改進的螢光蛋白的製作方法

2023-05-25 23:52:36 1

專利名稱：改進的螢光蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及新型「綠色螢光蛋白」及其應用。特別地，本發明涉及特殊的GFP及其變體，這種變體是明亮且無毒的。
背景技術：
綠色螢光蛋白(GFP)最初由Chalfie分離自Aequorea Victoria，美國專利5,491,084。Ward和Chalfie在PCT公布WO 95/21191中報導對其胺基酸序列作了修飾以增加其亮度。如美國專利5,625,048和5,777,079所揭示，Tsien提供了這種蛋白質經過改進的形式，它具有不同的光譜特徵並可提供各種不同顏色的螢光。此外，對編碼這些蛋白質的核苷酸序列做了修飾以使其序列與人類細胞相容。此外，公布於1999年9月30日PCT公布WO 99/49019提供了一些與綠色螢光蛋白有關的序列信息，這些綠色螢光蛋白由分離自Renilla和Ptilocarpus的基因表達。Gurskaya，N.G.等，BMC Biochem(2002)25描述了一種突變體，這種突變體改變了來自珊瑚的螢光蛋白的發射光譜。
上述文件證實了蛋白質胺基酸序列中的變化，這種蛋白質在波長短於可提供一定顏色選擇和強度範圍的螢光波長的照射激發下產生螢光，在此將這些文件全文併入以供參考。螢光蛋白在科學研究和新項目製造(如玩具)中都有廣泛應用。由於對螢光的唯一要求是用適當波長照射，並且由於螢光是肉眼可見的，這些蛋白質被證明是方便的標記並有令人鼓舞的意想不到的應用。
已經發現螢光蛋白其它的變體有改進的亮度並具有低毒性。這些蛋白質還可被修飾以得到各種顏色的螢光並改變其強度。
發明概述發明涉及組合物和使用螢光蛋白的方法，所述螢光蛋白與

圖1B所示的核苷酸序列編碼的蛋白質同源。與已知的螢光蛋白相比，示例性的GFP包括保守性取代基和一些可使其在N-末端部分酸性減弱但在C-末端部分酸性增強的取代基。本發明涉及與一組變體有關的組合物和方法，所述變體在接近序列一半的N-末端酸性減弱同時在接近序列一半的C-末端酸性增強。本發明的蛋白質是無毒的，含有它們的細胞可存活至少4周-3，4或6個月。
因此，一方面，本發明涉及變體蛋白質本身並涉及使用這些變體的方法。另一方面，本發明涉及編碼所述變體的重組物質和用這些物質製造所述變體的方法，以及關於這些重組物質本身的其它應用。
附圖簡述圖1A顯示了推出的在這裡稱為A/C的本發明變體的胺基酸序列。圖1B顯示了假定分離自R.reniformis的核酸的核苷酸序列，所述核酸編碼圖1A的胺基酸序列。
圖2A、2B和2C顯示了基於圖1B的核苷酸序列的核苷酸序列，它經過修飾以分別與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium bongum)優選使用的密碼子一致。
圖3顯示了標示為A/C的本發明變體的胺基酸序列與綠色螢光蛋白的胺基酸序列的比較，所述綠色螢光蛋白克隆自R.mulleri。
圖4A和4B顯示了用來在各種腫瘤細胞系中製造所述變體的逆轉錄病毒載體的示意圖。所述載體被用來包裝細胞，所得病毒粒子被用來感染腫瘤細胞系。
圖5A-5C顯示了包裝細胞系PT67、黑色素瘤細胞系B16F0和前列腺癌細胞系PC3中表達的螢光蛋白的圖象。
圖6A-6D顯示了生長自肺癌細胞系H460、前列腺癌細胞系PC3、胰腺癌細胞系CAPAN-1和結腸癌細胞系PKO的腫瘤的圖象。
圖7A和7B顯示了編碼來自珊瑚的螢光蛋白第289-964位的核苷酸序列。
具體實施方案提供了改進的「綠色螢光蛋白」(GFP)和編碼它們的重組物質。這樣可使用明亮、無毒的標記以監測基因表達、標記各種細胞以及監測如PCT公布WO 98/49336所述的轉移的過程，在此將其併入有關參考。所述本發明改進的螢光蛋白提供了更敏感的評估這些現象的方法，且對細胞和整個生物無毒。因此，本發明的蛋白質在許多領域都有用，這些領域已知使用上述GFP已知形式的方法。一般GFP的製造和重組材料的使用以及所述GFP本身是此領域熟知的，有許多描述這種螢光蛋白先前已知形式的文獻。
圖1A所示的胺基酸序列的蛋白質，這裡稱為A/C，發射綠色螢光並有上述亮度和無毒特性。然而，如此領域已知，這些「綠色」螢光蛋白可被修飾，這樣它們可發出各種顏色的可見光譜的螢光。因此，通過適當修飾圖1A所列蛋白質的胺基酸序列，也可得到紅色、黃色、藍色或其它顏色的螢光。此外，通過使所述胺基酸序列做出小的改變所述螢光的亮度可調節。這些修飾的本性描述在有益的描述在，例如，美國專利5,777,079中，在此將其併入以供參考。如上所述，對在A/C序列第66位發現的絲氨酸殘基的修飾可被丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或蘇氨酸替代以得到具有紅色移位光譜(shifted spectra)的蛋白質，與未經修飾的A/C相比，這種光譜通常比較明亮。其它可影響亮度或螢光波長的修飾包括在第67位發生的那些。所述發色團似乎幾種在A/C蛋白質第66-68位，它相應於』079專利所述Aequorea野生型GFP蛋白質第65-67位。因此，第66-68位的突變對於蛋白質性質的改進特別重要。
因此，本發明包括在第66-68位中任一位尤其是在第66位上具有取代基的突變體其它對分子中1-4個胺基酸的修飾也是允許的；很小數量這種類型的突變不足以將A/C的胺基酸序列轉變為任何已知的「綠色螢光蛋白」的胺基酸序列，且對所述分子的性質有極小的影響。因此，本發明的蛋白質包括與圖1A所示的胺基酸序列至少有90％同源，優選有95％同源，最優選有99％同源的螢光蛋白。特別優選的是具有圖1A所示胺基酸序列的螢光蛋白及其變體，所示變體在第66-68位，最好在第66位至少有一個胺基酸取代。同樣優選的是上述那些來自珊瑚的蛋白質的經過修飾的類似物，如Gurskaya所示，已在上面引用。
編碼本發明螢光蛋白變體的核苷酸序列可被各種細胞表達。適合由重組系統製造蛋白質的表達系統現在通常是真核細胞、原核細胞，如酵母和真菌、高等植物、動物細胞(包括脊椎動物細胞、哺乳動物細胞，尤其是人類細胞)，和各種細胞系。合適的表達系統和載體取決於宿主的本性和所需應用。除了提供合適的表達系統，所示核苷酸序列可被修飾以將其轉變為所需宿主優選使用的密碼子。因此，圖1B所示的核苷酸序列可含有一個或多個圖2A、2B和2C所示的修飾以在指出的宿主中表達，這些宿主分別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium bongum)。因此，為在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達的序列可包含1-230個沉默鹼基改變；為在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達的序列可包含1-94個沉默鹼基改變；為在長雙歧桿菌(Bifidobacterium bongum)中表達的序列可包含1-21個鹼基改變。所有中間數目的鹼基改變也包括在本發明的範圍內。
本發明的螢光蛋白和編碼它們的重組物質可用於廣泛應用，如上面提到的PCT公布WO 99/49019中詳細列出的那些，在此將其併入以供參考。所述公布描述了許多應用，包括分析、研究、診斷和商業應用。
因此，製造本發明螢光蛋白的目的可以是獲得所示蛋白質本身以用於各種組合物和加工物品。這些螢光蛋白可用於各種項目，如玩具、玩偶、牌類遊戲、油漆、織物、氣球、化妝品和食物或任何其它設計可發光的物品或組合物。可製造所述蛋白質自身以摻入這些物品和組合物。本發明的螢光蛋白也可和其它可發出螢光或發光的物質如螢光素酶結合。』019公布描述了一些組合物，其中其它發光生物物質與螢光蛋白一起結合在同一組合物中，這樣除了被外部照射有效激發，照射波長由發光組合物質在原位產生。
綠色螢光蛋白更重要的應用在於其作為研究工具的價值。在一個實施方案中，本發明的螢光蛋白可融合或結合到導向植物或動物靶組織的抗體中。例如，可用它來標記動物中的腫瘤然後通過使螢光標記與腫瘤結合來追蹤轉移。本發明螢光蛋白可作為能以組織或細胞為目標的部分的共軛物被製備。典型的尋靶部分是組織或細胞上所呈現物質的特異性結合伴侶。典型的尋靶部分是抗體和受體的配體。
或者，含有綠色螢光蛋白的融合蛋白產品可用來監測結合蛋白的表達。此外，如例如Yang，M.等，Cancer Res.(1998)584217-4221和Yang，M.等，Cancer Res.(1999)59731-736所述，以及如Hoffman，R.M.，Cancer Metastasis Reviews(1999)17271-277所會綜述，螢光蛋白可在腫瘤中產生並被用來監測轉移。
本發明的螢光蛋白還可被用來在免疫測定等實驗中標記試劑。在一個實施例中，採用了夾層結構(sandwich)測定，其中分析物的一個特異性結合伴侶是固定分析物的捕獲部分，第二特異性結合伴侶被用來標記固定的分析物。本發明的螢光蛋白可直接被用作標記結合伴侶或第二結合伴侶上的標記，如用作第二抗體攜帶的標記以與直接結合分析物的第一抗體結合。
通過使編碼蛋白質的核酸序列與編碼本發明螢光蛋白的核苷酸序列融合也可監測蛋白質的表達。然後可通過監測所製造的融合蛋白產生的螢光來監測感興趣的蛋白質的表達。或者，可通過使編碼本發明螢光蛋白的核苷酸序列與啟動子或其它控制序列可操作連接來監測啟動子或其它控制序列影響表達的能力。再者，通過製造螢光蛋白產生了螢光，由此說明表達控制是可操作的。
上述應用僅僅是例舉說明。通常，發明的螢光蛋白可用於任何使用螢光標記的應用，包括測定修飾，如螢光偏振和螢光序列測定。本發明的螢光蛋白的其它優點在於它可原位產生，因此它們的存在或不存在或量可被用作表達的指標並在細胞內提供內部螢光源。因此，可用本發明的螢光蛋白追蹤腫瘤轉移的過程、細菌或病毒感染或是植物或動物內任何類型細胞的移動。
以下實施例僅是為了闡述而不是限制本發明。
實施例1改進的螢光蛋白的表達從Stratagene(聖地牙哥，加利福尼亞州)獲得了名為R.reniformis GFP的編碼具有如圖1A中A/C所示的胺基酸序列的螢光蛋白的核酸分子。編碼所述蛋白質的核苷酸序列被鑑定並顯示在圖1B中。
通過沉默鹼基取代所述核苷酸序列被按照圖2A-2C所述任選地修飾以最優化其在各種宿主生物中的表達。
與所述螢光蛋白的胺基酸序列顯示在圖3A中，與其相比的是申請人認為與其最相關的此領域的螢光蛋白。所述A/C蛋白質與分離自R.mulleri的核苷酸序列編碼的蛋白質的胺基酸序列有將近86％的同一性。標出了這些蛋白質的發色團部分，A/C的第66-68位和R.mulleri的第65-67位。
圖1B的核苷酸序列被插入3』LTR啟動子控制的逆轉錄病毒載體(圖4A)。在該載體中，來自圖4B所示的pFB(Stratagene)，顯示了多個克隆位點。所得載體，稱為pFB-Rmv GFP，被用來修飾PT-67包裝細胞。所述包裝細胞被培養，由於GFP蛋白的產生從而產生了明亮的綠色信號。參見圖5A。高強度可保持10天以上，這說明GFP是無毒的。
實施例2製備表達A/C螢光蛋白的細胞系用在PT-67包裝細胞系中製備的被包裝的病毒粒子感染許多腫瘤細胞系，所述細胞系有乳腺癌細胞系MX-1；前列腺癌細胞系MDA-PCA2B和PC3；胰腺癌細胞系CAPAN-1；結腸癌細胞系PKO；肉瘤細胞系MES-SA/DX5；肺癌細胞系H460、Lewis肺和A549以及黑色素瘤系B16F0。列出了其中的一些。這些細胞系發出的螢光列在圖5B(B16F0)和5C(PC3)中。所述螢光可保持數周。
實施例3腫瘤標記腫瘤是通過皮下注射無免疫應答的小鼠由轉化的細胞系生長成的，並通過監測螢光觀察腫瘤的發展情況。說明性的結果顯示在圖6A-6D中。
通過使用pFB-RWV GFP表達載體製造GFP細胞系
權利要求
1.一種含有圖1A的A/C蛋白質的胺基酸序列的螢光蛋白或一種與所述A/C蛋白質有至少90％同源性的螢光蛋白。
2.如權利要求1所示的螢光蛋白，其特徵在於，它與圖1A的A/C蛋白質有至少95％的同源性。
3.如權利要求2所示的螢光蛋白，其特徵在於，它與圖1A的A/C蛋白質至少有99％的同源性。
4.如權利要求1所示的螢光蛋白，其特徵在於，它含有圖1A的A/C蛋白質的胺基酸序列。
5.如權利要求1所示的螢光蛋白，其特徵在於，第66-68位中至少1個胺基酸被不同的胺基酸取代。
6.如權利要求5所示的螢光蛋白，其特徵在於，所述第66位的胺基酸被取代。
7.一種核酸分子，其特徵在於，所述胺基酸分子含有編碼權利要求1的螢光蛋白的核苷酸序列。
8.一種核酸分子，其特徵在於，所述胺基酸分子含有編碼權利要求4的螢光蛋白的核苷酸序列。
9.如權利要求8所示的核酸分子，其特徵在於，它含有圖1B所列的核苷酸序列，並任選地含有1或多個如圖2A、2B或2C所示的核苷酸取代基。
10.一種重組表達系統，其特徵在於，它含有編碼權利要求1的螢光蛋白的核苷酸序列，所述序列可操作地結合到控制序列以便表達。
11.一種重組宿主細胞，其特徵在於，它包括權利要求10的表達系統。
12.一種製造螢光蛋白的方法，其特徵在於，所述方法包括培養權利要求11的細胞，其中所述核酸序列被表達以製造所述螢光蛋白，以及任選地回收所述螢光蛋白。
13.與權利要求1的螢光蛋白發生特異性免疫反應的抗體。
14.一種包含與尋靶部分結合的權利要求1的蛋白質的共軛物。
15.如權利要求14所述的共軛物，其特徵在於，所述尋靶部分是抗體或受體的配體。
16.如權利要求10所述的表達系統，其特徵在於，所述編碼螢光蛋白的核苷酸序列與編碼其它蛋白質的核苷酸序列融合。
17.監控蛋白質產生的方法，其特徵在於，所述方法包括提供一表達系統，所述表達系統包括編碼所述蛋白質的第一核苷酸序列，所述蛋白質與編碼權利要求1的螢光蛋白的第二核苷酸序列融合；將所述表達系統置於可監測表達的環境中；並且評估螢光的產生，由此螢光的產生說明了所述蛋白質的表達。
18.一種評價啟動子活性的方法，其特徵在於，所述方法包括但不限於提供含有啟動子的核酸，所述啟動子可操作地連接到編碼權利要求1的螢光蛋白的核苷酸序列；將所述核酸置於可評估所述啟動子活性的環境中；監測螢光的出現和量；其中所述螢光的出現和量說明了所述啟動子的活性。
19.一種標記組織的方法，其特徵在於，所述方法包括使所述組織與權利要求14的共軛物接觸，其中所述尋靶部分是所述組織特異的。
20.一種評估腫瘤的位置和進展及其轉移的方法，其特徵在於，所述方法包括修飾所述腫瘤以表達權利要求1的螢光蛋白，並觀察螢光的位置。
21.一種改進的進行免疫測定的方法，其特徵在於，所述免疫測定包括將分析物或其類似物捕獲在夾層結構上，所述夾層結構包含與固體支持物結合的所述分析物的第一特異性結合伴侶和帶有標記的第二特異性結合伴侶，其中所述改進包括將權利要求1的螢光蛋白用作標記。
全文摘要
揭示了具有高螢光性和低毒性的螢光蛋白的改進形式。MVSKQILKNTGLQEIMSFKVNLEGVVNNHVFTMEGCGKGNILFGNQLVQIRVTKGAPLPFAFDILSPAFQYGNRTFTKYPEDISDFFIQSFPAGFVYERTLRYEDGGLVEIRSDINLIEEMFVYRVEYKGRNFPNDGPVMKKTITGLQPSFEVVYMNDGVLVGQVILVYRLNSGKFYSCHMRTLMKSKGVVKDFPEYHFIQHRLEKTYVEDGGFVEQHETAIAQLTSLGKPLGSLHEWV
文檔編號C12N15/12GK1549859SQ02804249
公開日2004年11月24日 申請日期2002年1月29日 優先權日2001年1月29日
發明者趙明, 徐明旭, 姜平, 楊萌, 明 趙 申請人:抗癌公司