包含治療劑的新型熱敏脂質體的製作方法

2023-05-26 06:04:01 5

專利名稱：包含治療劑的新型熱敏脂質體的製作方法
包含治療劑的新型熱敏脂質體
背景技術：
脂質體已經被用於遞送很多種治療劑。例如，抗腫瘤劑，如放線菌素(美國專利 第3，993，754號)、蒽環類(美國專利第4，863，739號)以及長春花生物鹼(美國專利第 4，952，408號)已經被包封於脂質體中。新近，已經製備出包含活性劑的熱敏脂質體並用 於向受試者的特定靶點遞送活性劑(美國專利第6，200, 598號和第6，726，925號、以及 Yatvin等，Science204:188 (1979))。在應用中，向受試者遞送熱敏脂質體並加熱受試者的 靶區域。當熱敏脂質體到達被加熱的區域時，其經歷凝膠向液體的相變並釋放活性劑。該 技術的成功需要脂質體的凝膠向液體的相變溫度處在受試者可以接受的溫度範圍內。本領域還需要可以在受試者可接受的溫度下進行凝膠向液體相變的脂質體，該脂 質體被配製成包封治療劑，如抗腫瘤劑。本發明滿足了這種需要及其它需要。發明概述在一個實施方案中，本發明提供了熱敏脂質體。本發明的熱敏脂質體一般包含至 少一種磷脂醯膽鹼、至少一種磷脂醯甘油以及至少一種溶血脂質(Iysolipid)。本發明的熱 敏脂質體普遍會具有大約39. 0°C至大約45°C的凝膠向液體的相變溫度。任選地，本發明的 熱敏脂質體可以包含一種或多種其它的脂質成分，例如可以包含聚乙二醇化的磷脂。根據 本發明的熱敏脂質體還可以包含一種或多種活性劑，例如治療劑、顯像劑、診斷劑及它們的 組合。在特定的實施方案中，磷脂醯膽鹼為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)，磷脂醯甘油為 二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)，溶血脂質為單硬脂醯磷脂醯膽鹼(MSPC)，並且熱敏脂質體包 含聚乙二醇化的磷脂，例如PEG-2000改性的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG2000)或 PEG-5000改性的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG5000)。本發明的熱敏脂質體可以包含 任意比率的磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、溶血脂質以及聚乙二醇化的磷脂，只要凝膠向液體的 相變溫度在大約39.0°C至大約45°C的範圍內。通常，本發明的脂質體可以包含以下範圍內 的以下重量比率的組分，磷脂醯膽鹼60-80 磷脂醯甘油6-12 溶血脂質6-12 聚乙二 醇化的磷脂4-15 活性劑1-30。例如，本發明的熱敏脂質體可以包含的重量比率為DPPC 60-80 DSPG 6-12 MSPC 6-12 DSPE-PEG20004-15 活性劑 1-30。本發明的熱敏脂質體可以包含一種或多種活性劑。本領域技術人員已知的任何活 性劑都可以與本發明的熱敏脂質體組合，用於將活性劑遞送到受試者的選定部位。如本發 明所用的，受試者是指任何哺乳動物，特別是人、貓或狗。在一個實施方案中，本發明的熱 敏脂質體包含一種或多種抗癌劑。適合的抗癌劑的例子包括但不限於，烷化劑、抗代謝物、 紡錘體毒素植物生物鹼、細胞毒性抗腫瘤抗生素、蒽環類抗生素、植物生物鹼、紫杉醇的衍 生物、拓撲異構酶抑制劑、單克隆抗體或其片段、光敏劑、激酶抑制劑、抗腫瘤酶和酶的抑制 劑、細胞凋亡誘導劑、生物反應調節劑、抗激素、類視黃醇和含鉬化合物。在一個特定的實施 方案中，本發明的熱敏脂質體可以包含紫杉烷，例如多烯紫杉醇。在另一個特定的實施方案 中，本發明的熱敏脂質體可以包含鉬化合物，如卡鉬或順鉬。本發明還提供了包含本發明的熱敏脂質體的藥物組合物，該熱敏脂質體包含活性
4劑。在這樣的藥物組合物中，本發明的熱敏脂質體通常包含至少一種磷脂醯膽鹼、至少一種 磷脂醯甘油、至少一種溶血脂質，並且該熱敏脂質體具有大約39. 0°C至大約45°C的凝膠向 液體的相變溫度。用於本發明的藥物組合物的熱敏脂質體還可以包含聚乙二醇化的磷脂。在用於本發明的藥物組合物的適合的熱敏脂質體的一個例子中，磷脂醯膽鹼為二 棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)，磷脂醯甘油為二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)，溶血脂質為單硬脂 醯磷脂醯膽鹼(MSPC)，並且熱敏脂質體包含聚乙二醇化的磷脂，例如PEG-2000改性的二硬 脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG2000)。本發明這樣的熱敏脂質體可以包含任意比率的磷脂 醯膽鹼、磷脂醯甘油、溶血脂質和聚乙二醇化的磷脂，只要凝膠向液體的相變溫度處在大約 39.0°C至大約45°C的範圍內。通常，用於本發明的藥物組合物的脂質體可以包含以下範圍 內的以下重量比率的組分，磷脂醯膽鹼60-80 磷脂醯甘油6-12 溶血脂質6-12 聚乙 二醇化的磷脂4-15 活性劑1-30。例如，本發明的熱敏脂質體可以包含的重量比率為DPPC 60-80 DSPG 6-12 MSPC 6-12 DSPE-PEG20004-15 活性劑 1-30。任何活性劑都可以包括在本發明的藥物組合物中，例如，治療劑和/或顯像劑。在 一個實施方案中，活性劑可以是抗癌劑。適合的抗癌劑的例子包括但不限於，烷化劑、抗代 謝物、抗腫瘤抗生素、蒽環類抗生素、植物生物鹼、紫杉醇的衍生物、拓撲異構酶抑制劑、單 克隆抗體、光敏劑、激酶抑制劑和含鉬化合物。在一個特定的實施方案中，本發明的熱敏脂 質體可以包括蒽環類抗生素，例如，多烯紫杉醇。在一個特定的實施方案中，本發明的熱敏 脂質體可以包括含鉬化合物，例如卡鉬或順鉬。本發明還提供利用本發明的熱敏脂質體治療受試者疾病的方法。這樣的熱敏脂質 體通常會包含一種或多種可以用於治療疾病的活性劑。根據本發明治療需要治療的受試者 疾病的方法，可以包括向受試者給予治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含含有活 性劑的溫敏脂質體，其中所述的脂質體包含至少一種磷脂醯膽鹼、至少一種磷脂醯甘油，至 少一種溶血脂質，並且具有大約39. 0°C至大約45°C的凝膠向液體的相變溫度。然後加熱具 有一些或全部患病組織的受試者的部位，達到足以導致脂質體由凝膠向液體相變的溫度， 從而在患病組織附近釋放活性劑。用於本發明方法的熱敏脂質體還可以包含聚乙二醇化的 磷脂，例如，DSPE-PEG2000 或 DSPE-PEG5000。在用於本發明方法的熱敏脂質體的一個例子中，磷脂醯膽鹼為二棕櫚醯磷脂醯膽 鹼(DPPC)，磷脂醯甘油為二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)，溶血脂質為單硬脂醯磷脂醯膽鹼 (MSPC)。用於本發明方法的這樣的熱敏脂質體可以包含任意比率的磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘 油、溶血脂質和聚乙二醇化的磷脂，只要凝膠向液體的相變溫度在大約39°C至大約45°C的 範圍內。通常，用於本發明的治療方法的脂質體可以包含以下範圍內的以下重量比率的組 分，磷脂醯膽鹼60-80 磷脂醯甘油6-12 溶血脂質6-12 聚乙二醇化的磷脂4_15 活性劑1-30。例如，本發明的熱敏脂質體可以包含的重量比率為DPPC 60-80 DSPG 6-12 MSPC 6-12 DSPE-PEG20004-15 活性劑 1-30。在一個實施方案中，本發明包括一種治療需要治療的受試者的癌症的方法，該方 法包括向受試者給予治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含含有抗癌劑的溫敏脂質 體，其中所述脂質體包含至少一種磷脂醯膽鹼、至少一種磷脂醯甘油，至少一種溶血脂質， 並且具有大約39. 0°C至大約45°C的凝膠向液體的相變溫度。適合的抗癌劑的例子包括但 不限於，烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、蒽環類抗生素、植物生物鹼、紫杉醇的衍生物、拓撲異構酶抑制劑、單克隆抗體、光敏劑、激酶抑制劑和含鉬化合物。在一個實施方案中，抗癌 劑可以是蒽環類抗生物，例如多烯紫杉醇。在一個特定的實施方案中，本發明的熱敏脂質體 可以包含含鉬化合物，例如卡鉬或順鉬。附圖簡述

圖1為表示本發明示例性熱敏脂質體由凝膠向液體的相變的差示掃描量熱分析 (DSC)跡線(trace)。圖2為以顆粒大小作為凍幹脂質體製劑中冷凍保護劑的量的函數的圖。圖3為以本發明的凍幹脂質體再水化時的顆粒大小作為冷凍期間不同溫度速率 下脂質體含水量的函數的圖。圖4A為用於測試保持(standing on)本發明再水化脂質體顆粒大小的作用的方 案的示意圖。圖4B為顯示經過一小時時間，本發明的再水化脂質體的顆粒大小分布的圖。圖5為熱敏卡鉬脂質體的顆粒大小分布的線形圖。圖6為熱敏卡鉬脂質體的顆粒大小分布的柱狀圖。圖7為在37°C (空心菱形)和42°C (實心菱形)下，藥物釋放作為時間的函數的 線形圖。圖8為顯示在不同溫度下，5分鐘(藍色)和10分鐘(紅紫色)卡鉬釋放的柱狀 圖。發明詳述本發明的熱敏脂質體通常包含一種或多種磷脂醯膽鹼。可以用於實施本發明的磷 脂醯膽鹼的適合的例子包括但不限於，1,2- 二月桂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DLPC)、 1，2- 二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DMPC) ,1,2- 二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷 酸膽鹼(DPPC) ,1,2- 二硬脂醯基-sn-甘油基_3_磷酸膽鹼(DSPC) ,1,2- 二油醯基-sn-甘 油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)和1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)。本發明的熱敏脂質體通常包含一種或多種磷脂醯甘油。磷脂醯甘油的適合的例 子包括但不限於，1，2_ 二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DMPG)、1，2-二棕櫚醯 基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DPPG)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DSPG) 和1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(POPG)。本發明的熱敏脂質體通常包含一種或多種溶血脂質。本發明所使用的「溶血脂質」 是指磷脂酸的任何衍生物(1，2-二醯基-sn甘油基-3-磷酸酯)，其僅包含一個共價連接到 甘油部分的醯基鏈。磷脂酸的衍生物包括但不限於，磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油和磷脂醯乙醇 胺。本領域技術人員已知的任何溶血脂質都可以用於實施本發明。本發明的熱敏脂質體通常包含一種或多種聚乙二醇化的磷脂。聚乙二醇化的磷脂 的適合的例子包括但不限於，1，2-二醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙 二醇)_350] (mPEG 350PE)、1，2-二醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚乙 二醇)_550] (mPEG 550PE)、1，2-二醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚乙 二醇)-750] (mPEG 750PE)、1，2-二醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚乙二 醇)-1000] (mPEG 1000PE)、1，2-二醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚乙二 醇)-2000] (mPEG2000PE)、l，2-二醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二 醇)-3000] (mPEG 3000PE)、1，2-二醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚乙二醇)-5000] (mPEG 5000PE)、PEG-2000 改性的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG2000)和 PEG-5000改性的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG5000)。活性劑本發明的熱敏脂質體可以配製成包含一種或多種活性劑。本發明使用的「活性劑」 包括期望被遞送到受試者的特定部位的任何化合物。任何活性劑都可以用於實施本發明。抗癌劑可以用作本發明熱敏脂質體中的活性劑。抗癌劑的適合的例子包括烷化劑，例如，氮芥類(例如，苯丁酸氮芥、氮芥、環磷醯胺、異環磷醯胺、苯丙氨酸 氮芥)，亞硝基脲類(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、鏈脲佐菌素)，含鉬化合物(例 如，卡鉬、順鉬、奧沙利鉬、BBR3464)，白消安，達卡巴嗪，雙氯乙基甲胺(Mechlorethamine)， 甲基苄胼，替莫唑胺，塞替派和尿嘧啶氮芥；抗代謝物，以例如，葉酸(例如氨基蝶呤、氨甲蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞)，嘌呤代 謝(例如克拉屈濱、氯法拉濱、氟達拉濱、巰基嘌呤、噴司他丁、硫鳥嘌呤)，嘧啶代謝(例如 卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱)為靶點；紡錘體毒素植物生物鹼，例如，紫杉烷(例如多烯紫衫醇、紫杉醇)和長春花(例 如長春花鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞賓)；細胞毒性/抗腫瘤抗生素，例如，蒽環類抗生素(例如柔紅黴素、阿黴素、表柔比 星、伊達比星、米託蒽醌、戊柔比星、洋紅黴素、nacetyladriamycin、柔紅黴素苯腙、5-亞氨 基柔紅黴素(5-imidodaunomycin)、N30乙醯柔紅黴素(acetyldaunomycin)禾口表柔比星)， 博來黴素，絲裂黴素和放線菌素；拓撲異構酶抑制劑，例如，喜樹鹼類(例如喜樹鹼、拓撲替康、伊立替康)，鬼臼(例 如依託泊苷、替尼泊苷)。單克隆抗體或其片段，例如阿侖單抗(Alemtuzumab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、 西妥昔單抗(Cetuximab)、吉妥單抗(Gemtuzumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、利妥昔單抗 (Rituximab)、託西莫單抗(Tositumomab)禾口曲妥珠單抗(Trastuzumab)；光敏劑，例如氨基乙醯丙酸、氨基乙醯丙酸甲酯、嚇吩姆鈉和維替泊芬；激酶抑制劑，例如達沙替尼(Dasatinib)、埃羅替尼(Erlotinib)、吉非替尼 (Gefitinib)、伊馬替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、尼羅替尼(Nilotinib)、索拉 非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)和凡德他尼(Vandetanib)；酶，例如天冬醯胺酶、培門冬酶，和酶抑制劑，如羥基脲；細胞凋亡誘導劑，例如三氧化二砷、萬珂(Velcade)和奧利默森鈉(Genasense)；生物反應調節劑，例如地尼白介素(Denileukin Diftitox)；抗激素，例如醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲地孕酮、他 莫昔芬(Tamoxiifen)、託瑞米芬、氟維司群、睪內酯、阿那曲唑、依西美坦和來曲唑；以及類視黃醇，如9-順_視黃酸和全-反-視黃酸。在其它實施方案中，本發明的熱敏脂質體可包含多於一種的抗腫瘤劑，或者多於 一種的熱敏脂質體可以用於本發明的方法，其中每種熱敏脂質體包含不同的活性劑，例如 不同的抗癌劑。可以用於實施本發明的其它活性劑包括但不限於，抗生素、抗真菌劑、抗炎劑、免 疫抑制劑、抗感染劑、抗病毒劑、驅蟲和抗寄生蟲化合物。
包含活性劑的本發明的熱敏脂質體可以包含任意比率的脂質和活性劑，只要脂 質體保持熱敏性並可以在適當的溫度下釋放活性劑，例如，在39°C和45°C之間。磷脂 醯膽鹼磷脂醯甘油溶血脂質聚乙二醇化的磷脂活化劑的重量比率的適合範圍 為60-80 6-12 6-12 4-15 1_30。磷脂醯膽鹼磷脂醯甘油溶血脂質聚
乙二二醇化的磷脂活化劑的適合量比率的例子包括但不限於，70888718884、728884、73 8 8 84、74888758884、708864、71 8 8 64、72886738864、748864、75 8 8 64、70884718844、728844、73 8 8 44、74884758844、709984、71 9 9 84、72998739984、749984、75 9 9 84、70996719964、729964、73 9 9 64、74996759964、709944、71 9 9 44、729947399 44、74 9 9 4 4 禾P 759944。使用方法本發明的熱敏脂質體可以使用任何適當的途徑向受試者給藥，例如，靜脈內給藥、 動脈內給藥、肌內給藥、腹膜內給藥、皮下給藥、皮內給藥、關節內給藥、鞘內給藥、側腦室內 給藥、鼻腔噴霧、肺吸入，口服給藥以及本領域技術人員已知的其它適合的給藥途徑。可以 利用本發明的方法治療的組織包括但不限於，鼻、肺、肝、腎、骨骼、軟組織、肌肉、腎上腺組 織和乳房。可以被治療的組織包括癌組織、其它患病或受損組織(compromised tissue)，以 及如果需要健康組織也可以被治療。可以被加熱到39. 5°C以上溫度的任何組織或體液都可 以用本發明的脂質體治療。本領域技術人員很容易確定利用本發明的熱敏脂質體向受試者給予活性劑的劑 量，並且該劑量適於在延長的時間周期內經靜脈內給藥，例如在大約1分鐘至幾小時，例 如，2、3、4、6、24或更多小時。本發明所使用的「大約」表示當其用於修飾數值時有10%的
變化量。如本領域所知的，活性劑的劑量可以依據包含在載體中的活性劑來調整。在給予本發明的熱敏脂質體之前和/或期間和/或之後，可以加熱受試者的靶組 織。在一個實施方案中，首先加熱靶組織(例如，10至30分鐘)，並且在加熱後儘可能快地 將本發明的脂質體遞送到受試者。在另一個實施方案中，將本發明的熱敏脂質體遞送給受 試者，在給藥後儘可能快地加熱靶組織。可以使用任何適合的方式加熱靶組織，例如，利用射頻輻射，利用可以是高強度聚 焦超聲的超聲，利用微波輻射，產生紅外輻射的任何來源如溫水浴、光以及外部或內部應 用的輻射，如由放射性同位素、電場和磁場產生的輻射，和/或以上的組合。對於相關領域技術人員將是非常明顯的是，不脫離本發明或其任何實施方案的範 圍，可以對本發明所述的方法和應用作出的其它適當的修改和改進。現在已經詳細地描述 了本發明，通過參考以下實施例將更加清楚地理解本發明，本發明包括實施例的目的僅用 於闡釋本發明，而不意在限制本發明。實施例實施例1泰索帝(taxotere)熱敏脂質體的製備和表徵以下材料用於製備本發明的脂質體二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯磷 脂醯甘油(DSPG)、單硬脂醯磷脂醯膽鹼(MSPC)、聚乙二醇化的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺 (DSPE-mPEG2000)、NaCl、KCl、Na2HPO4 · 12H20、KH2PO4、乳糖、CHC13、甲醇、乙醇和蒸溜水。以下設備用於製備本發明的脂質體水浴、旋轉蒸發器、勻漿器-擠出機、冷凍幹 燥器、雷射散射粒度測量儀(Smypatec Nanophox)和溫度計。製備每批20ml的含有多烯紫杉醇的脂質體的方法。以所示量量出以下成分。
成分DPPCDSPGMSPCDSPE-PEG2000泰索帝量669mg75mg75mg75mg37. 5mg在55°C下將上述材料以CHCl3/甲醇(3 1)溶解。然後用旋轉蒸發器將有機溶 劑除去。這可以通過在55°C下旋轉蒸發1小時來完成。乾燥後，可以用氮氣吹掃乾燥的材 料達適當的時間，例如，5分鐘。然後將乾燥的材料再水化。適合的再水化溶液是磷酸鹽緩衝液(PBS)，其中可以 加入乳糖或其它穩定材料(例如，糖)。適合的再水化方案是加入20ml PBS-5%乳糖溶液 (pH 7.3 士 0.2)並在50°C、大氣壓下，在旋轉蒸發器上旋轉1小時。再水化後，可以在減壓 的條件下，對溶液脫氣以除去氣泡。水化後，脂質體的顆粒大小可以調整到期望的範圍，例如100士 15mm。適合的擠出 方法是利用帶有200nm過濾器的勻漿器/擠出機擠出三次。換成IOOnm的過濾器擠出三 次。最後，換成80nm的過濾器擠出三次。脂質體的顆粒大小分布可以利用任何適合的技術 來測定，例如，利用光子交叉相關光譜法(PCCS)和Nanophox傳感器(Sympatec GmbH)。擠 出後，脂質體溶液可以通過0. 22μπι孔徑大小的膜過濾器(Millipore)來過濾除菌。除菌後將脂質體裝入小瓶並冷凍乾燥冷凍乾燥的程序如 下-50°C 2h、-45°C lh、-35°C 10h、-15°C 5h、0°C 2h、10°C 2h、20°C 6h。製備本發明的脂質體的另一適合的方法如下在55°C下用CHCl3/甲醇(3 1)溶解相同的上述成分。同上，利用旋轉蒸發器除 去有機溶劑。同上，在50°C下用20ml的PBS-5%乳糖溶液再水化。將再水化的材料置於勻 漿器中，並在15，OOOpsi下處理5分鐘以減小顆粒大小。取勻漿的材料利用帶有IOOnm過 濾器的擠出機擠出6次，以將顆粒大小減小至100士 15nm(IOOnmX 6)，然後通過0. 22 μ m的 過濾器除菌。除菌之後，將脂質體裝入小瓶並冷凍乾燥。分析方法脂質體的形貌可以通過電子顯微鏡分析。將磷鎢酸染色顯陰性的脂質體轉移到銅 網上。將水蒸發掉，在電子顯微鏡下觀察樣品。由本發明的方法製備的脂質體在電子顯微 鏡下觀察是均一的。
測定如上所述製備的脂質體包封藥物的百分比(包封％)。包封％=包封的藥物 /總藥物X 100%。包封％的測定如下將Iml脂質體在6000rpm下離心5分鐘。通過HPLC 測定上清液中的多烯紫杉醇。通過從脂質體中提取多烯紫杉醇，並通過HPLC測定提取的多 烯紫杉醇來確定脂質體中多烯紫杉醇的含量。就提取而言，用水乙腈(45 55)將0. Iml 的脂質體稀釋至0. 5ml。加入4ml的叔-丁基甲醚並混合30秒。將混合物在300g下離心 15分鐘。將3ml的有機層除去並通過旋轉蒸發蒸乾。將蒸乾的材料再次懸浮在200μ1的 水乙腈(45 55)中，並將5-10 μ 1的再懸浮液注射到HPLC用於分析。在下列條件下進行HPLC分析採用Venusil C18柱(反相C18柱)，以流速為Iml/ min的水乙腈(45 55)為流動相。柱溫為30°C。UV檢測器設置在230mn。在這些條件 下，藥物的檢測限為20-800ng。確定上述方案回收樣品中多烯紫杉醇的能力。向如上所述製備的0. Iml的脂質體 中加入0.1ml多烯紫杉醇標準溶液。該樣品用水乙腈(45 55)稀釋至0.5ml。向樣品 中加入4ml的叔-丁基甲醚並混合30秒。然後將樣品在300g下離心15分鐘。通過旋轉 蒸發蒸乾3ml的有機層。將200μ 1的水乙腈(45 55)加到殘餘物中，然後將5_10 μ 1 注射到HPLC中。下面的表格提供了不同濃度的多烯紫杉醇的回收率。 確定根據本發明製備的脂質體的相變溫度。利用具有作為參照的密封空鋁盤的 QlOO (TA Instruments, Inc. New Castle DE)進行差示掃描量熱法測量。製得的脂質濃度 為20mg/ml，並將10 μ 1脂質體懸浮液小心地放置並密封在密封鋁盤中。將掃描速率設置為 每分鐘2°C。圖1顯示用本發明的脂質體獲得的DSC跡線。DSC圖譜顯示泰索帝熱敏脂質 體的相變溫度為大約42°C。通過在儲存期間周期性測定顆粒的大小來評估用上述方法製備的脂質體的穩定 性。下列表格中的結果顯示如上製備的脂質體保持穩定達至少3個月。 還監測藥物的含量。結果顯示，冷凍乾燥後，脂質體在2_8°C下保持穩定達至少3 個月。脂質體的藥物含量 也監測藥物的包封率。結果顯示，冷凍乾燥後，被脂質體包封的藥物量在2_8°C下 保持穩定達至少3個月。藥物包封 在冷凍乾燥期間，測試不同冷凍保護劑對顆粒大小的影響。測試乳糖、海藻糖、蔗 糖和甘露醇。結果顯示乳糖和蔗糖比甘露醇和海藻糖更有效。圖2顯示了以顆粒大小作為 冷凍乾燥溶液中存在的冷凍保護劑的重量％的函數的圖。脂質體在冷凍乾燥中的冷凍速率和脂質體的含水量影響顆粒的大小。圖3顯示了 以顆粒大小作為三個不同冷凍速率下的脂質體含水量的函數的圖，在三個不同冷凍速率下 的脂質體含水量影響顆粒的大小。再水化的介質也影響脂質體的顆粒大小。測試水、5%的右旋糖水溶液(D5W)和 0. 9 %的NaCl。0. 9 %的NaCl和5 %的右旋糖水溶液(D5W)保持脂質體顆粒的大小。以下 表格顯示了兩種不同組成的脂質體在三次獨立的測量中的結果。脂質體的平均直徑單位為 納米(nm)。製劑F4-1具有以下成分DPPC DSPG DSPE-PEG MSPC 多烯紫杉醇，其 重量％如下71.56 8. 15 8.24 8. 02 4. 00，而具有相同成分的F4-2的重量％為 71. 78 8. 06 8. 10 8. 07 3. 98。 檢查再水化後的脂質體的穩定性。用0. 9% NaCl再水化冷凍乾燥的脂質體，並按 圖4A示意圖所示來測試。利用動態光散射儀通過重複掃描1小時的時間來監視顆粒大小 的分布。該結果顯示再水化脂質體的顆粒分布保持穩定達1小時(圖4B)。在不同溫度下將冷凍乾燥的脂質體儲存9個月。在0、1、3、6和9個月時測試脂質 體的包封％和平均顆粒大小。以下表格中的結果顯示了在4°C下脂質體保持穩定長達9個 月。 實施例2用本發明的脂質體得到的體內藥物分布與用游離多烯紫杉醇得到的體內藥物分 布的對比。6隻雌性BALB/c小鼠(20士2g)被隨機分成3組。將小鼠麻醉並放到其中帶孔的 聚苯乙烯泡沫塑料板上。小鼠的一條腿被拉著穿過孔，至板的另一側。板漂浮在水浴上，在 43. 5°C 士0. 5°C下將腿加熱15分鐘。然後小鼠接受尾部靜脈注射10mg/kg劑量的脂質體或 相同劑量的泰索帝(對照依據生產說明書製備的)。然後將每隻小鼠的一條腿加熱30分 鍾。注射後，然後處死。從加熱和沒有加熱的腿切除肌肉。利用上述提取方法從固定重量 的肌肉組織中提取藥物。通過HPLC分析提取的藥物。結果顯示在以下表格中。 數據顯示溫敏脂質體向加熱的腿遞送的多烯紫杉醇是向沒有加熱的腿遞送的多 烯紫杉醇的2倍還多。實施例3用本發明的脂質體得到的體內藥物分布與用包含多烯紫杉醇的非熱敏脂質體得 到的體內藥物分布的對比。根據下表中顯示的配方製備熱敏脂質體和非熱敏脂質體。
6隻雌性BALB/c小鼠(20士2g)被隨機分成3組。將小鼠麻醉並放到帶孔的聚 苯乙烯泡沫塑料板上。小鼠的一條腿被拉著穿過孔，至板的另一側。板漂浮在水浴上，在 43. 5°C 士0. 5°C下將腿加熱15分鐘。然後小鼠接受尾部靜脈注射10mg/kg劑量的脂質體或 相同劑量的泰索帝(對照依據生產說明書製備的)。然後將每隻小鼠的一條腿加熱30分 鍾。注射後，然後處死。從加熱和沒有加熱的腿切除肌肉。利用上述的提取方法從固定重 量的肌肉組織中提取藥物。通過HPLC分析提取的藥物。結果顯示在下列表格中。 在熱敏脂質體組中，加熱的組織中的藥物濃度高於沒有加熱組織中的藥物濃度大 約2倍。在多烯紫杉醇注射(實施例2)和非熱敏脂質體的組中，加熱組織和沒有加熱組織 中具有相同的藥物濃度。這些結果顯示熱敏脂質體的確在實驗條件下向組織釋放了藥物。實施例4在具有Lewis肺腫瘤的小鼠體內，用本發明脂質體遞送多烯紫杉醇的體內效力與 游離多烯紫杉醇的體內效力的對比。採用12隻7-9周齡且體重為20士2g的雌性昆明小鼠。將Lewis肺癌細胞(0. Iml 的PBS中含3X IO6個細胞)皮下植入到每隻小鼠的右側小腿。在開始治療之前，腫瘤要長 到直徑為4-6mm。按腫瘤體積對12隻小鼠分類，並隨機分成3個治療組生理鹽水、游離的多烯紫杉
醇和本發明的熱敏脂質體。
如上所述製備本發明的包含多烯紫杉醇的熱敏脂質體，並在2_8°C下儲存直到使 用。以75mg/m2將多烯紫杉醇注射到被治療的動物，多烯紫杉醇或者處在本發明的熱敏脂 質體中，或者是根據生產說明書製備的非脂質體的泰索帝。 在腫瘤植入後第8天開始治療，且在第12天和第16天重複治療。採用戊巴比妥IP注射(80mg/kg)將所有治療組的小鼠麻醉；以0. 2ml體積通過尾部靜脈注射給藥治療。 該麻醉劑量足以使小鼠在一小時的治療期內固定不動。除了生理鹽水組，所有的治療組給予等劑量的多烯紫杉醇，即75mg/m2。注射之後， 立即將小鼠置於特殊設計的固定器上，該固定器可以將腿部腫瘤隔離開，置於水浴中30分 鍾。水浴溫度設置為43°C。該水浴的溫度之前已經被校準，以使腫瘤的溫度為42°C。所有 的小鼠在第18天被處死。外科切除腫瘤並記錄腫瘤的重量。腫瘤生長抑制的計算如下腫瘤抑制率=(Vs-Vx)/Vs其中，Vs為生理鹽水組的腫瘤體積，Vx為治療組的腫瘤體積。結果如下表所示。 熱敏脂質體製劑遞送多烯紫杉醇和腫瘤的局部加熱導致其對腫瘤的抑制大於單 獨遞送多烯紫杉醇對腫瘤的抑制。在用熱敏脂質體治療的兩隻小鼠中，腫瘤幾乎消失。實施例5包含卡鉬的熱敏脂質體的製備可以利用本領域技術人員已知的任何技術製備脂質體。一種適合的技術如下用下表中列出的脂質製備脂質體。
將脂質溶解在3ml氯仿中。在60°C下減壓旋轉蒸發氯仿以形成薄膜。持續加熱 40分鐘以除去有機溶劑。加入25ml水，將蒸乾的脂質在60°C下水化10分鐘。在室溫下， 減壓除氣泡10分鐘。在60°C下再加熱10分鐘。通過200nm的膜將脂質懸浮液擠出10次。 通過IOOnm的膜擠出4次。如此製備的脂質體可以在4°C下儲存。然後可以用活性劑裝載脂質體，例如，用卡鉬，利用本領域已知的任何適合的技 術。一種適合的技術如下按照106mg脂質體/ml，將800mg卡鉬和IOOOmg乳糖加到20ml的空脂質體中。將 混合物在60°C水浴中加熱，並在300r/min下攪拌30分鐘。載藥的脂質體可以在4°C下儲存。利用本領域任何已知的技術可以將多餘的藥物從載藥的脂質體中除去，例如，尺 寸排阻色譜法或透析。一種適合的技術如下可以將載藥的脂質體溶液放入透析袋中(截流分子量8000 14000)。在4°C下 用200ml、5%的乳糖溶液對脂質體進行溶液透析2小時。用新鮮的200ml、5%的乳糖溶液 替換透析溶液，並在4°C下再透析2小時。可以將載藥的脂質體從透析袋中移出並在4°C下 儲存。載藥的脂質體應當避光保護。實施例6對包含卡鉬的脂質體的物理表徵將載藥的脂質體從游離的藥物中分離後，脂質體具有如下表所示的0. 04的藥物/ 脂質比，並且具有95nm的平均顆粒大小(圖5和6)。脂質的濃度為106mg/ml。
由於卡鉬脂質體在臨床應用時需要稀釋，因此利用5%葡萄糖溶液和水作為稀釋 劑來測試本發明包含卡鉬的脂質體的穩定性。在室溫下，通過用990μ 1稀釋劑稀釋10μ 1 脂質體來測試這些稀釋劑中脂質體6小時內的穩定性。通過對比稀釋前後的藥物包封來分 析稀釋後的藥物洩漏。下表顯示了得到的結果。數據顯示卡鉬脂質體與水或5%的葡萄糖 都是相容的。
實施例7對包含卡鉬的脂質體的藥物釋放情況的表徵在37°C和42°C下分析卡鉬的藥物釋放情況。具體的方法如下分別將水浴保持在38°C和43°C (測試樣品的溫度比水浴低1度)。將每等份1. Oml 的脂質體用9.0ml、5%的葡萄糖溶液稀釋。將5ml稀釋的溶液在38°C水浴中加熱。將剩餘 的5ml稀釋的溶液在43°C水浴中加熱。在開始加熱後的不同時間點，每個溫度取樣200 μ 1。 在 0、0· 25,0. 5、1、2、4、8、16、32、64 和 128 分鐘取出 42°C 的樣品，在 0、2、8、32 和 128 分鐘取 出37°C的樣品。樣品取出後立即在冰水中冷卻。分析樣品的總藥物濃度和游離藥物濃度。通過以下公式計算釋放的藥物藥物釋放=C游離/C總X 100 %下表和圖7顯示了得到的結果。 這些數據表明本發明的脂質體在加熱後迅速地釋放藥物。為了進一步表徵本發明脂質體的藥物釋放情況，還在37°C至43°C的不同的溫度 下加熱5分鐘和10分鐘，測試含卡鉬的脂質體的藥物釋放。下表和圖8顯示了藥物釋放 的％。在37°C下，幾乎沒有藥物釋放，而從40°C開始，藥物迅速地釋放。
實施例8
對包含卡鉬的脂質體穩定性的表徵評價在不同溫度下儲存期間的藥物洩漏。脂質體在_20°C、4°C和25°C下儲存5天或10天。分析藥物的包封％。下表中記 載的結果顯示本發明的脂質體在4°C下保持穩定10天。 為了確定本發明的脂質體是否可以通過過濾除菌，分析它們對過濾的穩定性。每 等份2ml的脂質體通過0.22 μ m的過濾器過濾。分析過濾前後的藥物包封的％。下表的數 據顯示脂質體可以以小體積過濾。 通過在4°C下儲存脂質體來評估脂質體的長期穩定性。在0、1和2個月評價藥物 的洩漏。如下表所示，本發明的脂質體在4°C下保持穩定至少6個月。
本說明書中提及的全部出版物、專利和專利申請都顯示了本發明所屬領域的技術 人員的技術水平，並且它們被引入本發明作為參考，其程度如同每一篇出版物、專利或專利 申請都明確地且單獨地指明被引入作為參考。
權利要求
一種熱敏脂質體，其包含至少一種磷脂醯膽鹼、至少一種磷脂醯甘油，以及至少一種溶血脂質，其中該脂質體具有從大約39.0℃至大約45℃的凝膠向液體的相變溫度。
2.根據權利要求1所述的熱敏脂質體，其還包含聚乙二醇化的磷脂。
3.根據權利要求1所述的熱敏脂質體，其還包含活性劑。
4.根據權利要求1所述的熱敏脂質體，其中所述磷脂醯膽鹼為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼 (DPPC)，所述磷脂醯甘油為二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)，以及所述溶血脂質為單硬脂醯磷 脂醯膽鹼(MSPC)。
5.根據權利要求4所述的熱敏脂質體，其還包含聚乙二醇化的磷脂。
6.根據權利要求5所述的熱敏脂質體，其中所述聚乙二醇化的脂質為PEG-2000改性的 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG2000)。
7.棚權利要求1臓的刪旨質體，^tM比率計，其包含的HTC MKi MFC DffE-fflaXX) 活性劑為 60"80 &-12 &-12 4-15 1-30。
8.根據權利要求7所述的熱敏脂質體，其中所述活性劑為抗癌劑。
9.根據權利要求8所述的熱敏脂質體，其中所述抗癌劑選自烷化劑、抗代謝物、紡錘體 毒素植物生物鹼、細胞毒性抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、單克隆抗體或其片段、光敏 劑、激酶抑制劑、抗腫瘤酶和酶的抑制劑、細胞凋亡誘導劑、生物反應調節劑、抗激素、類視 黃醇和含鉬化合物。
10.根據權利要求9所述的熱敏脂質體，其中所述抗癌劑為紫杉烷。
11.根據權利要求9所述的熱敏脂質體，其中所述抗癌劑為多烯紫杉醇。
12.根據權利要求9所述的熱敏脂質體，其中所述抗癌劑為含鉬化合物。
13.根據權利要求9所述的熱敏脂質體，其中所述抗癌劑為卡鉬或順鉬。
14.一種包含含有活性劑的熱敏脂質體的藥物組合物，其中所述脂質體包含至少一種 磷脂醯膽鹼、至少一種磷脂醯甘油，以及至少一種溶血脂質，並且具有從大約39. 0°C至大約 45 V的凝膠向液體的相變溫度。
15.根據權利要求14所述的藥物組合物，其中所述脂質體還包含聚乙二醇化的磷脂。
16.根據權利要求14所述的藥物組合物，其中所述磷脂醯膽鹼為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼 (DPPC)，所述磷脂醯甘油為二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)，以及所述溶血脂質為單硬脂醯磷 脂醯膽鹼(MSPC)。
17.根據權利要求16所述的藥物組合物，其中所述脂質體還包含聚乙二醇化的磷脂。
18.根據權利要求17所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇化的脂質為PEG-2000改性 的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG2000)。
19.根據權利要求14所述的藥物組合物，其中按重量比率計，所述脂質體包含的 DPPC DSPG MSPC DSPE-PEG2000 活性劑為 60-80 6-12 6-12 4-15 1-30。
20.根據權利要求19所述的藥物組合物，其中所述活性劑為抗癌劑。
21.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中所述抗癌劑選自烷化劑、抗代謝物、紡錘 體毒素植物生物鹼、細胞毒性抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、單克隆抗體或其片段、光 敏劑、激酶抑制劑、抗腫瘤酶和酶的抑制劑、細胞凋亡誘導劑、生物反應調節劑、抗激素、類 視黃醇和含鉬化合物。
22.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中所述抗癌劑為紫杉烷。
23.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中所述抗癌劑為多烯紫杉醇。
24.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中所述抗癌劑為含鉬化合物。
25.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中所述抗癌劑為卡鉬或順鉬。
26.一種治療需要治療的受試者的疾病的方法，其包括給予受試者治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含含有活性劑的溫敏脂質體， 其中該脂質體包含至少一種磷脂醯膽鹼、至少一種磷脂醯甘油，以及至少一種溶血脂質，且 具有從大約39. 0°C至大約45°C的凝膠向液體的相變溫度；並且加熱具有全部或部分疾病的受試者的區域。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述脂質體包含聚乙二醇化的磷脂。
28.根據權利要求26所述的方法，其中所述磷脂醯膽鹼為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼 (DPPC)，所述磷脂醯甘油為二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)，以及所述溶血脂質為單硬脂醯磷 脂醯膽鹼(MSPC)。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述脂質體還包括聚乙二醇化的磷脂。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述聚乙二醇化的脂質為PEG2000改性的二硬 脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG2000)。
31.根據權利要求25所述的方法其中按重量比率計所述脂質體包含的 DPPC DSPG MSPC DSPE-PEG2000 活性劑為 60-80 6-12 6-12 4-15 1-30。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述疾病為癌症且所述活性劑為抗癌劑。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述抗癌劑選自烷化劑、抗代謝物、紡錘體毒素 植物生物鹼、細胞毒性抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、單克隆抗體或其片段、光敏劑、激 酶抑制劑、抗腫瘤酶和酶的抑制劑、細胞凋亡誘導劑、生物反應調節劑、抗激素、類視黃醇和 含鉬化合物。
34.根據權利要求32所述的方法，其中所述抗癌劑為紫杉烷。
35.根據權利要求32所述的方法，其中所述抗癌劑為多烯紫杉醇。
36.根據權利要求32所述的方法，其中所述抗癌劑為含鉬化合物。
37.根據權利要求32所述的方法，其中所述抗癌劑為卡鉬或順鉬。
全文摘要
本發明公開了用於遞送活性劑的熱敏脂質體及其組合物，其中所述脂質體包含至少一種磷脂醯膽鹼、至少一種磷脂醯甘油，以及至少一種溶血脂質，並且所述脂質體的凝膠向液體的相變溫度為從39.0℃至45℃。
文檔編號A61K9/127GK101883557SQ200880114788
公開日2010年11月10日 申請日期2008年11月5日 優先權日2007年11月5日
發明者餘惟平, 姜慶偉, 梅興國 申請人:效思因公司