一個具有特殊經濟意義的性狀是提高的產量。產量通常定義為可測量的來自作物的經濟價值產生。這可以就數量和/或品質方面進行定義。產量直接取決於幾個因素，例如器官數目和大小、植物構造(例如枝條的數目)、種子產生、葉衰老和更多因素。根發育、營養攝取、脅迫耐受性和早期生長勢也可能是決定產量的重要因素。優化上述因素因而可以有助於作物產量提高。種子產量是一個特別重要的性狀，因為多種植物的種子對於人和動物營養是重要的。作物如穀物(corn)、稻、小麥、卡諾拉油菜(canola)和大豆佔超過一半的人類總熱量攝入，無論通過直接消費種子自身或通過消費基於加工的種子所產生的肉產品。作物也是糖、油和工業過程中所用多種類型代謝物的來源。種子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌發期間和籽苗早期生長期間用於胚生長的營養來源)。種子發育涉及多種基因並且需要將代謝物從根、葉和莖轉移至正在生長的種子中。胚乳尤其同化糖類、油和蛋白質的代謝前體並且將它們合成貯藏大分子以灌滿籽粒。植物生物量是飼料作物如苜蓿(alfalfa)、青貯穀物和乾草的產量。產量的多種代用物已經在穀類作物中使用。這些代用物中主要是植物大小的估計。植物大小可以根據物種和發育階段以多種方式測量，不過包括植物總乾重、地上部分乾重、地上部分鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、蓮座叢直徑、葉長度、根長度、根質量、分櫱數目和葉數目。眾多物種在給定發育階 段處維持植物不同部分的尺寸之間的保守性比率。這些異速生長關係用來從這些大小測量值之一外推出另一種大小測量值(例如Tittonell等2005AgricEcosys&Environl05:213)。在早期發育階段的植物大小一般與發育後期的植物大小相關。具有較大葉面積的較大植物一般可以比較小植物吸收更多光線和二氧化碳，並且因而將可能在相同期間獲得更大重量(Fasoula和Tollenaar2005Maydica50:39)。這還是該植物擁有的微觀環境優勢或遺傳優勢的潛在延續以初始地實現更大的大小。存在對應於植物大小和生長速率的強遺傳成分(例如ter Steege等2005Plant Physiologyl39:1078),並且因而對於一系列不同基因型，在一種環境條件下的植物大小有可能與另一種環境條件下的大小關聯(Hittalmani 等 2003TheoreticalApplied Geneticsl07:679)。以這種方式，使用標準環境作為田間作物在不同位置和時間所遭遇的多樣和動態環境的代表。收穫指數，即種子產量與地上部分乾重比，在多種環境條件下是相對穩定的，並且因此經常可以獲得植物大小與穀類產量之間的強烈關聯(例如Rebetzke等2002CropScience42:739) 0這些過程是內在聯繫的，因為大部分穀類生物量依賴於植物葉和莖的當前或忙備光合生產力(Gardener 等 1985Physiology of Crop plants.1owa StateUniversity Press,第68-73頁)。因此，已經選擇植物大小甚至選擇發育早期的植物大小用作將來潛在產量的指不物(例如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environl05:213)。當檢驗遺傳差異對脅迫耐受性的影響時，與田間相比，土壤特性、溫度、水和營養的可獲得性和光強度能夠標準化是溫室或植物生長箱環境的固有優勢。然而，因不良授粉而對產量的人為限制可能限制這些受控環境用於檢驗產量差異的用途，其中所述的不良授粉因缺乏風或昆蟲或成熟根或冠部生長的空間不足引起。因此，測量在生長箱或溫室中標準條件下早期發育的植物大小是提供潛在遺傳性產量優勢指示的標準實踐操作。眾多作物的另一個重要性狀是早期生長勢。改進早期生長勢是現代稻育種計劃在溫帶和熱帶稻品種上的重要目標。長根在水栽稻中對於正確土壤固定是重要的。在稻直接播種至淹水田地，以及植物必須穿過水迅速出苗的情況下，較長的苗與生長勢相關。在實施條播的情況下，較長的中胚軸和胚 芽鞘對於優異的籽苗出苗是重要的。在農業中將早期生長勢設計至植物內是極其重要的。例如，早期生長勢不良已經限制在歐洲大西洋地區引種基於玉米帶種質(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)雜交種。又一個重要性狀是改善的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界範圍作物損失的主要原因，平均產量對於大多數主要作物植物而言降低超過50% (Wang等，Planta(2003) 218:1_14)。非生物脅迫可以由乾旱、鹽度、極端溫度、化學毒性和氧化脅迫引起。改善植物對非生物脅迫耐受的能力將在世界範圍對農民提供大的經濟優勢，並且將允許在不利條件期間和在本來也許不可能栽培作物的土地上栽培作物。作物產量因而可以通過優化上述因素之一提高。取決於最終用途，對某些產量性狀的改良可能優先於其他產量性狀。例如對於應用如飼料或木材生產或生物燃料資源而言，增加植物營養體部分可能是受歡迎的，而對於應用如麵粉、澱粉或油生產而言，種子參數的提高尤其可能是受歡迎的。即便在種子參數當中，取決於應用，某些參數可以更優先於其他參數。多種機制可以有助於提高種子產量，無論其形式為提高的種子大小或提高的種子數目。提高植物中產量(種子產量和/或生物量)的一種方法可以是通過調節植物的內在生長機制如細胞周期或多種參與植物生長或參與防禦機制的信號途徑。
出人意料地，現在已發現:調節植物中編碼產量增加多肽(YieldEnhancingPolypeptide ；YEP)的核酸表達產生了相對於對照植物而言，具有增強的產量相關性狀和/或提高的非生物脅迫抗性的植物，其中所述的產量增加多肽(YEP)選自核小體裝配蛋白I樣多肽(NAP1樣)、Sm樣多肽(Lsm蛋白)、截短的細胞周期蛋白H(CycHft)多肽、Remorin多肽和DREB蛋白。
背景技術：
1.核小體裝配蛋白I樣多肽(NAP1樣)NAP蛋白構成了在動物中已知並且據報導參與染色質相關活性的相關蛋白質家族。NAP蛋白質家族以存在稱作NAP結構域的保守序列為特徵。NAP結構域在Pfam(登錄號PF00956)和Interpro資料庫(登錄號IPR002164)中描述。NAP是介導DNA包裝至核小體內的多因子複合體的一種組分(Krude, T.和 Keller，C.(2001)Cell.Mol.Life Sc1.58，665-672)。在真核細胞分裂周期的S期 期間，新複製的DNA迅速裝配入染色質。這個過程需要幾種因子的協調作用。在初始階段，CAFl (染色質裝配因子I)結合組蛋白H3和H4並且通過PCNA結合作用將它們導向複製叉。由NAPl蛋白介導組蛋白H2A和H2B的隨後沉積。NAPl 首先在 HeLA 細胞中描述(von Lindern 等(1992)Mol.Cell.Biol.12，3346-3355)並且後來發現在全部真核生物中是保守的。此外，認為NAP蛋白調節基因轉錄並可以影響細胞分化和發育。SET蛋白與NAP蛋白高度相關並且在人類的多個細胞過程中發揮作用。在人細胞中，已經顯示SET在細胞周期調節(如G2/M轉換)期間與多種CDK-細胞周期蛋白複合體結合。SET是參與幾條信號途徑的蛋白磷酸酶2A(PP2A)的強力抑制物。SET的抑制活性可歸因於酸性羧基端結構域(Canela等(2003) J.Biol.Chem.278，1158-1164)。其他報告顯示SET參與DNA修復和轉錄。SET是具有染色質相關蛋白HMG2介導的DNA結合和彎曲活性的複合體的部分。HMG2通過使DNA彎曲和成環或通過使低纏繞的DNA穩定而促進核蛋白高級結構的裝配。HMG2 與 SET 共沉澱(Fan 等(2002)Mol.Cell.Biol.22，2810-2820)。還報導SET 抑制活性 DNA 去甲基化(Cervoni 等(2002) J.Biol.Chem.277,25026-25031)。參與抑制組蛋白乙醯化的癌蛋白Set/TAF-1也抑制可導致基因沉默的異位方式甲基化的DNA去甲基化。有人提出Set/TAF-1在基因調節中，在集成組蛋白和DNA的外遺傳狀態方面發揮作用。NAPl蛋白的活性部分地通過磷酸化作用調節。已經證實NAPl在果蠅(Drosophila)中的亞細胞定位取決於其磷酸化狀態，而所述磷酸化狀態可受酪蛋白激酶II 控制(Rodriguez 等(2000) J.Mol.Biol.298，225-238)。據報導哺乳動物擁有幾種 NAPl蛋白，而在酵母中僅有一種已知的NAPl蛋白。植物NAPl直向同源物(orthologues)很大程度上仍是未知的，儘管報導了來自大豆(Yoon 等(1995)Mol.Gen.Genet.249,465-473)、擬南芥屬(Arabidopsis)、菸草、玉米、和稻(Dong等(2003) Planta216，561-570)的NAPl蛋白。植物NAPl樣基因的系統發生分析已經揭示存在兩個亞組，一個亞組與NAPl相關而另一個亞組與SET蛋白相關(

圖1)。最可能地，後來可能已經發生了序列趨異性，因為兩個擬南芥屬序列、兩個玉米序列和兩個菸草序列簇集在一起，指向一個更為新近的基因重複作用。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組僅含有一個NAP編碼基因，其組合了 NAPl和SET這兩個亞組的功能特性。類似地，NAPl的一個同源物-模板激活因子I(TAF-1)組合了 PP2a抑制活性(Saito等，Biochem.Biophys.Res.Comm.259,471-475,1999)和染色質再塑造活性(Kawase 等，GenesCellsl, 1045-1056,1996) 0因此可能的是NAP/SET家族的植物蛋白很大程度在功能上是冗餘的，尤其在SET蛋白的組中，其中與NAP組相比，觀察到較低程度的趨異性。此外，存在NAP和SET蛋白屬於相同家族的結構證據，因為這兩種蛋白質共有後接有羧基端酸性區域的NAP結構域。對NAPl樣蛋白在植物中的功能知之甚少，雖然已經提出其在有絲分裂和胞質分裂中的作用(Dong等2003)。NAPl蛋白的植物直向同源物最有可能發揮異於其動物對應物的不同作用。基於其核定位並基於與哺乳動物SET蛋白的序列相似性，可以預期該植物蛋白在染色質再塑造方面的作用。此外，植物NAP/SET蛋白組可能參與調節植物中的PP2A。PP2A是植物中的主要磷酸酶之一，很大程度地作用於轉錄因子和蛋白激酶，並且據稱調節參與多種細胞過程的蛋白質的活性，所述的細胞過程包括細胞周期(Ayaydin等(2000)Plant J.23，85-96)，激素作用如ABA介導的氣孔運動，萌發(Kwak等(2002)Plant Celll4，2849-2861)或者植物生長素運輸和根發育(Garbers等1996EMB0 J.15,2115-2124)。還報導PP2A參與光合作用和光信號傳導作用(Sheen (1993) EMBO J.12，3497-3505)和參與氮同化(Hirose 和 Yamaya (1999) Plant Physiologyl21，805-812)。W02005/094562 公開了 NAPl樣蛋白用於提高產量的用途，但是仍沒有提到在受非生物脅迫的植物中NAPl樣蛋白被調節的表達的作用。I1.Lsm(Sm 樣)蛋白核糖核酸(RNA)，一種由核糖核苷酸單體組成的核酸聚合物，是活生物中的關鍵成分。它在必需的細胞功能中發揮重要作用。RNA充當將基因翻譯成蛋白質的模版、轉運胺基酸至核糖體以合成蛋白質。一些RNA分子如核酶也具有催化活性並且RNA分子作為基因表達的主要調節物的作用最近已經確立。細胞中信使RNA(mRNA)的合成和功能需要一系列事件，包括轉錄、加工、運輸、翻譯和降解。RNA加工指轉錄後修飾RNA的事件。在真核生物中，絕大部分新生的前mRNA含有內含子，所述的內含子被剪接除去，導致外顯子的精確連接以產生成熟的mRNA，即由核糖體使用以翻譯成蛋白質的RNA形式。RNA的轉錄後修飾也包括在5』端加帽和在3』端聚腺苷酸化，其影響穩定性和翻譯效率。mRNA翻譯與周轉之間的關係對於基因表達的調節和細胞發揮正常功能是重要的。在高等真核生物中，幾百種蛋白質參與RNA代謝。此類蛋白質的實例是Lsm蛋白(Sm樣蛋白)。Lsmdike Sm ;Sm樣)蛋白質如此得名的原因是與之前描述的Sm蛋白的結構相似性。Lsm蛋白是與核心剪接體snRNA(小的核RNA)和snRNP (小的核核糖核蛋白)結合的小蛋白。Lsm蛋白含有長度各異、一般長50-70個胺基酸的Lsm結構域，其包括由可變區隔開的兩個短的保守胺基酸段。與Sm蛋白相比，已經提出Lsm蛋白形成異七聚體或異六聚體複合體，其中七個或六個Lsm蛋白排列在具有一個中心小孔的環中(Kambach C等Celll999;96:375-387 ；Khusial P 等 Trends Biochem Sc1.2005年 9 月；30(9):522-8 ；Zaric B 等 JBiol Chem.2005 年 4 月 22 日；280(16):16066-75)。

Sm樣蛋白家族已經在進化期間擴展，產生了具有不同底物特異性的蛋白質複合體。所述多種蛋白質複合體的共有特性是它們與RNA相互作用，保護這些RNA免遭不適宜的核酸酶活性作用和/或修飾它們的結構，在多種情況下影響這些RNA與其他RNA或與蛋白質的相互作用。發現編碼Lsm蛋白的基因不僅存在於真核生物中，還存在於細菌以及甚至在沒有任何剪接裝置的古細菌中存在。在酵母中，已經描述了 Lsm蛋白在胞核和胞眾中形成影響前mRNA剪接和降解、小的核RNA、tRNA和rRNA加工和mRNA降解的複合體。這些活性暗示了影響RNA-RNA和/或RNA-蛋白質相互作用的Lsm蛋白的RNA伴侶樣作用。核Lsm蛋白在維持前-rRNA加工事件的秩序方面發揮額外作用，它們與核糖體裝配有關並且可能促進核糖體裝配。Lsm6p、Lsm7p和Lsmlp蛋白質中的突變僅對核RNA的穩定性影響甚微，表明其他有活性的Lsm或Sm蛋白可替代這些非必需的 Lsm 蛋白。(Beggs JD.等 Biochem Soc Trans.2005 年 6 月；33 (Pt3):433-8)。因此，儘管Lsm蛋白結合以形成具有不同底物特異性的不同蛋白質複合體，然而Lsm蛋白之間存在功能性冗餘，從而允許具有不同Lsm組分的備選蛋白質複合體履行相同的功能。已經使用異源系統證實Lsm蛋白在物種之間的功能保守性。例如,酵母Lsmlp促進植物RNA病毒在酵母中的複製(Noueiry AO等Mol Cell Biol.2003年6月；23(12):4094-106)。提出了 Lsml與涉及mRNA脫帽的蛋白質的相互作用和Lsm蛋白在胞漿mRNA降解中的額外作用(Tharun S等Genetics.2005年5月；170(1):33-46)。還描述了在保護snoRNA(小的核仁RNAs)以及snRNA抵抗3』末端剪裁和ARE_mRNA (含有AU豐富元件的信使RNA)降解中的其它不同作用(Beggs JD.Lsm蛋白和RNA加工(Lsm proteins andRNAprocessing).Biochem Soc Trans.2005 年 6 月；33(Pt3):433-8 ;StoecklinG, MayoT, Anderson P.ARE-mRNA 降解需要 5 ' -3 '降解途徑(ARE-mRNAde gradation requiresthe5 ' -3 ' decay pathway).EMBO Rep.2006 年 I 月；7 (I):72_7)。Stoecklin G, MayoT, Anderson P.ARE-mRNA 降解需要 5' -3'降解途徑(ARE-mRNA degradation requiresthe5' -3' decay pathway).EMBO Rep.2006 年 I 月；7 (I):72_7)。

在酵母中，LSM蛋白分成 8 類，Lsml 至 Lsm8 (Wang 和 BrendelGenome Biology2004,5:R102)。全部酵母Lsm蛋白具有在植物中的同源物。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，存在11種鑑定的Lsm蛋白，它們屬於酵母中存在的相同8個類。4種Lsm蛋白在擬南芥中有兩份。這些基因有可能作為單個拷貝存在於動物和植物的祖先中，但是在植物品系中有兩個拷貝。在植物中，已經實驗地表徵了 11個Lsm基因中的一個基因(LSM5，At5g48870)。已經分離了 Lsm5p缺陷的擬南芥突變體並證實了在調節脫落酸信號轉導中發揮作用。因此，該突變植物顯示SAD (對ABA和乾旱處理超敏感)表型(Xiong L等Dev Cell.2001年12月；1(6) =771-81)。II1.截短的細胞周期蛋白H細胞周期蛋白是在細胞周期進程中發揮作用的蛋白質。它們在細胞周期期間合成和降解，並且它們大部分 通過結合至並因此激活細胞周期蛋白依賴性激酶而展現其功能。細胞周期蛋白可以分組成有絲分裂細胞周期蛋白(在高等真核生物中稱為A-和B-型細胞周期蛋白並且在芽殖酵母中稱為CLB)和Gl特異性細胞周期蛋白(在哺乳動物中稱為D-型細胞周期蛋白並且在芽殖酵母中稱為CLN)。細胞周期蛋白B例如是有絲分裂促進因子(MPF)的大蛋白質亞基；細胞周期蛋白B在細胞周期期間合成和降解以調節MPF活性。細胞周期蛋白B和細胞周期蛋白依賴性激酶I (cdkl、akacdc2、aka p34激酶)共同形成活性MPF蛋白。其他細胞周期蛋白包括細胞從Gl至S期轉移所需要的細胞周期蛋白E (與Gl期Cdk結合)；和細胞周期蛋白A，其中所述的細胞周期蛋白A與S期Cdk2結合併且是細胞推進經過S期所需的。H-型細胞周期蛋白調節CAKs (CDK-激活激酶)的活性。植物中已知的全部四種類型的細胞周期蛋白主要通過類推至它們的人類對應物而鑑定。在擬南芥屬中，已經描述了 10種A-型、9種B-型、10種D-型和I種H-型細胞周期蛋白(Vandepoele等，2002)。細胞周期蛋白一般具有所謂的細胞周期蛋白盒，是一種為結合併激活細胞周期蛋白依賴性激酶所需的保守序列。細胞周期蛋白H也是細胞周期的調節物(Fisher等Cell78，713-724，1994 ;Makela 等 Nature371，254-257，1994 ;Yamaguchi 等 Plant J.24，11-20，2000)。在動物細胞中，它是CDK7/細胞周期蛋白H/MAT1複合體的一部分。這種複合體實際上是一種「細胞周期蛋白激活複合體」，該複合體通過磷酸化細胞周期蛋白而調節激活級聯中其他細胞周期蛋白/⑶K複合體的活性。細胞周期蛋白H也參與轉錄和DNA修復。⑶K7和⑶K7在其他生物中的對應物如稻中的R2或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)中的Mcs6/Crkl/Mopl稱作細胞周期蛋白依賴性激酶激活激酶(CDK激活激酶或CAK)。⑶K激活激酶(CAK)活化了細胞周期蛋白依賴性激酶(cdks)，通過磷酸化cdks中保守的蘇氨酸殘基而控制細胞周期進程。來自人的CAK複合體包括p40M015 (cdk7)、細胞周期蛋白H和MAT1，它們也是使RNA聚合酶II大亞基的羧基端結構域磷酸化的轉錄因子IIH的亞基。IV.RemorinRemorin (又稱作pp34或dbp)形成胞眾膜/脂後相關蛋白超家族(Alliotte等(1989)Plant Physiol89:743-752 ;Reymond 等(1996)Plant Cell8:2265-2276 ；Bariola等(2004)Plant Molec Biol55:579-594 ；Mongrand 等(2004) J Biol Chem279(35):36277-36286)。該植物 特異的超家族存在於被子植物、裸子植物和苔蘚植物中。在擬南芥屬中找到至少15種密切相關的Remorin,並且其他植物中Remorin家族具有相似豐度。Remorin多肽以其羧基端半部分存在捲曲螺旋結構域為特徵。捲曲螺旋結構域常常參與蛋白質-蛋白質相互作用，尤其在寡聚化中。與此相符，已經發現Remorin在體外寡聚化並形成絲狀結構，並且作為寡聚結構存在於植物胞漿膜製備物中(Bariola等，參見上文)。儘管與胞漿膜強結合，不過Remorin多肽不具有典型膜結合蛋白的結構。相反，Remorin是小的親水性多肽。尤其,Remorin的羧基端半部分富含帶電荷的胺基酸(Lys(K)、Arg(R)、Asp (D)和Glu(E)。最後,大部分的Remorin於包含在該多肽羧基末端處最後10個胺基酸殘基中至少包含半胱氨酸(Cys或C)和/或苯丙氨酸(Phe或F)。Remorin可以在體外非特異性地與聚陰離子如寡半乳糖醒酸(0GA ;Reymond等,參見上文)、多聚半乳糖醛酸(PGA ；Farmer ^ (1991) J BiolChem266 (5):3140-5)結合，並且也可以結合雙鏈DNA(Alliotte等，參見上文)。作為參與眾多信號途徑的活性胞外基質成分的OGA也刺激Remorin的體外磷酸化，主要在蘇氨酸殘基處磷酸化。還不可能重獲過量表達編碼Remorin多肽的核酸序列的健康擬南芥屬品系，並且反義品系不表現明顯表型，可能原因是Remorin由龐大的多基因家族代表(Bariola等,參見上文)。國際專利申請W002/16655描述了作為SEQ ID NO:2621的編碼Remorin多肽的核酸序列。美國專利7，071，380描述了作為SEQ ID NO:379和SEQ ID NO:380的編碼Remorin多肽的兩種核酸序列。美國專利7，135，616描述了作為SEQ ID NO:133的編碼Remorin多肽的核酸序列。V.DREB轉錄因子通常定義為顯示序列特異性DNA結合作用和能夠激活和/或抑制轉錄的蛋白質。擬南芥屬基因組編碼至少1533種轉錄調節物，這佔據估計基因總數的約5.9%。據報導這些轉錄因子的約45%來自植物專屬家族(Riechmann等,2000 (Science第290卷，2105-2109))。AP2/EREBPs (APETALA2/乙烯應答元件結合蛋白)是植物獨有的轉錄因子的原型家族，所述轉錄因子的區別性特徵是它們含有所謂AP2DNA-結合結構域，其與乙烯應答啟動子中的GCC盒直接相互作用。然而，含有AP2結構域的蛋白質也在病毒、藍細菌和纖毛蟲的基因組中編碼，其中認為它們作為核酸內切酶發揮作用(Magnani等Plant Cell.2004年9 月；16(9):2265-77)。AP2/EREBP家族成員基於AP2結構域的數目和其他保守基序的存在而分成3個不同組。AP2結構域的共有序列顯示組間的輕微差異。稱作APETALA2亞家族的第一個性質不同的組由含有兩個重複AP2結構域的成員組成。稱作ERF亞家族的第二組的成員含有單個AP2結構域，並且也稱作RAV蛋白的第三組由含有B3結構域和單個AP2結構域的蛋白質組成。雖然已經報導顯示具有兩個AP2結構域的蛋白質發揮發育作用，但大部分含有單個AP2結構域的蛋白質相對於生物脅迫和非生物脅迫在進行研究。DREB或CBF蛋白構成參與非生物脅迫應答的含有單個AP2結構域的蛋白質的亞組(Yamaguch1-Shinozaki 等 1994.Plant Cell.6，251-264)。已經報導了 DREB 或 CBF 結合稱作DRE(乾旱應答元件)和/或CRT(C重複)的基因啟動子中的特異性順式作用元件並激活與寒冷、乾旱和高鹽度相關的下遊基因轉錄(Baker等(1994)Plant Mol.Biol.24,710-713) ；Stockinger 等(1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.94, 1035-1040 ;Liu 等 PlantCelllO,1391-1406)。DREB蛋白的基因表達在植物中受到高度調節。根據不同脅迫條件下的差異表達，可以在擬南芥屬中區分兩個亞組的DREBS，為DREBl和DREB2。然而在結構和功能方面，這兩個亞組通過結合至DRE/CRT順式作用元件並調節脅迫基因的表達而類似地運作。此外，這種結合作用可以導 致下遊基因的反式激活或反式失活(Zhao等2006，JBC218,10752-10759)。已經廣泛報導DREB基因在植物中的過量表達導致脅迫誘導型基因的強表達，並且轉基因植物獲得較高的非生物脅迫耐受性(Jaglo-Ottosen等(1998) Science280:104-106 ；Sakuma Y 等(2006)Plant Celll8:1292-1309 Jaglo KR 等(2001)， PlantPhysioll27:910-917 ;Shen 等(2003)Theor Appl Genetl06:923-930, Dubouzet JG 等(2003)Plant J33 =751-763) 0也已經在CBF2基因表達受損的擬南芥中報導了 CBF2突變體的非生物脅迫耐受性。有趣的是，CBF1/DREB1B和CBF3/DREB1A在CBF2敲除植物中的表達水平提高。這些結果顯示在擬南芥屬植物中，CBF2/DREB1C負向地調節CBF1/DREB1B和CBF3/DREB1A 基因的表達(Novillo 等 2004，101，3985-3990)。
出人意料地，已經發現調節植物中編碼產量增加多肽(YEP)的核酸表達產生相對於對照植物而言具有增強的產量相關性狀和/或提高的非生物脅迫抗性的植物，其中所述的產量增加多肽(YEP)選自核小體裝配蛋白I樣多肽(NAP1樣)、Sm樣多肽(Lsm蛋白)、截短的細胞周期蛋白H(CycHft)多肽、Remorin多肽和DREB蛋白。定義多肽/蛋白質術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可相互交換地使用並且指由肽鍵連接起來的任意長度聚合物形式的胺基酸。多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列術語「多核苷酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「核酸」、「核酸分子」在本文中可相互交換地使用並且指任意長度聚合的非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者的組合。對照棺物選擇合適的對照植物是實驗設計的例行部分並且可以包括相應的野生型植物或無目的基因的相應植物。對照植物一般是相同的植物物種或甚至是與待評估植物相同的品種。對照植物也可以是待評估植物的失效合子。如本文中所用的「對照植物」不僅指完整植物，也指植物部分，包括種子和種子部分。同源物蛋白質的「同源物」包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，它們相對於非修飾的所討論蛋白質具有胺基酸替換、缺失和/或插入並且與它們衍生自的所述非修飾蛋白質具有相似的生物學活性和功能活性。缺失指從蛋白質中移除一個或多個胺基酸。插入指一個或多個胺基酸殘基被導入蛋白質中的預定位點。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內插入單個或多個胺基酸。通常，在胺基酸序列內部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小約1-10個殘基級別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的實例包括如酵母雙雜交系統中所用的轉錄激活物的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6_標籤、穀胱甘肽S-轉移酶-標籤、蛋白A、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag 100表位、c-myc表位、FLAG _表位、IacZ, CMP (鈣調蛋白結合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。替換指以具有相似特性(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞a -螺旋結構或￠-摺疊結構的傾向性)的其他胺基酸替換蛋白質的胺基酸。胺基酸替換一般是單個殘基的，不過根據給予多肽的功能性約束條件，可以是簇集的；插入通常是約1-10個胺基酸殘基級別。胺基酸替換優選地是保守性胺基酸替換。保守性替換表是本領域熟知的(見例如 Creighton (1984) Proteins, ff.H.Freeman and Company (編著)和下表 I)。表1:保守性胺基酸替換的實例
權利要求
1.用於植物中相對於對照植物提高非生物脅迫抗性的方法，所述方法包括調節植物中編碼NAPl樣多肽的核酸表達，所述NAPl樣多肽包含NAP結構域。
2.根據權利要求1的方法，其中所述的NAPl樣多肽以增加的優選順序與SEQID NO:2所代表的 NAPl 樣多肽具有至少 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更大的序列同一性。
3.根據權利要求1或2的方法，其中編碼NAPl樣多肽的所述核酸由表A中所給出核酸SEQ ID NO的任一核酸或其部分代表，或由能夠與表A中所給出核酸SEQ ID NO的任一核酸雜交的序列代表。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述的核酸序列編碼表A中給出的任一 SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
5.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述提高的非生物脅迫抗性是相對於對照植物而目提聞的營養攝取效率。
6.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述的營養攝取效率導致增加的生物量和/或提聞的種子廣量。
7.權利要求6的方法，其中所述提高的種子產量至少包含提高的種子總重量和/或提高的充實種子數。
8.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述受調節的表達通過在植物中導入並表達編碼NAPl樣多肽的核酸而實現。
9.根據權利要求8的方法，其中所述的核酸有效地連接至組成型啟動子，優選地有效地連接至G0S2啟動子。
10.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述的編碼NAPl樣多肽的核酸是植物來源的，優選地來自雙子葉植物，進一步優選地來自十字花科(Brassicaceae),更優選地來自擬南芥屬(Arabidopsis),最優選地來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
11.構建體在用於製備非生物脅迫抗性提高的植物的方法中的用途，所述構建體包含 (a)編碼權利要求1至4中任一項所定義的NAPl樣多肽的核酸； (b)能夠驅動(a)的核酸序列表達的一個或多個調控序列；和任選地 (C)轉錄終止序列， 並且其中所述調控序列之一是組成型啟動子，優選地是G0S2啟動子。
12.編碼NAPl樣多肽的核酸的用途，用於在植物中相對於對照植物而言提高非生物脅迫抗性的方法中。
13.用於植物中相對於對照植物增強產量相關性狀的方法，包括調節植物中編碼Lsm (Sm樣)蛋白的核酸表達。
14.根據權利要求的13方法，其中所述的Lsm蛋白包含具有這樣的胺基酸序列的Lsm結構域，所述的胺基酸序列以增加的優選順序與選自SEQ ID Nol20、121、122、123、124、125、126、127、128、129 和 130 的序列具有至少 50 %,60 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性。
15.根據權利要求13或權利要求14的方法，其中所述的Lsm蛋白包含以增加的優選順序與選自 SEQ ID No41、43、45、47、49、51、53、55、57、59 和 61 的序列具有至少 50%、60%、70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性。
16.根據權利要求13至15中任一項所述的方法，其中所述的Lsm蛋白包含任意一個或多個以下基序: (i)基序1:GTLXSFDQFANVVLXGACERVIVGELYCDVPLGLYVIRGENVVLIG 或以增加的優選順序與基序I的序列具有至少70、80*%或90序列同一性的特徵標識，其中允許任意的保守性變化並且其中取「X」為任意胺基酸；(ii)基序II:KAEREARDLKGTMRKRMEFLDFD或以增加的優選順序與基序II的序列具有至少70 %、80 %或90 %序列同一性的基序，其中允許任意的保守性變化並且其中取「X」為任意胺基酸； 其中基序I和/或基序II可以按照優選順序包含0、1、2、3、4、5、6或7個胺基酸的缺失和/或替換和/或插入。
17.根據權利要求13至16中任一項所述的方法，其中所述的Lsm蛋白是Lsml類蛋白質。
18.根據權利要求13至17中任一項所述的方法，其中所述的Lsm蛋白優選地包含具有胺基酸序列的Lsm結構域，所述的胺基酸序列以增加的優選順序與選自SEQ ID N0.120、121、131、132、133、140、142、143、144、152、154 和 157 的序列至少具有 70 %,75 %,8085%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性。
19.根據權利要求13至18中任一項所述的方法，其中所述的Lsm蛋白優選地包含SEQID No41、43、73、75、77、81、85、87、89、105、109 和 115 中的任一序列。
20.根據權利要求13至19中任一項所述的方法，其中編碼Lsm蛋白的所述核酸是表G中給出的核酸SEQ ID NO的任一核酸或其部分，或者是能夠與表G中給出的核酸SEQ ID NO的任一核酸或與它們的互補序列的任一序列雜交的序列。
21.根據權利要求13至20中任一項所述的方法，其中所述的核酸序列編碼表G中給出的任意蛋白質的直向同源物或旁系同源物。
22.根據權利要求13至21中任一項所述的方法，其中編碼Lsm蛋白的所述核酸包含以下任意核酸:(i)由SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92,SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114 或 SEQ ID NO:116 代表的核酸； (ii)⑴中所給出SEQID NO的任一核酸的互補物； (iii)編碼Lsm蛋白的核酸，所述的Lsm蛋白以增加的優選順序與SEQID NO: 83, SEQID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ IDNO:107,SEQ ID NO: 109,SEQ ID NO:11USEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117中給出的任一胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性； (iv)能夠在嚴格條件下與上述(i)、(ii)或(iii)中給出的任一核酸雜交的核酸。
23.根據權利要求13至22中任一項所述的方法，其中所述受調節的表達通過在植物中導入並表達Lsm核酸而實現。
24.根據權利要求13至23中任一項所述的方法，其中所述受調節的表達通過T-DNA活化標籤技術、TILLING、位點定向誘變、定向進化或同源重組中的任意一種或多種方法實現。
25.根據權利要求13至24中任一項所述的方法，其中所述增強的產量相關性狀是相對於對照植物的任一以下性狀:提高的產量、優選地提高的種子產量、增加的充實種子數、提高的種子充實率或增加的生物量。
26.根據權利要求13至25中任一項所述的方法，其中所述的核酸有效地連接至在植物細胞中表達的啟動子、優選地以增加的優選順序有效地連接至種子特異性啟動子如稻WSI18啟動子。
27.根據權利要求13至26中任一項所述的方法，其中所述的啟動子是ABA誘導型啟動子。
28.根據權利要求13至27中任一項所述的方法，其中編碼Lsm蛋白的所述核酸是植物來源的，優選地來自雙子葉植物，進一步優選地來自十字花科、更優選地來自擬南芥屬，最優選地來自擬南芥。
29.根據權利要求13至28中任一項所述的方法能夠獲得的植物或包括種子在內的其部分，其中所述的植物或其部分包含編碼Lsm蛋白的重組核酸。
30.分離的核酸分子，選自:(i)由SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92,SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114 或 SEQ ID NO:116 代表的核酸； (ii)⑴中所給出SEQID NO的任一核酸的互補物； (iii)編碼Lsm蛋白的核酸，所述的Lsm蛋白以增加的優選順序與SEQID NO: 83, SEQID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:95,SEQID NO:97, SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:11USEQ ID NO:113,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:117 中給出的任一胺基酸序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性； (iv)能夠在嚴格條件下與上述(i)、(ii)或(iii)中給出的任一核酸雜交的核酸。
31.分離的多肽，選自:(i)由任一SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO: 101、SEQ IDNO:103,SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO:107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO:11USEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117代表的胺基酸序列； (ii)胺基酸序列，其以增加的優選順序與SEQID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99,SEQ ID NO:10USEQ ID NO:103、SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO: 107,SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:11U SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117 中給出的任一胺基酸序列具有至少 70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性；(iii)上述(i)或(ii)中給出的任一胺基酸序列的衍生物。
32.構建體，其包含: (a)編碼Lsm蛋白的核酸，其中所述Lsm蛋白的胺基酸序列包含具有下述胺基酸序列的Lsm結構域，所述胺基酸序列以增加的優選順序與選自SEQ ID No 120、121、122、123、124、125、126、127、128、129和 130 的序列具有至少 50 %,60 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性； (b)能夠驅動(a)的核酸序列表達的一個或多個調控序列；和任選地 (c)轉錄終止序列。
33.根據權利要求32的構建體，其中編碼Lsm蛋白的所述核酸是根據權利要求30的核酸。
34.根據權利要求32或權利要求33的構建體，其中所述的一個或多個調控序列至少是種子特異性啟動子，優選地是稻的WSI18啟動子。
35.根據權利要求32至34中任一項所述的構建體用於製備植物的用途，所述的植物相對於對照植物具有增強的產量相關性狀，特別是提高的種子產量。
36.用根據權利要求32至34中任一項所述的構建體轉化的植物、植物部分或植物細胞。
37.用於產生相對於對 照植物具有增強的產量相關性狀的轉基因植物的方法，所述方法包括: (a)在植物中導入並表達編碼Lsm蛋白的核酸，其中所述的Lsm的胺基酸序列包含具有下述胺基酸序列的Lsm結構域，所述的胺基酸序列以增加的優選順序與選自SEQ ID Nol20、121、122、123、124、125、126、127、128、129 和 130 的序列具有至少 50 % ,60 % ,70 % ,75 %,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性；和 (b)在促進植物生長和發育的條件下培養植物細胞。
38.根據權利要求37的方法，其中所述(a)的核酸是根據權利要求30的核酸。
39.相對於對照植物具有提高的產量的轉基因植物，所述提高的產量因編碼Lsm蛋白的核酸表達增加而產生，其中所述Lsm的胺基酸序列包含具有下述胺基酸序列的Lsm結構域，所述的胺基酸序列以增加的優選順序與選自SEQ ID Nol20、121、122、123、124、125、126、127、128、129和 130 的序列具有至少 50 % ,60 % ,70 % ,75 % ,80 % ,85 % ,90 % ,95 %,96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或從所述轉基因植物衍生的轉基因植物細胞。
40.根據權利要求29、權利要求36或權利要求39中任一項所述的轉基因植物，其中所述的植物是作物植物或單子葉植物或穀物植物，如稻、玉米、小麥、大麥、穀子、黑麥、高粱、二粒小麥、斯佩爾脫小麥、黑麥屬、單粒小麥、埃塞爾比亞畫眉草、買羅高粱和燕麥；或從所述轉基因植物衍生的轉基因植物細胞。
41.根據權利要求29、36、39或40中任一項所述的植物的可收穫部分，其中所述的可收穫部分優選地是種子。
42.產品，其衍生自根據權利要求40的植物和/或根據權利要求41的植物的可收穫部分。
43.編碼Lsm蛋白的核酸在植物中增強產量相關性狀的用途，其中所述Lsm蛋白的胺基酸序列包含具有下述胺基酸序列的Lsm結構域，所述的胺基酸序列以增加的優選順序與選自 SEQ ID Nol20、121、122、123、124、125、126、127、128、129 和 130 的序列具有至少 50%、60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性。
44.根據權利要求43的用途，其中所述增強的產量相關性狀是相對於對照植物提高的種子產量和/或增加的生物量。
45.用於在植物中相對於對照植物而言增強產量相關性狀的方法，包括調節植物中編碼截短的細胞周期蛋白H(CycHTr)多肽的核酸表達，所述的CycHft多肽能夠與CAK結合，但是不能激活CAK。
46.根據權利要求45的方法，其中所述的CycHft多肽衍生自這樣的細胞周期蛋白H，所述的細胞周期蛋白H以增加的優選順序與SEQ ID NO:173所代表的CycH多肽或與表K中給出的任一胺基酸序列具有至少 20%、25%、30%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大的序列同一性；或者其中所述的CycHft多肽衍生自這樣的細胞周期蛋白H，所述的細胞周期蛋白H是表K中給出的胺基酸序列的直向同源物或旁系同源物。
47.根據權利要求45或46的方法，其中編碼CycHft蛋白的所述核酸是表K中所給出核酸SEQ ID NO的任意核酸的一部分，或是能夠與表K中所給出核酸SEQ ID NO的任一核酸雜交的序列。
48.根據權利要求45至47中任一項所述的方法，其中所述的CycHft缺少He螺旋結構域、優選地也缺少H5'螺旋結構域，更優選地其中所述CycHft缺少He、H5'和H4'螺旋結構域，最優選地其中所述CycHT,缺少Hc、H5'、H4'和H3'螺旋結構域。
49.根據權利要求45至48中任一項所述的方法，其中所述受調節的表達通過T-DNA活化標籤技術、TILLING、位點定向誘變、 定向進化或同源重組中的任意一種或多種方法實現。
50.根據權利要求45至48中任一項所述的方法，其中所述受調節的表達通過在植物中導入並表達編碼CycHTr蛋白的核酸而實現。
51.根據權利要求45至50中任一項所述的方法，其中所述增強的產量相關性狀是相對於對照植物而言提高的產量、優選地增加的生物量和/或提高的種子產量。
52.根據權利要求50或51的方法，其中所述導入的核酸與種子特異性啟動子有效連接。
53.根據權利要求45至52中任一項所述的方法，其中編碼CycHft多肽的所述核酸是植物來源的，優選地來自雙子葉植物，進一步優選地來自十字花科，更優選地來自擬南芥屬，最優選地來自擬南芥。
54.通過根據權利要求45至53中任一項所述的方法能夠獲得的植物或包括種子在內的其部分，其中所述的植物或其部分包含編碼CycHTr多肽的重組核酸。
55.構建體，其包含: (a)編碼權利要求45至48中任一項所定義的CycHTr多肽的核酸； (b)能夠驅動(a)的核酸序列表達的一個或多個調控序列；和任選地 (C)轉錄終止序列。
56.根據權利要求55的構建體，其中所述調控序列之一是種子特異性啟動子。
57.根據權利要求55或56的構建體在用於製備植物的方法中的用途，所述的植物相對於對照植物具有提高的產量、特別地是增加的生物量和/或提高的種子產量。
58.用根據權利要求55或56構建體轉化的植物、植物部分或植物細胞。
59.用於產生轉基因植物的方法，所述的轉基因植物相對於對照植物具有提高的產量，特別是增加的生物量和/或提高的種子產量，所述方法包括: (i)在植物中導入並表達編碼權利要求45至48中任一項所定義的CycHft多肽的核酸；和 (ii)在促進植物生長和發育的條件下培養植物細胞。
60.轉基因植物，其相對於對照植物而言，由於編碼權利要求45至48中任一項所定義的CycHft多肽的核酸表達增加而具有提高的產量、特別地具有增加的生物量和/或提高的種子產量；或者衍生自此種轉基因植物的轉基因植物細胞。
61.根據權利要求54、58或60的轉基因植物，其中所述的植物是作物植物或單子葉植物或穀物植物，如稻、玉米、小麥、大麥、穀子、黑麥、高粱、二粒小麥、斯佩爾脫小麥、黑麥屬、單粒小麥、埃塞爾比亞畫眉草、買羅高粱和燕麥；或者衍生自此種轉基因植物的轉基因植物細胞。
62.根據權利要求61的植物的可收穫部分，其中所述的可收穫部分優選地是種子。
63.產品，其衍生自根據權利要求61的植物和/或根據權利要求62的植物的可收穫部分。
64.編碼權利要求45至48中任一項所定義的CycHTr多肽的核酸在植物中相對於對照植物提高產量、尤其增加生物量和/或`種子產量的用途。
65.用於植物中相對於對照植物而言增強產量相關性狀的方法，包括增加植物中編碼Remorin多肽的核酸序列表達,所述的Remorin多肽包含(i)羧基端Remorin結構域(對應於Pfam家族登錄號PF03763);和(ii)預測的羧基端捲曲螺旋結構域。
66.根據權利要求65的方法,其中所述的Remorin多肽額外地包含以下一項或兩項:(i)富含帶電荷的胺基酸的羧基端Remorin結構域；和(ii)在所述多肽羧基端處最後10個胺基酸殘基內包含的至少一個Cys和/或一個Phe。
67.根據權利要求65或66的方法,其中所述的Remorin多肽包含羧基端Remorin結構域，該羧基端Remorin結構域以增加的優選順序與SEQ ID NO:326所代表的羧基端Remorin結構域具有至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更大的序列同一性。
68.根據權利要求65至67中任一項所述的方法，其中所述的Remorin多肽是以增加的優選順序與SEQ ID NO:199所代表的Remorin多肽具有至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更大序列同一性的多肽。
69.根據權利要求65或66的方法，其中編碼Remorin多肽的所述核酸序列由表A中列出的任一核酸序列代表，或是其部分，或是能夠與表P中列出的任一核酸序列雜交的序列。
70.根據權利要求65或66的方法,其中所述的核酸序列編碼在表P中列出的任一多肽的直向同源物或旁系同源物。
71.根據權利要求65至70中任一項所述的方法，其中所述增加的表達通過T-DNA活化標籤技術、TILLING或同源重組中的任意一種或多種方法實現。
72.根據權利要求65至71中任一項所述的方法，其中所述增加的表達通過在植物中導入並表達編碼Remorin多肽的核酸序列而實現。
73.根據權利要求65至72中任一項所述的方法，其中所述增強的產量相關性狀是提高的產量，優選地是提高的種子產量，最優選地是以下一項或多項:(i)提高的種子充實率；(ii)提高的每株植物種子總產量；(iii)增加的充實種子數；(iv)增加的種子總數；(V)提高的千粒核重(TKW)或(vi)提高的收穫指數。
74.根據權利要求72或73的方法，其中所述的核酸序列有效地與組成型啟動子連接，優選與以下啟動子之一:(i)G0S2啟動子；或(ii)高速泳動族B (HMGB)啟動子連接。
75.根據權利要求65至74中任一項所述的方法，其中編碼Remorin多肽的所述核酸序列是植物來源的，優選地來自雙子葉植物，更優選地來自十字花科，最優選地來自擬南芥。
76.根據權利要求65至75中任一項所述的方法，其中所述增強的產量相關性狀用在營養限制性 條件下生長的植物獲得。
77.根據權利要求65至76中任一項所述的方法能夠獲得的植物或包括種子在內的其部分，其中所述的植物或其部分包含編碼Remorin多肽的核酸轉基因。
78.構建體，其包含: (a)編碼權利要求65至70中任一項所定義的Remorin多肽的核酸序列； (b)能夠驅動(a)的核酸序列表達的一個或多個調控序列；和任選地 (c)轉錄終止序列。
79.根據權利要求78的構建體，其中所述的調控序列之一是組成型啟動子、優選地是以下啟動子之一:(i)G0S2啟動子；或(ii)高速泳動族B (HMGB)啟動子。
80.根據權利要求78或79的構建體的用途，用於製備具有增強產量相關性狀的植物的方法中，所述增強的產量相關性狀優選地是相對於對照植物的以下一項或多項:(i)提高的種子充實率；(ii)提高的每株植物種子總產量；(iii)增加的充實種子數；(iv)增加的種子總數；(V)提高的千粒核重(TKW)或(vi)提高的收穫指數。
81.用根據權利要求78或79的構建體轉化的植物、植物部分或植物細胞。
82.用於產生相對於對照植物具有增強的產量相關性狀的轉基因植物的方法，包括: (i)在植物、植物部分或植物細胞中導入並表達編碼權利要求65至70中任一項所定義的Remorin多肽的核酸序列；和 (ii)在促進植物生長和發育的條件下培養植物細胞。
83.轉基因植物，其相對於對照植物而言，由於編碼權利要求65至70中任一項所定義的Remorin多肽的核酸序列表達增加而具有增強的產量相關性狀；或者從所述轉基因植物衍生的轉基因植物細胞或植物部分。
84.根據權利要求77、81或83的轉基因植物，其中所述的植物是作物植物或單子葉植物或穀物植物，如稻、玉米、小麥、大麥、穀子、黑麥、小黑麥屬、高粱、二粒小麥、斯佩爾脫小麥、黑麥屬、單粒小麥、埃塞爾比亞畫眉草、買羅高粱和燕麥；或者從所述轉基因植物衍生的轉基因植物細胞或植物部分。
85.根據權利要求84的植物的可收穫部分，其中所述的可收穫部分優選地是種子。
86.產品，其從根據權利要求84的植物和/或從根據權利要求85的植物的可收穫部分衍生。
87.編碼權利要求65至70中任一項所定義的Remorin多肽的核酸序列的用途,用於相對於對照植物而言在植物中增強產量相關性狀，優選提高以下一項或多項性狀:(i)提高的種子充實率；(ii)提高的每株植物種子總產量；(iii)增加的充實種子數；(iv)增加的種子總數；(V)提高的千粒核重(TKW)或(vi)提高的收穫指數。
88.分離的核酸分子，其選自: ⑴由SEQ ID NO:332代表的核酸； (ii)由SEQID NO:332代表的核酸的互補物； (iii)編碼Remorin多肽的核酸,所述的Remorin多肽與由SEQID NO:333代表的胺基酸序列以增加的優選順序具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性，和與SEQ ID NO:334以增加的優選順序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一 性。
89.分離的多肽，其選自: (i)由SEQID NO:333代表的氣基酸序列； (ii)胺基酸序列，其與由SEQID NO:333代表的胺基酸序列以增加的優選順序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同一性，和與SEQ ID NO:334以增加的優選順序具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性； (iii)上述(i)或(ii)中給出的任一胺基酸序列的衍生物。
90.用於相對於對照植物而言提高植物中產量的方法，包括在所述植物中降低或基本上消除內源性DREB基因表達和/或DREB蛋白的水平和/或活性。
91.根據權利要求90的方法，其中所述的降低或基本上消除通過RNA介導的基因表達下調實現。
92.根據權利要求91的方法，其中所述的RNA介導的下調通過共抑制實現。
93.根據權利要求91的方法，其中所述的RNA介導的下調通過利用反義DREB核酸序列實現。
94.根據權利要求90的方法，其中所述的降低或基本上消除通過使用DREB基因或其片段的反向重複序列實現。
95.根據權利要求90的方法，其中所述的降低或基本上消除通過使用微RNA實現。
96.根據權利要求90的方法，其中所述的表達降低或基本上消除通過插入誘變實現。
97.根據權利要求90至96中任一項所述的方法，包括將與DREB基因基本上同源的DREB核酸或其片段導入宿主植物。
98.根據權利要求90至97的方法，其中所述的降低或基本上消除以組成型方式優選地通過使用組成型啟動子、更優選地通過使用G0S2啟動子實現。
99.根據權利要求97的方法，其中所述導入的核酸來自與宿主植物相同的科，更優選地來自相同屬，甚至更優選地來自相同物種。
100.根據權利要求97的方法，其中所述導入的DREB核酸序列包含SEQID NO:335或其直向同源物或旁系同源物的足夠長度的基本上連續的核苷酸並且其中所述的宿主植物是穀類植物，優選地是稻。
101.根據權利要求100的方法，其中所述的核酸編碼SEQID NO:352,SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:356,SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:364、SEQ IDNO:366,SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:372、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:378,SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:386、SEQ IDNO:388,SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:400,SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:408、SEQ IDNO:410, SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:414 和 SEQ ID NO:416 任一序列所代表的蛋白質。
102.根據權利要求100或101的方法，其中所述的核酸是任一SEQ ID NO:351、SEQID NO:353,SEQ ID NO:355、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:383、SEQ IDNO:385, SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:413 和 SEQ ID NO:415 所代表的核酸。
103.根據權利要求90至102中任一項所述的方法，其中所述提高的產量是提高的種子產量和/或每株植物增加的花序數和/或提高的早期籽苗生長勢。
104.根據權利要求90至103中任一項所述的方法，其中所述提高的種子產量選自以下一項或多項:a)增加的種子生物量(種子重量)；b)每株植物增加的花數目；和(3)提高的(充實)種子數。
105.植物或其部分，其能夠通過根據權利要求90至104中任一項所述的方法獲得。
106.構建體，其包含: (a)DREB基因或其片段的反向重複序列； (b)能夠驅動(a)的核酸序列表達的一個或多個調控序列；和任選地 (c)轉錄終止序列。
107.用於產生相對於對照植物具有提高的種子產量的轉基因植物的方法，所述方法包括: (i)在植物細胞中導入根據權利要求106的構建體；和 (ii)在促進植物生長和發育的條件下培育植物、植物部分或植物細胞。
108.DREB核酸用於降低或基本上消除植物中內源性DREB基因表達以相對於對照植物而言提高植物中產量的用途。
109.根據權利要求108的用途，其中所述提高的產量是提高的種子產量和/或增加的花序數和/或提高的早期籽苗生長勢。
110.根據權利要求109的用途，其中所述提高的種子產量選自以下一項或多項:a)增加的種子生物量(種子重量)；b)每株植物增加的花數目；和(3)提高的(充實)種子數。
111.根 據權利要求108至110中任一項所述的用途，其中所述的產量提高在輕度脅迫條件下發生。
全文摘要
本發明總體上涉及分子生物學領域並且涉及用於增強植物中多種經濟重要的產量相關性狀的方法。更具體地，本發明涉及用於在植物中通過調節植物中編碼產量增加蛋白(YEP)的核酸表達而增強產量相關性狀的方法。所述YEP選自核小體裝配蛋白1樣多肽(NAP1樣)、Sm樣多肽(Lsm蛋白)、截短的細胞周期蛋白H(CycHTr)多肽、Remorin多肽和DREB蛋白。本發明也涉及具有編碼此種YEP的核酸受調節地表達的植物，其中所述植物相對於對照植物具有增強的產量相關性狀。本發明也提供了在實施本發明方法中有用的迄今未知的YEP編碼核酸和包含所述核酸的構建體。
文檔編號C07K14/415GK103233037SQ20131009060
公開日2013年8月7日 申請日期2008年1月31日 優先權日2007年1月31日
發明者C·勒佐, V·弗蘭卡德, A·I·桑茲莫林納羅, Y·海茨費爾德 申請人:巴斯福植物科學有限公司