一種乾酪乳桿菌及其在固態發酵中的應用的製作方法

2023-05-26 02:10:21 3

專利名稱：：一種乾酪乳桿菌及其在固態發酵中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種分離自內蒙古民族傳統乳製品一一酸馬奶中的乾酪乳桿菌aacto&c///wCwe/Zhang)菌株、該菌株在固態發酵中的應用以及菌體存活率提高的方法。
背景技術：
：眾所周知，作為一種益生菌，乳桿菌以其所具備的優良的益生特性，諸如耐酸性、耐受膽汁酸、在消化道中定殖生長以及緩解乳糖不忍耐症、抗變異突變、降低血清膽固醇、抗腫瘤、抑制腸道病原菌和抗Z/e/^^"cfer;^/w7'、改善腸道菌群和提高機體免疫功能等已經被廣泛應用於食品發酵、動物飼料及醫療保健等領域中。20世紀90年代以來，隨著能源危機與環境問題的日益嚴重，固態發酵技術以其特有的優點引起人們極大的興趣。固態發酵領域的研究及其在資源環境、蛋白質飼料中的應用取得了進展，目前它已在生物能的轉化、固態廢棄物的處理、代謝產物的生產以及微生態製劑等方面均得到了廣泛的應用，其中微生態製劑的關鍵就是要保證在製劑中有足夠多的活菌數，以保證其發揮益生菌的作用。本發明針對上述課題，從內蒙古傳統功能性發酵乳一一酸馬奶中分離乳桿菌，採用體外耐酸性試驗、耐膽酸鹽試驗、降膽固醇試驗等一系列試驗篩選一株具有潛在益生作用的乾酪乳桿菌(Z^ctok"7/wcos"'Zhang)，並通過優化固態培養基的方法達到較高菌體密度，烘乾後得到了較高的菌體存活率。
發明內容本發明的目的在於提供一種乾酪乳桿菌，所述乾酪乳桿菌"acfok^7/^cwe/Zhang)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；該菌菌株已於2006年4月21日，在地址為中國北京市海澱區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCCNo.1697。本發明的另一目的在於提供該菌株在固態發酵方面的應用，特別是作為發酵劑在乳製品、健康食品、微生物飼料以及動物保健製品中的應用。本發明的又一目的在於提供一種所述乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法。本發明的目的是通過如下技術方案實現的一種乾酪乳桿菌，所述乾酪乳桿菌(^"o力acj7hscaseiZhang)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCCNo.1697。一種乾酪乳桿菌(Zacto6a"'LiAscaseiZhang)的應用，所述乾酪乳桿菌在固態發酵中的應用。一種乾酪乳桿菌"acz^tew'Lwscase/Zhang)菌體存活率提高的方法，包括以下步驟a.菌種的活化將-84。C冷凍保存的乾酪乳桿菌"actoybac/77"sZhang)活菌體製劑約0.lml接種於5mlMRS液體培養基中，在3(TC培養24小時，傳代培養3次；b.菌懸液的製備取步驟a中傳代培養3次後的MRS液體，用無菌生理鹽水離心洗滌3次，然後用無菌生理鹽水定容至5ml，並振蕩均勻製成菌懸液；c.固態培養基的配製將培養基各成份加入250ml三角瓶中，然後加入PH值為6.5的自來水，用玻璃棒攪拌均勻，在12rc滅菌30分鐘，然後備用；d.接種與培養取步驟b製備好的菌懸液，按2%接種於固態培養基中，同時對種子液進行平板計數，作為固態發酵的起始種子濃度，然後將固態培養基在3CTC培養24-72小時，每隔12小時翻料一次；e.MRS固體平板稀釋計數及PH的測定將步驟d的培養物2g加20ml無菌生理鹽水振蕩，然後用無菌生理鹽水稀釋至107、108或109倍(一般要稀釋到每ml有30-300cfu/ml才是有效計數範圍，所以對於不同的樣品可能稀釋不同的倍數)製成菌懸液；吸取lml稀釋後的菌懸液加入到培養皿中，倒入融化後冷卻至5(TC左右的MRS瓊脂並混勻，待其完全凝固後，置於3(TC培養48小時後計數；f.發酵乾燥取5g培養物為一個樣品置於鼓風乾燥箱中進行乾燥，每個樣品均乾燥至含水率為10%以下，所述乾燥溫度為30—45'C，乾燥時間為5—7小時。本發明的乾酪乳桿菌"scz^bsciW^c^eiZhang)除具有一般乳桿菌的益生特性外，還將該菌株應用到固態發酵方面，通過對固態培養條件的優化獲得了較高的菌體密度與菌體存活率。本發明的乾酪乳桿菌(L3C"6acj77"scase/Zhang)在37度24小時的液體MRS發酵活菌數約為0.82.0X10、fo/ml(每毫升樣品中含有的細菌群落總數)，而在固態發酵中活菌數為4.56Xl(^cfU/ml;由此可知，本發明的乾酪乳桿菌固態發酵活菌數是液體MRS發酵活菌數的二十倍以上。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明；以下實施例僅為說明性的，本發明並不受這些實施例的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例l:一種乾酪乳桿菌，所述乾酪乳桿菌aacto&"//wca^'Zhang)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCCNo.1697。1.樣品的採集和乳桿菌的分離鑑定。樣品為傳統方法製作的酸馬奶，樣品採集於中國內蒙古錫林郭勒盟正藍旗。2.樣品中乳桿菌的分離和純化乳桿菌的分離純化過程如下。以內蒙古傳統功能性發酵乳一一酸馬奶為乳桿菌分離樣品，將牧民家庭自然發酵製作的酸馬奶，在其發酵容器中充分攪拌後，用帶有滅菌吸頭的移液器，吸取2mL放入帶有膠塞的滅菌小試管(15mmxl50mm)中封口，再吸取lmL放入帶螺旋帽並裝有滅菌CaC03粉的無菌、容積為2mL的採樣瓶中，擰緊螺旋帽作為備用樣品。將收集的樣品放入冰盒內冷卻，間隔一定時間更換冰袋，保持在較低溫度下帶回實驗室並放置於4'C冰箱內，儘快將乳酸菌進行分離。將乳酸菌分離時，用滅菌吸管吸取lmL酸馬奶樣品接種於10mL滅菌石蕊牛乳培養基中，置於3(TC恆溫箱內增菌培養至酸化凝固，在培養基顏色變為粉紅時將其取出，用滅菌接種環劃線接種於含有10ppm放線菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL瓊脂培養基(日本榮研株式會社製品)上，再放入BBLgaSpak厭氧培養罐中，置於30'C條件下，培養4872小時；待菌落形成後，用接種環或接種針挑取菌落，接種於TPY液體中，置於3(TC條件下，培養2448小時；待菌株生長良好後，再次劃線接種於BL瓊脂培養基中，置於30'C條件下，培養2448小時，仔細觀察記錄菌落形態和革蘭氏染色細胞形態特徵，並同時進行過氧化氫酶試驗。將革蘭氏陽性、過氧化氫酶試驗陰性的桿菌暫定為乳桿菌，並進一步接種於TPY液體中，置於30'C條件下培養24小時，經TPY液體(培養液)傳代培養三次後，取5ml乳桿菌培養液，離心洗滌(3,000rpm10min)，同法繼續23次，在離心洗滌過的菌體中加入22.5ml菌體保護液並採用冷藏、一84'C凍結保存或低溫真空冷凍保存。將從酸馬奶樣品中分離的乳桿菌菌株，經生理生化學試驗、乳酸旋光性測定等一系列試驗分析鑑定，並將鑑定後的菌株分別製成供試菌液，吸取菌懸液10pL接種於5mLPH值為3.5的MRS液體培養基，置於37。C條件下進行24h培養；同時吸取菌懸液l.OmL與9.0mLPH值為3.0的人工胃液[製備法:NaCl0.2%、胃蛋白酶(pepsin，sigma)0.35%，用lmol/LHC1調整PH值為3.0後，過濾除菌備用]混合後，置於37'C條件下進行培養，分別在開始(0h)和3h後取樣用BCP瓊脂培養基(日本榮研株式會社製品)測定活菌數，並計算菌株存活率。通過以上方法篩選出具有高耐酸性生長和耐胃酸的乳桿菌菌株，並進一步測定其在不同人工胃液和腸液中的存活能力以及通過體外耐膽鹽試驗和降低膽固醇試驗，獲得一株乾酪乳桿菌(Lacto^d//^cfiwe/Zhang)菌株。乳桿菌的鑑定分離純化的乳桿菌，經生理生化學特性分析和16SrDNA序列分析的方法鑑定，該乾酪乳桿菌Cc"力aw77"scaseiZhang)的生物學特性見表1。表1丄。co6ac/〃M5cose,'Zhang的生物學特性實驗項目結果實驗項目結果乳酸旋光性L半乳糖+tableseeoriginaldocumentpage8實施例2:—種如實施例1所述的乾酪乳桿菌的應用，所述乾酪乳桿菌在固態發酵中的應用；特別是作為發酵劑在乳製品、健康食品、微生物飼料以及動物保健製品中的應用。本發明的乾酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)具有較強的耐性和耐酸生長特性、能夠耐受人工胃腸消化液，尤其在脫脂乳液中能夠耐受pH2.0的人工胃液，能耐受的膽鹽濃度達0.6%;由於本發明的乾酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)的這種特性，所述乾酪乳桿菌在乳製品中的應用有其重要意義；乳酸菌產生的酸性代謝產物使腸道環境偏酸性，而一般消化酶的最適pH值為偏酸性(澱粉酶6.5、糖化酶4.4)，這樣就有利於營養素的消化吸收，有機酸的產生還可加強腸道的蠕動和分泌，也可促進消化吸收養分，研究表明食用酸奶的人群對乳糖的利用率比食用含相同乳糖濃度的牛奶要高，從而減輕乳糖的不耐受症狀。此外乳酸菌的抗癌作用也有不少報導。更重要的是，由於對乳酸菌代謝和遺傳特性了解的深入以及對其機理的認識，還有大量臨床試驗的結果證明將其作為保健輔佐劑，詞料添加劑的可行性，人們已經廣泛接受了乳酸菌這類保健製品。另外，口服是益生菌進入腸道的主要途徑，所以益生素在進入大腸之前必須經受胃中鹽酸和小腸中高濃度膽鹽的影響，只有在鹽酸和膽鹽中成活率高的菌株才可發揮作用；同時，產品中穩定的活菌數或者微生態製劑中活菌的數量是其發揮作用的關鍵，所以，活菌製劑的應用要求單位產品達到一定的活菌數，以符合有效治療劑量標準。因此，該菌株適用於功能性發酵乳製品的生產，也可作為功能性食品添加劑或保健製劑應用於調節免疫功能的各個方面。實施例3:—種如實施例1所述的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，包括以下步驟a.菌種的活化將-84。C冷凍保存的乾酪乳桿菌"a"o力sci77"scase/Zhang)活菌體製劑約0.lml接種於5mlMRS液體培養基中(MRS培養基蛋白腖10g牛肉膏10g酵母浸粉5g葡萄糖20g磷酸氫二鉀2g乙酸鈉5g檸檬酸三鈉2g吐溫(80)lg硫酸鎂200mg硫酸錳54mg蒸餾水1000mL，用INHC1調整MRS培養基液體的PH值至6.5，在12rC滅菌15分鐘備用)，在3(TC培養24小時，傳代培養3次。b.菌懸液的製備取步驟a中傳代培養3次後的MRS液體，用無菌生理鹽水離心(3000r/min、10min)洗滌3次，然後用無菌生理鹽水定容至5ml，並振蕩均勻製成菌懸液。c.固態培養基的配製[乾酪乳桿菌"acz^7acL^"scase/Zhang)的固態培養基優化方案]:設計一個9因素4水平的正交實驗，將培養基各成份加入250ml的三角瓶中，然後加入PH值為6.5的自來水(用1NHC1調PH至6.5)，用玻璃棒攪拌均勻，在12rC滅菌30分鐘，然後備用；各培養基組成見表2。表2丄。ctoZ)。c"tocose!'Zhang在不同固態培養基中30°C、48小時的發酵情況單位克tableseeoriginaldocumentpage1031660.21.20.20.020.010.456.182.70X1032670.30.60.10.010.0040.366.089.70X10:注試驗接入的種子量為1.0X107cfu/g乾料。由表2結果顯示，所述步驟C中固態培養基各成份按其重量比為豆粕3—6麩皮4一7乳清粉0.6—2.4葡萄糖0.2—0.5碳酸鈣0.l—O.4硫酸銨0.004—0.02硫酸鎂0.002—0.01水5—8。固態培養基水份的確定將固態培養基營養成份定為4g豆粕+5g麩皮+0.6g乳清粉+0.3g葡萄糖+0.3g碳酸鈣+0.02g硫酸銨+O.Olg硫酸鎂，然後分別添加自來水40%、45%、50%、55%、60%[以上述營養配方(不包括水)為基準的質量比]，重複步驟15，得到結果如表3。表3iacto^d//uscose!'Zhang在30°C、48小時不同水份條件下的發酵情況40%45%50%55%60%5.625.125.105.055.06CFU/g乾料4.1X1091.04X10'°2.05X10'°2.36X10102.23X101Q注試驗接入的種子量為1.0X10'Cfu/g乾料，以上數據均為三次試驗的平均值。由表3可見，選定的固態培養基中適合於乾酪乳桿菌(Za"o力sw7hsc3seiZhang)生長的最佳水份為55%，在此水份下乾酪乳桿菌to力sc^7wcssw'Zhang)可達到2.36X1010cfu/g乾料，起始接種量為1.46X107cfu/g乾料。在本實施例中，所述步驟c中最佳培養基各成份按其重量比為-豆粕4麩皮5乳清粉0.6葡萄糖0.3碳酸轉0.3硫酸銨0.02硫酸鎂0.01水7在此培養基中乾酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)可達到5.11X10、fu/g乾料，起始接種量為4.75X106cfu/g乾料。d.接種與培養取步驟b製備好的菌懸液，按2呢(v/w)接種於固態培養基中，同時對種子液進行平板計數，作為固態發酵的起始種子濃度(106107cfu/g)，然後將固態培養基在30。C培養24-72小時，也可以將固態培養基在3(TC培養48-60小時，每隔12小時翻料一次。固態培養基培養時間的確定將固態培養基營養成份定為4g豆粕+5g麩皮+0.6g乳清粉+0.3g葡萄糖+0.3g碳酸鈣+0.02g硫酸銨+0.01g硫酸鎂+7g自來水。重複步驟15，然後分別在24、36、48、60、72小時測活菌數，得到結果如表4。表4Zactoted/tocwdZhang在固態培養基中30'C不同發酵時間的發酵情況tableseeoriginaldocumentpage12注試驗接入的種子量為1.0X107cfu/g乾料，以上數據均為三:次試驗的平均值。由表4可見，乾酪乳桿菌(Za"o/acj'"〃scase/Zhang)最佳生長時間為60小時，在此時乾酪乳桿菌(Za"oZacj'l/wscaseiZhang)可達到4.56X101。cfu/g乾料，起始接種量為1.26X107cfu/g乾料。e.MRS固體平板稀釋計數及ra的測定取步驟d的培養物2g加20ml無菌生理鹽水振蕩並用無菌生理鹽水稀釋至107、108或109倍(一般要稀釋到每ml有30-300cfu/ml才是有效計數範圍，所以對於不同的樣品可能稀釋不同的倍數)製成菌懸液；吸取lml稀釋後的菌懸液加入到培養皿中，倒入融化後冷卻至5(TC左右的MRS瓊脂並混勻，待其完全凝固後，置於3(TC培養48小時後計數；同時取2g固體培養基加20ml蒸餾水，振蕩均勻後用PH計測定PH值，結果見表2。本發明最終固態條件確定為4g豆粕+5g麩皮+0.6g乳清粉+0.3g葡萄糖+0.3呂碳酸鈣+0.028硫酸銨+0.0^硫酸鎂+7§自來水。換算為百分比為23.2%豆粕+29.0%麩皮+3.5%乳清粉+1.7%葡萄糖+1.7%碳酸鈣+0.12%硫酸銨+0.058%硫酸鎂+40.6%自來水[以上百分比均為質量/質量，且比例均為以全料(包括水在內的所有物料)為基準的質量比]。本發明固態培養基最後定為23.2%豆粕+29.0%麩皮+3.5%乳清粉+1.7%葡萄糖+1.7%碳酸鈣+0.12%硫酸銨+0.058%硫酸鎂+40.6%自來水[以上比例均為以全料(包括水在內的所有物料)為基準的質量比]。將自來水調整pH值為6.5後，按40.6%加入已裝入三角瓶中的固態培養基中，用玻璃棒攪拌均勻。在12rC滅菌30min，按2%(v/w)接種於固態培養基中，同時對種子液進行平板計數，固態培養基在3(TC培養60小時，每隔12小時翻料一次；取樣並平板計數，在此時乾酪乳桿菌(^c"Z^c2'7hscaseiZhang)可達到4.56X10'°cfu/g乾料，起始接種量為1.26X107cfu/g乾料。f.發酵乾燥取5g培養物為一個樣品置於鼓風乾燥箱中進行乾燥，每個樣品均乾燥至含水率10%以下，所述乾燥溫度為30—45'C，千燥時間為5—7小時。本發明為了保證乾酪乳桿菌(Ls"c^aci""scaseiZhang)固態發酵完成後，在烘乾乾燥過程中有較高的存活率，乾酪乳桿菌(L3cto力acW7^cssej'Zhang)固態培養後千燥溫度通過如下實驗進行選擇。在上述確定的發酵條件下，固態培養乾酪乳桿菌Usc^^ciWi^csseiZhang)培養完畢後，平板計數，同時取5g培養物為一個樣品，置於鼓風乾燥箱中進行乾燥，每個樣品均乾燥至含水率10%以下。1.乾燥後含水率的測定含水率=(樣品乾燥前質量一樣品乾燥後質量)/樣品乾燥前質量><100%。待烘乾乾燥後，對每個樣品取23g，置於馬福爐中在103"烘乾2小時，然後冷卻稱重，得到每個樣品的水分含量，結果見表5。2.乾燥後活菌數的測定。待乾燥後對每個樣品取2g分別置於帶玻璃珠的20ml無菌生理鹽水中振蕩30min，然後用無菌生理鹽水稀釋至107、108或109倍(一般要稀釋到每ml有30-300cfu/ml才是有效計數範圍，所以對於不同的樣品可能稀釋不同的倍數)製成菌懸液，吸取lral稀釋後的菌懸液加入到培養皿中，倒入融化後冷卻至50"C左右MRS瓊脂，混勻。待完全凝固後，置於30'C培養48小時後計數，結果見表5。3.存活率的測定。存活率=(乾燥後活菌數/乾燥前活菌數)X100%，由以上數據得到結果見表5:表5丄a"o6^7/wcaw!'Zhang在固態培養基中發酵後不同乾燥溫度下的存活率3crc35'C40°C45。C烘前CFU/g乾料4.82X10'D2.27X10'°4.85X10'°5.2X10'°烘後CFU/g乾料3.31X1093.98X1092.7X1092.06X109存活率6.82%17.51%5.57%3.96%烘乾時間(小時)6.55.55.57烘乾前含水率52.9%53.4%53.8%53.6%烘乾後含水率8.50%8.57%5.50%4.02%注試驗接入的種子量為1.0X107Cfu/g乾料，以上數據均為三次試驗的平均值。由表5數據可知，發酵結束後，在35'C下乾燥5.5小時，乾酪乳桿菌(Zac勵aci^wsc雄iZhang)的含水率從53.4%降為8.57%，存活率可達到17.51%。本發明確定了乾酪乳桿菌(Lacz^fe"7^AScaseiZhang)固態發酵後最佳乾燥條件為35'C、5.5小時，固態培養基含水率降為8.57%，該菌的存活率可達到17.51%。權利要求1、一種乾酪乳桿菌，其特徵在於所述乾酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCCNo.1697。2、一種如權利要求l所述的乾酪乳桿菌的應用，其特徵在於所述乾酪乳桿菌在固態發酵中的應用。3、根據權利要求2所述的乾酪乳桿菌的應用，其特徵在於作為發酵劑在乳製品、健康食品、微生物飼料以及動物保健製品中的應用。4、一種如權利要求1所述的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，包括以下步驟a.菌種的活化將-84。C冷凍保存的乾酪乳桿菌(Z^c^^aw77iAcase/Zhang)活菌體製劑約0.lml接種於5mlMRS液體培養基中，在3(TC培養24小時，傳代培養3次；b.菌懸液的製備取步驟a中傳代培養3次後的MRS液體，用無菌生理鹽水離心洗滌3次，然後用無菌生理鹽水定容至5ml，並振蕩均勻製成菌懸液；c.固態培養基的配製將培養基各成份加入250ml三角瓶中，然後加入PH值為6.5的自來水，用玻璃棒攪拌均勻，在12rC滅菌30分鐘，然後備用；d.接種與培養取步驟b製備好的菌懸液，按2%接種於固態培養基中，同時對種子液進行平板計數，作為固態發酵的起始種子濃度,然後將固態培養基在3(TC培養24-72小時，每隔12小時翻料一次；e.MRS固體平板稀釋計數及PH的測定將步驟d的培養物2g加20ml無菌生理鹽水振蕩，然後用無菌生理鹽水稀釋至107、108或109倍製成菌懸液；吸取lml稀釋後的菌懸液加入到培養皿中，倒入融化後冷卻至5(TC的MRS瓊脂培養基並混勻，待其完全凝固後，置於3(TC培養48小時後計數；f.發酵乾燥取5g培養物為一個樣品置於鼓風乾燥箱中進行乾燥，每個樣品均乾燥至含水率10%以下，所述乾燥溫度為30—45'C，乾燥時間為5—7小時。5、根據權利要求4所述的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，其特徵在於:所述步驟c中培養基各成份按其重量比為豆粕3—6麩皮4一7乳清粉0.6—2.4葡萄糖0.2—0.5碳酸鈣0.1—0.4硫酸銨0.004—0.02硫酸鎂0.002—0.01水5—8。6、根據權利要求5所述的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，其特徵在於所述步驟c中培養基各成份按其重量比為豆粕4麩皮5乳清粉0.6葡萄糖0.3碳酸鈣0.3硫酸銨0.02硫酸鎂0.01水7。7、根據權利要求4所述的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，其特徵在於所述步驟d中固態培養基培養時間為60小時。8、根據權利要求4所述的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，其特徵在於:所述步驟f中乾燥溫度為35°C，乾燥時間為5.5小時。全文摘要本發明涉及一種乾酪乳桿菌及其在固態發酵中的應用。所述乾酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCCNo.1697。本發明的乾酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZhang)能實現在固態發酵方面的應用，特別是作為發酵劑在乳製品、健康食品、微生物飼料以及動物保健製品中的應用；本發明的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，是一種優化固態培養基的方法，能得到較高的菌體密度和菌體存活率；本發明的乾酪乳桿菌固態發酵活菌數是液體MRS發酵活菌數的二十倍以上。文檔編號C12N1/20GK101338283SQ20071011848公開日2009年1月7日申請日期2007年7月6日優先權日2007年7月6日發明者孟和畢力格,崔景麗,張和平,高鵬飛申請人:內蒙古農業大學