一種菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法
2023-05-26 11:02:36
一種菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種菸草花葉型病株中菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、菸草脈帶花葉病毒3種病毒的檢測方法。通過菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、菸草脈帶花葉病毒特異性混合抗體誘捕病樣中病毒，不必提取樣品總RNA進行隨機引物逆轉錄和特異性病毒引物複合PCR反應，專門針對菸草生產過程對菸草中上部葉片為害較為嚴重且不能從症狀區分病原而建立的一種單管同時檢測3種病毒中的1、2或3種不同病毒組合的方法，檢測時間僅需5小時。本方法將快速、特異的免疫沉澱與靈敏的複合RT-PCR結合，同時設置健康菸草隨機引物cDNA產物和相應病毒PCR特異片段陽性質粒作為陰、陽性對照，從而快速、準確、靈敏的檢測田間菸草植株樣品、抗病毒材料及田間環境疑似侵染源等。
【專利說明】一種菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物病毒學檢測【技術領域】，具體涉及一種菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法。
【背景技術】
[0002]菸草病毒病是一類在菸草上普遍發生且危害嚴重的侵染性病害，也是世界範圍內的重要病害之一。20世紀50年代以來，菸草病毒病先後在世界各主產煙區相繼暴發流行，並日趨嚴重，引起了世界各菸草種植國的廣泛關注。尤其是自20世紀80年代以後，菸草作為一種重要的經濟作物，其病原病毒得到了廣泛而深入地研究。
[0003]雲南作為我國最大菸草種植區，常年菸草植煙面積約為700萬畝左右，是我省農業生產主要經濟作物之一。近年來，由於栽培方式變化、菸草品種單一化以及環境中毒源的不斷積累，菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒屬病毒成為雲南煙區病毒病原，其為害範圍和嚴重程度年度間波動加大，對不同煙區的菸草生產帶來較大的影響，明確各種病原的侵染循環途經和重要中間寄主，才能有效降低病害對菸葉產質量的危害。
[0004]菸草花葉病毒是(Tobacco mosaic virus, TMV)是菸草花葉病毒屬(Tobamovirus)的典型成員，病毒粒子為長杆狀，長300~310 nm，直徑18 nm，粒子中央有一個寬約2.3nm的心線，病毒粒子呈螺旋對稱結構。病毒粒子非常穩定，體外存活期(LIV)約3000天(Andrew M.Q.King等，Virus Taxonomy, 2012)。該病毒病自苗期至大田期均可發生，主要症狀表現為輕微花葉、重花葉、斑塊狀褪綠及黃化。苗期感染導致植株矮化，花葉在發病後期可產生褐色壞死斑點。菸草花葉病毒主要通過病汁液接觸傳播，有時也通過胚帶毒的種子傳播，但在菸草中未發現病毒可侵染胚，此外還可通過嫁接傳毒(雲南省菸草科學研究所，菸草微生物學，2008年)。
[0005]黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cu`cumovirus)的典型成員。該病毒具有非常寬的寄主範圍，可通過多種蚜蟲以非持久方式傳播侵染多種雙子葉和單子葉植物。病毒粒子為等軸對稱的二十面體，無包膜，三個組分的粒子大小一致，直徑為28~30 nm。病毒含有4份基因組，即RNA1、RNA2、RNA3和RNA4，，通常還存在衛星RNA分子。菸葉粗汁液的鈍化溫度為55~70°C，10min，稀釋限點(DEP)為1X10-3~I X 10-6，體外存活期(LIV) I~10天(Andrew M.Q.King等,Virus Taxonomy, 2012)。CMV可在菸草整個生育期侵染危害,通常引起菸草葉片出現深綠、淺綠相間的花葉，且常呈現多種畸形，病葉或變窄、變薄、扭曲、無光澤；或發脆，葉基變長，葉尖細長；有的病葉葉緣上卷，或出現黃綠色或深綠色的泡斑；有時葉片側脈出現褐色壞死斑，或沿葉脈有深褐色的閃電狀壞死；早期感染病毒的煙株矮縮、根系發育不良(雲南省菸草科學研究所，菸草微生物學，2008年)。
[0006]菸草脈帶花葉病毒(Tobaccovein banding mosaic virus, TVBMV)屬於馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員。病毒粒子呈彎曲線狀，無包膜，長約600~750nm，直徑11~13nm，螺旋對稱結構，可在感病寄主體內形成風輪狀內含體。菸葉粗汁液的鈍化溫度為50~62°C，10min，稀釋限點(DEP)為1X10-2~1X10-6，體外存活期(LIV)7 ~50 天(Andrew M.Q.King 等，Virus Taxonomy, 2012)。病毒引起的主要症狀表現為發病初期葉片中脈出現明脈及斑駁症狀，不久葉脈兩側的組織呈深綠色帶狀斑(通稱脈帶)。常可延伸到小葉脈，最終葉脈及鄰近葉組織變成褐色到黑色壞死斑，可引起全株死亡。自然條件下，TVBMV主要靠多種蚜蟲以非持久方式傳毒。帶毒蚜蟲、田間帶病毒茄科作物及雜草是大田傳播的主要毒源。在人工接種時，可通過機械摩擦傳播(雲南省菸草科學研究所，菸草微生物學，2008年)。
[0007]2012-2013年在雲南各植煙區田間調查發現，在菸草生長中後期，菸草花葉型病毒病發生危害普遍且嚴重影響了菸葉產質量，經系統檢測鑑定，這一時期主要病原為菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和菸草脈帶花葉病毒，但田間對這類花葉型病毒病病原難以通過症狀區分，因此無法制定有效的病害預防措施；在研究病害侵染循環和病害發生早期，利用血清學檢測方法檢測時，其檢測靈敏度不能較好地確定不同病毒的侵染情況，因此，需要建立一種可以大量、快速、準確、靈敏的檢測方法對不同時期病樣以及田間周邊環境中病毒傳播介體、中間寄主等進行檢測。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在於提供一種菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法。
[0009]本發明的目的是這樣實現的，包括前處理、PCR反應、電泳檢測步驟，具體包括:
A、前處理:待測樣品與DEPC處理的PBST溶液混合後進行研磨，離心後取上清液備用；根據GenBank序列資料庫中菸草花葉病毒序列，選擇單一病毒中較為保守的區域設計引物，不同病毒間試驗優化不同引物對間的影響篩選用於複合PCR的不同病毒檢測引物對，在PCR管中加入用DEPC溶液稀釋的病毒特異性抗體，混合抗體包被於無RNA酶及DNA酶的PCR管備用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉或沉澱對應的病毒粒子，吸出PCR管中液體，用經DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR管內壁2~4次，吸出PCR管中液體，再用DEPC處理水洗滌f 2次PCR管內壁，吸出PCR管中液體，離心，吸淨PCR管中液體，PCR管3飛。C放置待用；
B、PCR反應:在PCR管中以病毒RNA作為模板，利用9個單核苷酸鹼基的隨機引物進行逆轉錄反應，合成cDNA鏈，應用菸草花葉病毒引物對進行複合PCR反應；
C、電泳檢測:取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0010]本發明將病毒特異性抗體與病毒結合的免疫沉澱技術與多引物複合反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)結合，第一部分的免疫反應類似於普通的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的包被和吸附過程，第二部分為隨機引物逆轉錄合成不同種類病毒的cDNA第一鏈，第三部分應用不同種病毒經篩選獲得的不同片段大小的特異性引物進行PCR檢測。本發明整個方法通過病毒混合抗體富集病毒粒子、隨機引物合成不同種類病毒cDNA第一鏈、3種病毒特異引物複合PCR檢測，省略了繁瑣的RNA提取、單一病毒引物逆轉錄合成cDNA第一鏈和病毒核苷酸序列測定與分析等步驟，利用抗體的高效價及特異性以及PCR的快速和靈敏性獲得目的片段，為大量、快速、準確、靈敏檢測田間菸草花葉型病毒病樣品建立了一種科學的方法。本發明的方法應用不同病毒特異抗體的特異和高靈敏度的免疫捕捉(或沉澱)，設計獨特的多重PCR引物，在單管中完成病毒的RT-PCR檢測，從而快速、特異、靈敏的檢測樣品中的菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、菸草脈帶花葉病毒。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明工作流程示意圖；
圖2為2013年雲南昆明、曲靖、玉溪、大理、紅河、保山田間菸草樣品中菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、菸草脈帶花葉病毒三種病毒不同組合的檢測結果；
圖中:M為DL2000分子量Maker ； 1-4分別代表待測病毒陰性、TMV陽性、CMV陽性、TVBMV陽性；5-50分別代表不同待測樣品。
【具體實施方式】
[0012]下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或替換，均屬於本發明的保護範圍。
[0013]本發明所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，包括前處理、PCR反應、電泳檢測步驟，具體包括:
A、前處理:待測樣品與DEPC(焦炭酸二乙酯)處理的PBST溶液混合後進行研磨，離心後取上清液備用；根據GenBank序列資料庫中菸草花葉病毒序列，選擇單一病毒中較為保守的區域設計引物，不同病毒間試驗優化不同引物對間的影響篩選用於複合PCR的不同病毒檢測引物對，在PCR管中加入用DEPC (焦炭酸二乙酯)溶液稀釋的病毒特異性抗體，混合抗體包被於無RNA酶及DNA酶的PCR管備用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置
0.5^1.5h以捕捉或沉澱對應的病毒粒子，吸出PCR管中液體，用經DEPC (焦炭酸二乙酯)處理的PBST溶液洗滌PCR管內壁2~4次，吸出PCR管中液體，再用DEPC (焦炭酸二乙酯)處理水洗滌廣2次PCR管內壁，吸出PCR管中液體，離心，吸淨PCR管中液體，PCR管3飛。C放置待用；
B、PCR反應:在PCR管中以病毒RNA作為模板，利用9個單核苷酸鹼基的隨機引物進行逆轉錄反應，合成cDNA鏈，應用菸草花葉病毒引物對進行複合PCR反應；
C、電泳檢測:取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0014]所述的「9個單核苷酸鹼基的隨機引物」為購自由上海英俊生物技術有限公司、生工生物工程(上海)有限公司、寶生物工程(大連)合成。
[0015]所述的菸草花葉型病毒為菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和/或菸草脈帶花葉病毒。
[0016]A步驟中所述的混合抗體包被為在PCR管中加入終濃度分別為1:10000、1:5000和1:5000的菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、菸草脈帶花葉病毒多抗稀釋液100 μ 1，3-5。C包被過夜或36~38°C包被0.5~1.5h後，吸出PCR管中液體，用經DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR內壁1-3次，吸進管中液體，PCR管待用。
[0017]所述的DEPC處理的PBST溶液為含有0.01%吐溫20的0.lmol/L,pH7.0的磷酸鹽緩衝液中加入0.2%DEPC充分混勻後放置過夜，高壓滅菌30min得到。
[0018]A步驟中所述的待測樣品與DEPC處理的PBST溶液的重量比為1:5~10。
[0019]A步驟中所述的D EPC處理水為超純水中加入0.2%DEPC充分混勻後放置過夜，121 °C高溫高壓滅菌30min得到。[0020]A步驟中所述的離心轉速為5000~10000r/min,離心5~IOmin0
[0021]B步驟所述的RNA模板為高溫變性法、沉澱法、抗體捕獲法獲得。
[0022]B步驟所述的菸草花葉病毒引物對為:(見表1)
表1用於複合PCR檢測的菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、菸草脈帶花葉病毒引物
【權利要求】
1.一種菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於包括前處理、PCR反應、電泳檢測步驟，具體包括: A、前處理:待測樣品與DEPC處理的PBST溶液混合後進行研磨，離心後取上清液備用；根據GenBank序列資料庫中菸草花葉病毒序列，選擇單一病毒中較為保守的區域設計引物，不同病毒間試驗優化不同引物對間的影響篩選用於複合PCR的不同病毒檢測引物對，在PCR管中加入用DEPC溶液稀釋的病毒特異性抗體，混合抗體包被於無RNA酶及DNA酶的PCR管備用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉或沉澱對應的病毒粒子，吸出PCR管中液體，用經DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR管內壁2~4次，吸出PCR管中液體，再用DEPC處理水洗滌f 2次PCR管內壁，吸出PCR管中液體，離心，吸淨PCR管中液體，PCR管3飛。C放置待用； B、PCR反應:在PCR管中以病毒RNA作為模板，利用9個單核苷酸鹼基的隨機引物進行逆轉錄反應，合成cDNA鏈， 應用菸草花葉病毒引物對進行複合PCR反應； C、電泳檢測:取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2.根據權利要求1所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於所述的菸草花葉型病毒為菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和/或菸草脈帶花葉病毒。
3.根據權利要求1所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於A步驟中所述的混合抗體包被為在PCR管中加入終濃度分別為1:10000、1:5000和1:5000的菸草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、菸草脈帶花葉病毒多抗稀釋液100 μ 1，3飛。C包被過夜或36~38°C包被0.5^1.5h後，吸出PCR管中液體，用經DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR內壁f 3次，吸進管中液體，PCR管待用。
4.根據權利要求1或3所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於所述的DEPC處理的PBST溶液為含有0.01%吐溫20的0.lmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩衝液中加入0.2%DEPC充分混勻後放置過夜，高壓滅菌30min得到。
5.根據權利要求1所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於A步驟中所述的待測樣品與DEPC處理的PBST溶液的重量比為1:5~10。
6.根據權利要求1所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於A步驟中所述的DEPC處理水為超純水中加入0.2%DEPC充分混勻後放置過夜，121°C高溫高壓滅菌30min得到。
7.根據權利要求1所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於A步驟中所述的離心轉速為5000~10000r/min,離心5~lOmin。
8.根據權利要求1所述的菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於B步驟所述的RNA模板為高溫變性法、沉澱法、抗體捕獲法獲得。
9.根據權利要求1所述菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於B步驟所述的菸草花葉病毒引物對為:
10.根據權利要求1所述菸草花葉型病毒的快速靈敏檢測方法，其特徵在於所述的PCR反應的體系為50 μ L，其中10倍Taq酶緩衝液5 μ LUO mmol/L濃度的6種引物各Iμ L,2.5 mmol/L dNTPs 3 yL、Taq酶I μ L、滅菌超純水15 μ L ;反應條件為94°C預變性4min ;94°C變性 lmin, 58°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30 個循環；最後 72°C延伸 10 min。
【文檔編號】C12Q1/70GK103740865SQ201410034604
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月25日 優先權日:2014年1月25日
【發明者】秦西雲, 丁銘, 盧訓, 張仲凱, 方敦煌, 李婷婷, 方琦 申請人:雲南省菸草農業科學研究院, 雲南省農業科學院生物技術與種質資源研究所