螢光定量檢測克倫特羅的試劑盒和螢光標記液的製備方法
2023-06-24 15:03:21 2
專利名稱：螢光定量檢測克倫特羅的試劑盒和螢光標記液的製備方法
螢光定量檢測克倫特羅的試劑盒和螢光標記液的製備方法技術領域
本發明屬於醫學檢驗領域，具體地說，本發明涉及一種螢光定量檢測克倫特羅 (CLB)的免疫層析檢測試劑盒和螢光標記液的製備方法。
背景技術：
克倫特羅是一種平喘藥，該藥物既不是獸藥，也不是飼料添加劑，而是腎上腺類神經興奮劑。克倫特羅在家畜和人體內吸收好，而且與其它興奮劑相比，它的生物利用度高，以至食用了含有克倫特羅的豬肉出現中毒。
目前克倫特羅的檢測方法主要有4種，分別是試紙條速測法、酶聯免疫吸附測定法，氣相色譜-質譜法和高效液相色譜法。酶聯免疫吸附測定法、氣相色譜-質譜法和高效液相色譜法可以定量檢測，但所需儀器設備昂貴不便於基層採用。試紙條法操作簡便、敏感靈敏度高，檢出率達90 %以上可用於現場快速診斷。
申請號為200920108Μ5. 9的發明專利，涉及一種檢測動物源食品中克倫特羅含量的酶聯免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗、克倫特羅抗體工作液、 克倫特羅6個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、高濃度標準品、蓋板膜、自封袋、說明書和質檢報告。採用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中殘留的克倫特羅將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗克倫特羅抗體，加入酶標二抗後，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中克倫特羅的殘留量。與儀器分析技術相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在動物源性食品中克倫特羅的殘留量檢測中發揮重要作用。
申請號為CN02153852. 2的發明專利，提供一種能夠快速半定量檢測鹽酸克倫特羅是否存在的試劑條及其製造方法。檢測鹽酸克倫特羅的試劑條，包括設有凹槽的吸附板， 在所述吸附板的凹槽內吸附有帶固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜，所述載體膜上放置有帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯物的釋放墊；所述試劑條還包括一個裝有底物和顯色劑的遮光容器。本發明的產品為一次性用檢測工具，屬於快速微量檢測，CBL的檢測限為lng/ml，對於控制瘦肉精等違禁藥物的非法使用具有重要的價值。發明內容
本發明的目的在於克服上述現有技術的缺陷，提供一種成本低廉、操作簡便、靈敏性高的一種螢光檢測克倫特羅試劑盒。
為實現上述目的，本發明採取了以下技術方案
一種螢光定量檢測克倫特羅(CLB)免疫層析試劑盒，試劑盒包括試紙條和螢光標記液，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(τ區)和質控區(C區)；所述檢測區包被有CLB-BSA偶聯物(克倫特羅-牛血清白蛋白偶聯物)，所述質控區包被抗兔IgG ；所述螢光標記液中含有螢光標記CLB抗體和螢光標記兔IgG。
優選地，所述硝酸纖維素包被膜質控區(C區)，抗兔IgG的包被液濃度為0. 2 4mg/ml，用量為 90 μ l/27_35cm。
優選地，所述硝酸纖維素包被膜檢測區(T區)，克倫特羅偶聯物的包被液濃度為 0. 2 4mg/ml，用量為 90 μ l/27_35cm。
更優選地，所述硝酸纖維素包被膜質控區，抗兔IgG的包被液濃度為0. 5 2. Omg/ ml ；CLB-BSA偶聯物的包被液濃度為0. 8 2mg/ml。
優選地，所述螢光標記液中的螢光標記CLB抗體的濃度為0. 5_2ug/ml，螢光標記兔IgG的濃度為0.5-2ug/ml。使用時，採用相同的濃度使檢測效果更好。所述螢光標記液的激發波長(Ex)為310 550nm，發射波長(Em)為340 620nm。
所述螢光標記液為螢光素與蛋白的標記物或帶有螢光膠乳與蛋白的標記物，其中所使用的螢光素為異硫氰酸螢光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、藻紅蛋白、多甲藻綠素蛋白、鑭系螯合物、羧基螢光素、香豆素等其中的一種或幾種。
本發明另一發明目的是提供了一種上述螢光標記液的製備方法。
具體採取了以下技術方案
所述螢光標記液的製備方法，其步驟如下
A.含羧基的螢光素或螢光膠乳標記液的製備方法
將15-20mg的螢光素或450_500mg螢光膠乳標記物與70mgCLB抗體或兔IgG混合後，邊攪拌邊緩慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，使其整個反應體系中EDC的含量為0. 1-0. :3mg，N-羥基琥珀醯亞胺的含量為 0.1-0. ang，在低溫下2 8°C避光反應過夜；用透析或其他方法去除雜質，用螢光保護劑復溶；或
B.含氨基的螢光素或螢光膠乳標記液的製備方法
將15-20mg的螢光素或450_500mg mg螢光膠乳標記物與75mgCLB抗體或兔IgG 混合後，置於4 40°C環境，調節體系pH6. 8 9. 0，一邊攪拌一邊緩慢加入0. 2 1 %戊二醛；反應2 5小時，透析或其他方法去除雜質，用螢光保護劑復溶；或
C.含硫碳醯胺鍵的螢光素或螢光膠乳標記液的製備方法
用pH8. 0 pH9. 6碳酸緩衝液分別溶解65mg CLB抗體或兔IgG，用pH8. 0 pH9. 6 碳酸緩衝液溶解或懸浮15-20mg螢光素或450-500mg螢光膠乳；邊攪拌邊將上述溶解的螢光素或螢光膠乳漸漸加入球蛋白溶液中，加完後，繼續避光攪拌10-14小時，結合完畢後， 裝入透析袋中，用上述碳酸緩衝鹽水透析過夜，用螢光保護劑復溶。
本發明所述的克倫特羅的免疫層析試紙盒的檢測原理是競爭法，螢光素分子或螢光膠乳微粒與CLB抗體共價結合。將檢測樣本(尿樣或提取液)加入螢光標記物中，其螢光標記CLB抗體可與尿液中的CLB結合，形成複合物；而包被在硝酸纖維素膜上檢測區(T)的 CLB-BSA偶聯物(CLB抗原)也競爭結合螢光標記CLB抗體。當含CLB樣本與螢光標記物混合後滴加至試紙條的上，在層析作用下混合液沿著硝酸纖維素膜向前移動，樣本中所含CLB 量越多，可與T區CLB-BSA偶聯物(CLB抗原)結合的螢光標記的抗體越少，從而使T區測得螢光檢出值降低。通過螢光檢測儀掃描T區螢光信號強度，可檢測出樣本中CLB含量。
本發明的克倫特羅免疫層析試紙條與GC/MS、HPLC等色譜儀器以及酶免法檢測克倫特羅相比，具有簡便(簡單操作一步完成)、適合不同數量樣本檢測和快速(15分鐘左右即可有結果)等優點；與免疫膠體金標記試紙條相比，本發明具有靈敏度更高、準確定量等優點。
本發明的克倫特羅層析試劑盒，採用螢光標記液與樣本預先混合的方法，使反應與信號釋放更加均一，與其他層析法相比，其批量生產的精密度和準確度達到最好效果。在螢光定量檢測儀上可以達到僅10秒就能對克倫特羅進行靈敏的定量測定，更快更精確的測定動物組織中所含的克倫特羅殘留；克倫特羅層析試紙條具有良好的準確度(回收率為 80% -110% )，定量偏差20%以內)和高靈敏度(靈敏度達0.2ug/kg)，需要的樣品量少 (SOul)，操作非常簡便。
圖1是本發明的所述螢光定量檢測克倫特羅層析試劑盒中試紙條的結構示意圖2是本發明的所述螢光定量檢測克倫特羅層析試劑盒中試紙條的結構示意圖3是本發明的所述螢光定量檢測克倫特羅層析試劑盒中用於放置試紙條的檢測卡的結構示意圖。
具體實施方式
本發明所採用螢光標記液為螢光素與蛋白的標記物或帶有螢光膠乳與蛋白的標記物，其中所使用的螢光素為異硫氰酸螢光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、藻紅蛋白、多甲藻綠素蛋白、鑭系螯合物、羧基螢光素等其中的一種或幾種。
在本發明實施例中，所採用的CLB抗體為常規單克隆抗體技術製備的單抗，所採用的CLB-BSA偶聯物(即克倫特羅抗原)是利用常規化學合成方法得到，利用競爭法的原理檢測標本。
以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發明。
實施例一
在該實施例中，螢光定量檢測克倫特羅免疫層析試劑盒，包括有試紙條和螢光標記液。
其中，按試紙條的常規方法，試紙條由樣品墊1、包括檢測區(T區)3和質控區(C 區)4的硝酸纖維素包被膜2、吸水紙5依次相互搭接地粘貼在底板6上構成，如圖1和圖2 所示。
在該實施例中，包被膜的檢測區T線處用0.8mg/ml CLB-BSA偶聯物(即克倫特羅抗原)包被液，使用量為90uV27Cm。在包被膜的質控區C線處使用濃度為0. 5mg/ml的抗兔IgG進行包被，使用量同為90ul/27cm。用於結合螢光標記的兔IgG，用於檢測試紙條的有效性。
在該實施例中，螢光標記液受3IOnm激發，發射波長為340nm。在該實施例中，螢光標記液的製備採用含羧基的螢光膠乳標記物(本實施例用到的螢光素為7-羥基香豆素膠乳)的製備方法(A)，步驟如下
將500mg的7_羥基香豆素膠乳分別與70mg CLB抗體或70mg兔IgG混合後，邊攪拌邊緩慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS)，使其整個反應體系中EDC的含量為0. aiig，NHS含量為0. lmg，在低溫下2 8°C避光反應過夜。用透析或其他方法去除雜質，用螢光保護劑復溶。
將上述製備好的螢光膠乳微粒標記的CLB抗體和螢光膠乳微粒標記兔IgG按適當比例混合，以使兩種抗體濃度分別都為2ug/ml，分裝備用。
實施例二
在該實施例中，螢光定量檢測克倫特羅免疫層析試劑盒，包括試紙條和螢光標記液。
其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(T區)和質控區(C區)的纖維素包被膜、吸水紙按試紙條的常規方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
在該實施例中，包被膜的檢測區T線處用2. Omg/ml CLB-BSA偶聯物(即克倫特羅抗原)包被液，使用量為90ul/35cm。在包被膜的質控區C線處使用濃度為2. Omg/ml的抗兔IgG進行包被，使用量同為90ul/35cm，用於結合螢光標記的兔IgG，用於檢測試紙條的有效性。
在該實施例中，螢光標記液受550nm激發後，發射波長為620nm。在該實施例中，螢光標記液的製備採用含氨基的螢光膠乳標記物(本實施例用到的螢光素為四甲基異硫氰酸羅丹明膠乳)的製備方法，步驟如下
將500mg螢光膠乳標記物分別與75mgCLB抗體或75mg兔IgG混合後，置於4 40°C環境，調節體系pH7. O 8. 5，一邊攪拌一邊緩慢加入0. 4 0. 6%戊二醛；反應2 5 小時，透析或其他方法去除雜質，用螢光保護劑復溶。
將上述製備好的螢光膠乳微粒標記的CLB抗體和螢光膠乳微粒標記兔IgG按適當比例混合，以致兩種抗體濃度分別都為0. 5ug/ml，分裝備用。
實施例三
在該實施例中，螢光定量檢測克倫特羅免疫層析試劑盒，包括試紙條和螢光標記液。
其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(T區)和質控區(C區)的纖維素包被膜、吸水紙按試紙條的常規方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
在該實施例中，包被膜的檢測區T線處用lmg/ml CLB-BSA偶聯物(即克倫特羅抗原)包被液，使用量為90ul/35cm。在包被膜的質控區C線處使用濃度為lmg/ml的抗兔IgG 進行包被，使用量同為90ul/35cm。用於結合螢光標記的兔IgG，用於檢測試紙條的有效性。
在該實施例中，螢光標記液受490nm激發，發射波長為530nm。在該實施例中，螢光標記液的製備採用含硫碳醯氨基的螢光素(本實施例用到的螢光素為異硫氰酸螢光素)的製備方法，步驟如下
用pH8. O pH9. 6碳酸緩衝液分別溶解65mg CLB抗體或65mg兔IgG，用pH8. O PH9. 6碳酸緩衝液溶解或懸浮20mg異硫氰酸螢光素；邊攪拌邊將上述的異硫氰酸螢光素漸漸加入球蛋白溶液中，加完後，繼續避光攪拌1 左右，結合完畢後，裝入透析袋中，用上述碳酸緩衝鹽水在低溫下透析過夜，用螢光保護劑復溶。
將上述製備好的螢光物標記的CLB抗體和螢光膠乳微粒標記兔IgG按適當比例混合，以致兩種抗體濃度分別都為lug/ml，分裝備用。
本發明所述的克倫特羅免疫層析檢測試劑盒，在具體實例中，半成品通過以下工序組裝而成由樣品墊、包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上，構成試紙條，可再用現有技術中的卡外殼7 (如圖3所示)，固定成檢測卡，所述卡外殼塗有可供螢光儀掃描識別的產品信息噴碼。與寫入信息的ID晶片(現有技術中的ID晶片採用的定量計算公式為檢測信號值與計算濃度的半對數直線方程式或其他計算方程式，可自動進行結果判定)。分裝好的螢光標記液和其他配件組裝成試劑盒。
本發明所述螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒，在使用時，組裝在由塑料上殼和塑料下殼扣合而成的塑料卡外殼(檢測卡)中，塑料上殼設有兩個開孔，加樣孔9和顯示窗8，加樣孔9對應於所述的螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試紙條樣品墊，結果顯示窗8對應於所述螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試紙條的檢測區和質控區，該螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試紙條可以從該塑料外殼中取出。
用來測試免疫層析試紙條的螢光定量光譜檢測系統(免疫螢光檢測儀)，主要包含螢光光源系統、檢測系統及自動軟體分析控制系統。
本發明的一個實施例中，檢測樣本需要通過以下操作吸取50 150ul的樣本 (尿樣/提取液)與螢光標記液等量混合，混勻後吸取50 150ul，往水平放置檢測卡加樣孔加入，不要帶入氣泡，開始層析反應。反應15分鐘，由螢光檢測儀讀取測試結果。
本發明的實施例1-3所述的定量克倫特羅免疫層析檢測試劑盒與免疫螢光檢測儀對200例樣本(尿樣/提取液)的測定結果比較表明在0. 2ppb 5ppb範圍內測定克倫特羅的準確性高定量曲線線性係數均大於0. 99，樣本中含Ippb與2ppb濃度的克倫特羅其準確度為80% 120%，試劑盒檢出限為0.2ppb。相對一般採用的膠體金法(定性)和酶聯免疫檢測法檢測試劑盒的檢測結果具有更好的靈敏度和特異性。具體如下表。
權利要求
1.一種螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒，其特徵是，該試劑盒包括有試紙條和螢光標記液，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區和質控區；所述檢測區包被有CLB-BSA偶聯物，所述質控區包被抗兔IgG ；所述螢光標記液中含有螢光標記CLB抗體和螢光標記兔IgG。
2.根據權利要求1所述的螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒，其特徵是，所述硝酸纖維素包被膜質控區，抗兔IgG的包被液濃度為0. 3 3mg/ml，用量為 90 μ l/27-35cm0
3.根據權利要求1所述的螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒，其特徵是， 所述硝酸纖維素包被膜檢測區，CLB-BSA偶聯物的包被液濃度為0. 3-;3mg/ml，用量為 90 μ l/27-35cm0
4.根據權利要求1-3任一項所述的螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒，其特徵是，所述硝酸纖維素包被膜質控區，抗兔IgG的包被液濃度為0. 5 2. Omg/ml，用量為 90 μ l/27-35cm ；CLB-BSA 偶聯物的包被液濃度為 0. 8 ang/ml，用量為 90 μ l/27_35cm。
5.根據權利要求1-3任一項所述的螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒，其特徵是，所述螢光標記液中的螢光標記CLB抗體的濃度為0. 5-2ug/ml，螢光標記兔IgG的濃度為 0.5-2ug/ml。
6.根據權利要求5所述的螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒，其特徵是，所述螢光標記液的激發波長為310 550nm，發射波長為340 620nm。
7.一種螢光標記液的製備方法，其特徵是，其步驟如下A.含羧基的螢光素或螢光膠乳標記液的製備方法將15-20mg的螢光素或450-500mg螢光膠乳標記物與70mgCLB抗體或兔IgG混合後， 邊攪拌邊緩慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，使其整個反應體系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺含量為0. 1-0. :3mg，N-羥基琥珀醯亞胺的含量為0. 1-0. ang，在2 8°C避光反應過夜；去除雜質，用螢光保護劑復溶； 或B.含氨基的螢光素或螢光膠乳標記液的製備方法將15-20mg的螢光素或450-500mg螢光膠乳標記物與75mgCLB抗體或兔IgG混合後， 置於4 40°C，調節體系pH6. 8 9. 0，一邊攪拌一邊緩慢加入0. 2 1 %戊二醛；反應2 5小時，去除雜質，用螢光保護劑復溶；或C.含硫碳醯胺鍵的螢光素或螢光膠乳標記液的製備方法用pH8. O pH9. 6碳酸緩衝液分別溶解65mg CLB抗體或兔IgG，用pH8. O pH9. 6碳酸緩衝液溶解或懸浮15-20mg螢光素或450-500mg螢光膠乳；邊攪拌邊將上述溶解的螢光素或螢光膠乳漸漸加入球蛋白溶液中，加完後，繼續避光攪拌10-14小時，結合完畢後，裝入透析袋中，用上述碳酸緩衝鹽水透析過夜，用螢光保護劑復溶。
全文摘要
本發明公開了一種螢光定量檢測克倫特羅的免疫層析試劑盒以及螢光標記液的製備方法，該試劑盒包括有試紙條和螢光標記液，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區和質控區；所述檢測區包被有CLB-BSA偶聯物，所述質控區包被抗兔IgG；所述螢光標記液中含有螢光標記CLB抗體和螢光標記兔IgG。與免疫膠體金標記試紙條相比，本發明具有靈敏度更高、準確定量等優點，而操作比酶聯法更加快速和簡便。
文檔編號G01N33/533GK102507928SQ20111032229
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者唐海波, 彭運平, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術有限公司