一鍋法液相合成胸腺五肽的工藝的製作方法
2023-05-26 13:53:26 1
專利名稱：一鍋法液相合成胸腺五肽的工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬生物化學領域，特別涉及一種活性肽類物質的製備工藝方法。
背景技術：
胸腺中含有許多與免疫活性相關的活性肽類物質，其粗提物中含有15種以上的活性肽。胸腺生成素II(ThymopoietinII)是其中一種重要的活性成份。該活性肽由49個胺基酸構成，分子量為5562道爾頓，該分子的32-36位殘基片段是胸腺生成II的活性片段，具有原分子的各種活性，被稱為胸腺五肽(TP-5)。胸腺五肽分子結構簡單(TP-5，Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)，很容易用肽的化學合成法合成。TP-5已於1985年在義大利上市，商品名為Timunox，在美國也有數家藥廠正在研究開發。國內海南省中和藥業有限公司生產的注射用「胸腺五肽」凍乾粉針劑已在國內銷售。該藥對癌症病人免疫功能恢復有明顯療效；可輔助手術，放療、化療方案得以很好完成，且可防治感染等併發症。對B型肝炎的治療、重大外科手術及嚴重感染、自身免疫性疾病也有很好的效果。目前TP-5的合成方法大體分為液相合成法和固相合成法兩種。
跟本發明最相近的現有技術是液相法合成胸腺五肽。該方法以叔丁氧羰基(tBoc)保護的胺基酸衍生物為原料，經二肽合成——三肽合成——四肽合成——五肽合成——粗品生成的合成過程，合成過程要經過脫保護——偶聯——純化——重結晶的循環過程，即合成肽的中間產物都需要純化和再重結晶。所說的脫保護是以氫氟酸(HF)脫除保護基，所說的純化是以C18反相高效液相色譜(C18RP-HPLC)純化產物。
現有的液相法合成胸腺五肽，由於在純化過程中使用乙腈作溶劑，用量大，成本高；由於多次循環進行耗時多的純化和重結晶過程，使得合成胸腺五肽的工藝時間太長；由於HF的高危險性，最後一步的HF切割肽與樹脂鍵和脫除保護基需在特殊的裝置中完成，使工藝過程和所用設備繁雜。
發明內容
本發明要解決的技術問題是簡化工藝、減少工時、降低成本、安全操作，製備高活性、高純度的胸腺五肽產品。
本發明要解決的技術問題是通過改變工藝過程實現的。即發展了一種新工藝——一鍋法合成胸腺五肽(TP-5)。該工藝從原理上是介於tBoc和Fmoc之間的一種液相法，以三氟甲磺酸(TFMSA)系統脫除保護基，並以離子交換法完成產品純化。
具體的工藝內容是，以胺基酸衍生物為原料，過程有二肽合成——三肽合成——四肽合成——五肽合成——粗品生成；其特徵在於，肽合成過程所加的偶聯原料按各肽合成順序是酪氨酸衍生物和叔丁氧羰基纈氨酸(BOC-Val-OH)或者酪氨酸衍生物和芴甲氧羰基纈氨酸(Fmoc-Val-OH)、芴甲氧羰基天冬氨酸或叔丁氧羰基天冬氨酸、(Fmoc-Asp-OH或BOC-Asp-OH)、芴甲氧羰基賴氨酸(Fmoc-Lys-OH)、芴甲氧羰基精氨酸(Fmoc-Arg-OH)；各肽合成過程包括偶聯—酸鹼洗脫—除水乾燥—脫保護基的過程；所說的偶聯是在三氯甲烷溶解的酪氨酸或合成過程得到的經脫保護基的短肽中加入偶聯原料進行偶聯反應；所說的酸鹼洗脫是將經偶聯過程得到的反應液用碳酸鈉溶液、水、檸檬酸溶液萃取洗，且每種溶液洗2～5次，收集有機相；所說的除水乾燥是將有機相加無水硫酸鎂除水，減壓蒸餾除去有機溶劑，得固體再真空乾燥；所說的脫保護基是將除水乾燥後得到的樣品溶於三氯甲烷，加入三氟乙酸(TFA)溶液或哌啶/三氯甲烷溶液，攪拌脫除BOC保護基或Fmoc保護基；所說的粗品生成是合成五肽後，脫BOC保護基或Fmoc保護基，加入三氟甲磺酸/三氟乙酸(TMFSA/TFA)、苯甲硫醚或加入三氟甲磺酸矽烷酯/三氟乙酸、苯甲硫醚脫除剩餘保護基，乙醚沉澱，製得粗品。
前述的酪氨酸衍生物可以是酪氨酸苄酯鹽酸鹽(H-Tyr-Obzl·HCl)，合成二肽或合成三肽既可以採用叔丁氧羰基(Boc)系統，也可以採用芴甲氧羰基(Fmoc)系統。即合成的二肽是Boc-Val-Tyr(Bzl)Obzl或者是Fmoc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl；合成的三肽是Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl或者是Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl。這樣做有利於提高產率。
前述的酸鹼洗脫中，用於萃取洗的碳酸鈉溶液、檸檬酸溶液濃度可以是3％至10％。
在粗品生成過程的脫保護中，是以三氟甲磺酸-巰基茴香醚(TFMSA-thioanisole)系統脫除保護基，或以三氟甲磺酸矽烷酯-巰基茴香醚(TMSOTf-thioanisole)系統脫除保護基。與背景技術相比，這是一個創新的方法。
與背景技術不同的是，只對最後產品進行純化處理。純化過程是以弱酸性和強酸性離子交換樹脂純化TP-5粗品，以稀氨水洗脫產物；或以弱鹼性和強鹼性離子交換樹脂純化TP-5，以醋酸進行洗脫。經純化處理後，產品的純度更高。
本發明由於中間過程不需要耗時較長的純化和重結晶過程，使工藝簡單快速；由於不使用乙腈溶劑，生產成本大大降低；由於不使用HF而使操作安全；產品的質量也達到國內藥檢標準，純度達95％以上。
具體實施例方式
實施例1 二肽(Boc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成稱取H-Tyr(Bzl)-OBzl·HCL(M.W 397.9，1.99克，5毫摩爾)，加入三氯甲烷15毫升左右於25-30℃下，攪拌、溶解。用N-甲基嗎啡啉(NMM)調pH到7至8。向其中加入1.3倍過量的Boc-Val-OH(M.W217.27，1.41克，6.5毫摩爾)，BOP試劑(M.W442.5，2.87克，6.5毫摩爾)，HOBt(M.W153.15，0.99克，6.5毫摩爾)，攪拌、進行偶聯反應2小時。用薄層層析(TLC)、硫酸鈰顯色，監測反應完成情況。
反應液經酸鹼洗脫、除水乾燥處理後，得Boc-Val-Tyr(Bzl)-OBzl2.51克，收率89.66％。
實施例2 三肽(Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成取Boc-Val-Tyr(Bzl)-OBzl2.51克，用4毫升三氯甲烷溶解，經脫保護基處理脫去Boc保護基。產物用三氯甲烷溶解，NMM調pH至7-8。向其中加入1.3倍過量的Fmoc-Asp(OBut)-OH 2.4克，BOP試劑2.57克，HOBt0.89克，NMM 640微升，於室溫攪拌、進行偶聯反應2小時。用TLC、硫酸鈰顯色，監測反應完成情況。
反應液經酸鹼洗脫、除水乾燥處理後，得Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl，85％收率。
實施例3 四肽(Fmoc-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成取Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl用10至15毫升三氯甲烷溶解，經脫保護基處理脫除Fmoc保護基。產物用三氯甲烷溶解，加入1.3倍過量的Fmoc-Lys-(Boc)-OH，BOP，HOBt，NMM，於室溫攪拌、進行偶聯反應2小時。用TLC、硫酸鈰顯色，監測反應完成情況。
反應液經酸鹼洗脫、除水乾燥處理後，得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl，90％收率。
實施例4 五肽(Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成取Fmoc-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl用15毫升左右三氯甲烷溶解，經脫保護基處理脫除Fmoc保護基。產物用三氯甲烷溶解，加入1.3倍過量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，BOP試劑，HOBt，NMM，於室溫攪拌、進行偶聯反應2小時。用TLC、硫酸鈰顯色，監測反應完成情況。
反應液經經酸鹼洗脫、除水乾燥處理後，得Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl，80％收率。
實施例5 粗品(H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)的生成①脫Fmoc保護基將Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl經脫保護基處理脫去Fmoc保護基。
②脫剩餘的保護基向已脫Fmoc保護基的五肽中加入適量的1M TFMSA/TFA、苯甲硫醚，於冰浴中，攪拌、反應2小時，脫除剩餘保護基。反應液用預冷的乙醚沉澱，離心、真空乾燥，得H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH粗品，95％收率。
用三氟甲磺酸矽烷酯替代三氟甲磺酸(TFMSA)脫剩餘的保護基，方法與效果是一樣的。
實施例6 純化處理採用離子交換層析的方法對粗品進行純化。純化分離是根據TP-5在不同pH條件下，所帶電荷不同，TP-5與樹脂的吸附能力不同，採用pH梯度進行洗脫，收集樣品峰。
具體實驗條件純化儀器P.E公司BioCAD 700E型純 化 柱POROS CM 4.6mm×100mm溶劑系統A相 水，pH＝5.5B相 氨水，pH＝11.0梯度洗脫，B相由0％到100％。
實施例7 脫Boc保護基將樣品用適量的三氯甲烷溶解，加入TFA溶液，於室溫下攪拌、反應1小時，脫除Boc保護基。將反應液減壓蒸餾除過量的TFA、有機溶劑，得黃色固體，真空乾燥。
實施例8 脫Fmoc保護基將樣品用適量的三氯甲烷溶解，加入20％哌啶/三氯甲烷溶液，於室溫下攪拌、反應1小時，脫除Fmoc保護基。將反應液減壓蒸餾除過量的哌啶、有機溶劑得黃色油狀物。用石油醚洗2次(2×25ml)，得固體。
權利要求
1.一種一鍋法液相合成胸腺五肽的工藝，以胺基酸衍生物為原料，過程有二肽合成——三肽合成——四肽合成——五肽合成——粗品生成；其特徵在於，肽合成過程所加的偶聯原料按各肽合成順序是酪氨酸衍生物和叔丁氧羰基纈氨酸或者酪氨酸衍生物和芴甲氧羰基纈氨酸、芴甲氧羰基天冬氨酸或叔丁氧羰基天冬氨酸、芴甲氧羰基賴氨酸、芴甲氧羰基精氨酸；各肽合成過程包括偶聯—酸鹼洗脫—除水乾燥—脫保護基的過程；所說的偶聯是在三氯甲烷溶解的酪氨酸或合成過程得到的經脫保護基的短肽中加入偶聯原料進行偶聯反應；所說的酸鹼洗脫是將經偶聯過程得到的反應液用碳酸鈉溶液、水、檸檬酸溶液萃取洗，且每種溶液洗2～5次，收集有機相；所說的除水乾燥是將有機相加無水硫酸鎂除水，減壓蒸餾除去有機溶劑，得固體再真空乾燥；所說的脫保護基是將除水乾燥後得到的樣品溶於三氯甲烷，加入三氟乙酸溶液或哌啶/三氯甲烷溶液，攪拌脫除BOC保護基或Fmoc保護基；所說的粗品生成是合成五肽後，脫BOC保護基或Fmoc保護基，加入三氟甲磺酸/三氟乙酸、苯甲硫醚或三氟甲磺酸矽烷酯/三氟乙酸、苯甲硫醚脫除剩餘保護基，乙醚沉澱，製得粗品。
2.按照權利要求1所述的一鍋法液相合成胸腺五肽的工藝，其特徵在於，原料中的酪氨酸衍生物是酪氨酸苄酯鹽酸鹽，合成的二肽是Boc-Val-Tyr(Bzl)Obzl或者是Fmoc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl；合成的三肽是Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl或者是Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl。
3.按照權利要求1或2所述的一鍋法液相合成胸腺五肽的工藝，其特徵在於，在粗品生成後，進行純化處理，以弱酸性和強酸性離子交換樹脂純化粗品，以稀氨水洗脫產物；或以弱鹼性和強鹼性離子交換樹脂純化粗品，以醋酸進行洗脫。
全文摘要
本發明的一鍋法液相合成胸腺五肽的工藝屬生物化學領域。以胺基酸衍生物為原料，過程有二肽合成—三肽合成—四肽合成—五肽合成—粗品生成；各肽合成過程包括偶聯—酸鹼洗脫—除水乾燥—脫保護基；其中包括合成二肽Boc－Val－Tyr(Bzl)OBzl或Fmoc－Val－Tyr(Bzl)－OBzl，三肽Fmoc－Asp(Obut)－Val－Tyr(Bzl)－O或Boc－Asp(OBzl)－Val－Tyr(Bzl)－Obzl；粗品生成時以TFMSA系統脫除保護基，最後以離子交換法進行一次產品純化。本發明工藝簡單快速；生產成本低；操作安全；產品的質量也達到國內藥檢標準，純度達95％以上。
文檔編號C07K14/66GK1442428SQ0311127
公開日2003年9月17日 申請日期2003年3月24日 優先權日2003年3月24日
發明者李惟, 石玉華, 齊巖峰 申請人:吉林大學