一種提取芹菜中celⅰ核酸酶的方法
2023-05-26 21:02:31 1
專利名稱：一種提取芹菜中celⅰ核酸酶的方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及酶的製備。
背景技術：
CEL I核酸酶是一種單鏈特異性核酸酶(single-strand specific nuclease),其等電點為6.0~6.5，分子量大小為43kDa，催化活性需要Mg^和Zi^+的參與，屬於S1核酸內切酶家族中的一種。CELI核酸酶是目前生物界發現的唯一能準確切割異源雙鏈DNA中存在錯配位點的酶，在遺傳學研究和應用領域中扮演重要的角色，具有廣闊的應用前景。
目前，CELI核酸酶的獲取途徑主要是從芹菜中提取。Oleykowski等人與1998年首先報導了一種從芹菜中提取CEL I核酸酶的方法，該方法方法如下首先通過連續硫酸銨沉澱，
然後經刀豆體球蛋白A-瓊脂糖柱提取(用
-￡1+-甘露糖蛋白洗脫)，磷酸纖維素柱吸附(用
線性梯度的氯化鉀洗脫)，最後用尺寸排阻色譜法分級分離得到CELI核酸酶。該方法需要經過多次沉澱提取、離子交換層析和凝膠過濾以及反覆超高速離心，導致單位時間內的產出率很低。另外，該方法的總產率也很低，約含350g蛋白的7kg芹菜莖僅能提取得到濃度為0.1pg/nL的CELI核酸酶3ml (Nucleic Acides Res， 26， 4597-4602， 1998)。
隨後，Yang等人對上述方法進行了改進(PCT/US01/05502)，採用a-甲基甘露糖苷來克服CEL I核酸酶與內源性選擇素發生聚集反應的問題，從105kg芹菜所得的粗酶液中提取得到0.5mL純酶，比酶活力由原來的x102 U/mg升至3.1xl07 U/mg，但是總酶活則從原來的1.9x107 U減至3.1x105 U,回收率僅為1.63%。但是該方法同樣不能避免多次沉澱提取、離子交換層析和凝膠過濾以及反覆超高速離心等操作，且提取率也不高。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提高從芹菜中提取CELI核酸酶的效率。本發明解決上述問題的技術方案是；
一種提取芹菜中CELI核酸酶的方法，該方法由以下步驟組成
(1) 稱取芹菜，每lkg芹菜加入80 120ml緩衝液A，搗成勻漿，壓榨出液體，過濾，用lM的Tris溶液調節pH至8.0左右，得粗酶液；
(2) 將粗酶液在45 50 。C下保溫15 20 min，然後3000Xg 5000Xg離心20 40 min，取上清液；
(3) 加入硫酸銨粉末至飽和度為25%， 3000Xg 5000Xg離心20 40 min，收集上清
液；所得上清液中加入硫酸銨粉末至飽和度為80%， 3000Xg 5000Xg離心20 40min，收集沉澱物；
(4) 將所得沉澱物用緩衝液B溶解，透析脫鹽；
(5) 加入刀豆凝集素，混勻，4 10 'C下攪拌6 16小時使CEL I核酸酶與刀豆凝集素充分結合，然後靜置20 60min;
(6) 抽濾去清液，在濾渣中加入緩衝液C溶解出CELI核酸酶，超濾濃縮。在4 1(TC條件下，上DEAE—Sepharose FF，然後依次用洗脫液D和洗脫液E各500 ml以0.5 1 ml/min的流速進行梯度洗脫；
(7) 收集洗脫液，用RF-INicking方法檢測各收集管中的CELI核酸酶活力，合併酶活力在3 x 107 U/mg蛋白的洗脫液；
上述步驟中，所述緩衝液A由以下方法製備得到在pH8.0的0.1 MTris-HCl緩衝液中添加N2S03和苯甲基磺醯氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)至濃度分別為0.01M和ImM;所述緩衝液B由以下方法製備得到在pH8.0的0.1 M Tris-HCl緩衝液中添加苯甲基磺醯氟至濃度為ImM;所述緩衝液C由以下方法製備得到在pH8.0的50 mM Tris-HCl緩衝液中添加甲基甘露糖苷和Triton X-100至濃度分別為30 mM和0.01%;所述洗脫液D由以下方法製備得到在pH8.0的Tris-HCl緩衝液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KC1至濃度分別為10 mM、 0.01%和10 mM;所述洗脫液E由以下方法製備得到在pH8.0的Tris-HCl緩衝液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KC1至濃度分別為10 mM、 0.01%和0.5M。
本發明方法在抽提液中採用添加少量亞硫酸鈉減少和清除提取液中有色物質；採用熱變性的物理方法，快速清除大量耐溫性差的雜蛋白；利用CEL I是糖蛋白能與活化的刀豆凝集素結合的特點，使CELI核酸酶與刀豆凝集素結合除去其他雜蛋白，使CELI得到進一步的的純化；最後選擇DEAE-Sepharose FF作為適宜介質進行一次層析純化出CEL I。綜上，本發明方法拋棄了現有方法中的多次高速或超速離心以及多次凝膠過濾和離子交換層析的手段，採用合適的物理化學方法達到快速將CELI核酸酶從芹菜中提取出來並純化的目的。
本發明方法提取CEL I核酸酶的效率較高，每100千克芹菜經步驟1後可得總粗酶活力1.81xl07，比活9.5xl02 U/mg蛋白的粗酶液，繼續經步驟(2) (7)分離純化後可得純的CELI核酸酶1.545xl06 1.895xl06U，酶活回收率達到8.54 10.47%;所得酶的純度達電泳純，酶比活可達3xl07 U/mg蛋白。本發明方法與經典的Yang等人的方法相比，所得酶的純度及比活沒明顯差異，但回收率提高了5倍以上。附圖說
圖1是本發明方法提取核酸酶CELI的SDS—PAGE圖。圖2是本發明方法提取核酸酶CEL I的酶切鑑定圖。
具體實施方式
例l
1、製備
稱取市場上購買的西芹(即西洋芹菜)100千克，去掉葉片，加入緩衝液A8L，搗成勻漿，搾出濾液74L。用1M Tris水溶液液調整濾液的pH至8.0 (Tris液用量為7.5 L)，然後在50。C條件下保溫20分鐘後置於冰水中冷卻；5000Xg離心40分鐘，去掉殘渣，取上清液;一邊攪動一邊緩慢加入硫酸銨粉末(每升約加入144g)至25。/。的飽和度，5000Xg離心40min，去掉沉澱，收集上清液， 一邊攪拌一邊加入硫酸銨粉末至80%的飽和度(每升約加入390g)，在5000Xg條件下離心40min，去掉上清液，保留沉澱。沉澱溶於8 L緩衝液B中，用同樣的Tris緩衝液透析脫鹽。脫鹽後溶液加入刀豆凝集素200ml (已活化，且用緩衝液B平衡)，4'C下攪拌過夜，使酶與刀豆凝集素充分結合。靜置1小時，用抽濾漏鬥去掉清液，加入緩衝液C300ml (分5次進行)，充分混勻，使酶溶於緩衝液中，過濾；濾液使用超濾膜濃縮(分子量截留10000道爾頓)至30 ml，上DEAE—Se'pharose FF柱(30 mmX400 mm)，以緩衝溶液D和E各500 ml作洗脫液，採用TH-500梯度混合儀(上海滬西分析儀器廠生產)進行梯度洗脫，洗脫流速為0.5 ml/min,每8 min收集一管洗脫液；用RF-I Nicking方法檢測CELI活力高峰管，再用SDS-聚丙烯凝膠電泳法檢測其蛋白純度，之後合併蛋白為單一條帶的活力高峰管酶液，此洗脫液即為CELI核酸酶蛋白洗脫液，共獲得酶液20ml。
2、鑑定
(1) 所得酶液用SDS—PAGE檢測，在4.3kDa處可見一蛋白條帶，說明所得酶液應為CELI核酸酶，純度達電泳純(見圖l)。
(2) 蛋白質含量分析按考馬斯亮藍法測定。其原理是考馬斯亮藍G-250在游離態下呈紅色，當它與蛋白質的疏水區結合後變為青色，前者最大光吸收在465nm，後者在595nm。在一定蛋白質濃度範圍內(0 100ug/ml)，蛋白質一色素結合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質含量成正比。
(3) 所得酶液採用RF-I Nicking方法測定酶活。該方法以pUC 19為底物，用不同濃度的酶液切割，切割產物經電泳後用Gel-PRO Analyzer凝膠定量分析軟體分析RF I、 RP II和RF III各區帶螢光強度響應值。如圖2所示，欄1為Lambda DNA/Hind IIIDNA分子量標樣，欄2為RFI形式的pUC19質粒對照，用2 pl水代替酶液；欄3~7分別為反應體系中加入2 pl不同濃度的CEL I提取酶液。由於在一定酶濃度範圍內區帶的螢光強度與酶活性線性相關，利用公式I計算得出CELI核酸酶的比活。
酶活力(U/mg) =w(ri+2xr2-A:)x^xi...................................................I
/ v
結果計算結果，所提取酶液每毫升含蛋白3.158 P g、酶活力為94750 U，酶的比活為3.032Xl(^U/mg蛋白；20ml提取液中酶的總活力1.895X 106U， CELI核酸酶回收率達到10.47%。
例2
稱取市場上購買的本芹(即中國芹菜)IOO千克，去掉葉片，加入緩衝液A12L，搗成勻漿，榨出濾液77 L。用1M Tris水溶液液調整濾液的pH至8.0 (Tris液用量為7.3 L)，然後在50'C條件下保溫15分鐘後置於冰水中冷卻；3000Xg離心20分鐘，去掉殘渣，取上清液； 一邊攪動一邊緩慢加入硫酸銨粉末(每升約加入144g)至25%的飽和度，3000Xg離心20min，去掉沉澱，收集上清液， 一邊攪拌一邊加入硫酸銨粉末至80%的飽和度(每升約加入390g)，在3000Xg條件下離心20min，去掉上清液，保留沉澱。沉澱溶於8.2 L緩衝液B中，用緩衝液B透析脫鹽。脫鹽後溶液加入刀豆凝集素200ml (所用刀豆凝集素已活化，且用緩衝液B平衡)，4'C下攪拌過夜，使酶與刀豆凝集素充分結合。靜置20分鐘，用抽濾漏鬥去掉清液，加入緩衝液C280ml (分7次進行)，充分混勻，使酶溶於緩衝液中，過濾；濾液使用超濾膜濃縮(分子量截留10000道爾頓)至30 ml，上DEAE—Sepharose FF柱柱場為30mm (直徑)X400mm (高)，採用TH-500梯度混合儀(上海滬西分析儀器廠生產)進行梯度洗脫，洗脫流速為1 ml/min，每8 min收集一管洗脫液；用RF-I Nicking方法檢測CEL I活力高峰管，再用SDS-聚丙烯凝膠電泳法檢測其蛋白純度，之後合併蛋白為單一條帶的活力高峰管酶液，此洗脫液即為CELI核酸酶蛋白洗脫液，共獲得酶液24ml。按例1方法檢測，每毫升酶液含蛋白2.138 yg、酶活力為64400 U，酶的比活力為3.01 X 107; 24ml提取液酶的總活力為1.545xl06U， CELI核酸酶回收率為8.54%。用SDS—PAGE檢測，達電泳純核酸酶CELI。
例3
稱取市場上購買的西芹100千克，去掉葉片，加入緩衝液A10L，搗成勻漿，榨出濾液。用lMTris水溶液調整濾液到pH至8.0，然後在5(TC下保溫18分鐘後置於冰水中冷卻；4000Xg離心30分鐘，去掉殘渣，取上清液； 一邊攪動一邊緩慢加入硫酸銨粉末至25%的飽和度，4000Xg離心30min,收集上清液， 一邊攪拌一邊加入硫酸銨粉末至80%的飽和度，在4000Xg條件下離心30min，去掉上清液，保留沉澱。沉澱溶於7L緩衝液B中，用同樣的Tris緩衝液透析脫鹽。脫鹽後溶液加入刀豆凝集素200mL (已活化，且用緩衝液B平衡)，4'C下 攪拌過夜，使酶與刀豆凝集素充分結合。靜置40分鐘，抽濾去掉清液部份，加入緩衝液C300 ml(分5次進行)，充分混勻，使CELI核酸酶溶於緩衝液中，過濾；濾液使用超濾膜濃縮(分 子量截留10000道爾頓)至100 ml，上DEAE—Sepharose FF柱柱場為30 mm (直徑)X 400 mm (高)，採用TH-500梯度混合儀(上海滬西分析儀器廠生產)進行梯度洗脫，洗脫 流速為0.6ml/min，每8 min收集一管洗脫液；用RF-I Nicking方法檢測CEL I活力高峰管， 再用SDS-聚丙烯凝膠電泳法檢測其蛋白純度，之後合併蛋白為單一條帶的活力高峰管酶液， 此洗脫液即為CEL I核酸酶蛋白洗脫液，獲得酶液19.2 1111。按例l方法檢測，每ml酶液含 蛋白3.09mg、酶活力為92687 U，測得酶比活為3xl07 U/mg蛋白；19.2 ml酶提取液酶的總 活為1.78xl06U， CELI核酸酶回收率達9.83%。用SDS—PAGE檢測，達電泳純核酸酶CEL
Io
權利要求
1、一種提取芹菜中CEL I核酸酶的方法，該方法由以下步驟組成(1)稱取芹菜，每1kg芹菜加入80～120ml緩衝液A，搗成勻漿，壓榨出液體，過濾，用1 M的Tris溶液調節pH至8.0左右，得粗酶液；(2)將粗酶液在45～50℃下保溫15～20min，然後3000×g～5000×g離心20～40min，取上清液；(3)加入硫酸銨粉末至飽和度為25％，3000×g～5000×g離心20～40min，收集上清液；所得上清液中加入硫酸銨粉末至飽和度為80％，3000×g～5000×g離心20～40min，收集沉澱物；(4)將所得沉澱物用緩衝液B溶解，透析脫鹽；(5)加入刀豆凝集素，混勻，4～10℃下攪拌6～16小時使CEL I核酸酶與刀豆凝集素充分結合，然後靜置20～60min；(6)抽濾去清液，在濾渣中加入緩衝液C溶解出CEL I核酸酶，超濾濃縮。在4～10℃條件下，上DEAE-Sepharose FF，然後依次用洗脫液D和洗脫液E各500ml以0.5～1ml/min的流速進行梯度洗脫；(7)收集洗脫液，用RF-I Nicking方法檢測各收集管中的CEL-I核酸酶活力，合併酶活力在3×107U/mg蛋白的洗脫液；上述步驟中，所述緩衝液A由以下方法製備得到在pH8.0的0.1M Tris-HCl緩衝液中添加N2SO3和苯甲基磺醯氟至濃度分別為0.01M和1mM；所述緩衝液B由以下方法製備得到在pH8.0的0.1M Tris-HCl緩衝液中添加苯甲基磺醯氟至濃度為1mM；所述緩衝液C由以下方法製備得到在pH8.0的50mM Tris-HCl緩衝液中添加甲基甘露糖苷和Triton X-100至濃度分別為30mM和0.01％；所述洗脫液D由以下方法製備得到在pH8.0的Tris-HCl緩衝液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KCl至濃度分別為10mM、0.01％和10mM；所述洗脫液E由以下方法製備得到在pH8.0的Tris-HCl緩衝液中添加甲基甘露糖苷、TritonX-100和KCl至濃度分別為10mM、0.01％和0.5M。
全文摘要
本發明方法拋棄了現有方法中的多次高速或超速離心以及多次凝膠過濾和離子交換層析的手段，在抽提液中採用添加少量亞硫酸鈉減少和清除提取液中有色物質；採用熱變性的物理方法，快速清除大量耐溫性差的雜蛋白；利用CEL I是糖蛋白能與活化的刀豆凝集素結合的特點，使CEL I核酸酶與刀豆凝集素結合除去其他雜蛋白，使CEL I得到進一步的純化；最後選擇DEAE-Sepharose FF作為適宜介質進行一次層析純化出CEL I。這樣，我們的提取方法代替現採用多次高速甚至超速冷凍離心、多次凝膠過濾和離子交換層析等費時且昂貴的手段，達到快速將CEL I核酸酶從芹菜中提取出來並純化的目的。
文檔編號C12N9/22GK101538561SQ20091003872
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月17日 優先權日2009年4月17日
發明者李榮華, 郭培國 申請人:廣州大學