快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙的製作方法

2023-05-30 12:36:56

專利名稱：快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於蔬菜及原糧類食品中農藥殘留檢測試紙及其檢測方法，屬膠體金免疫檢測領域。
背景技術：
由於蔬菜生長期短且病蟲害較為嚴重，因而，在蔬菜種植過程中常常需要連續多次施藥。而不少蔬菜需要多次採收，採收與施藥的時間間隔短，造成採收時蔬菜中的農藥殘留量往往較高，很容易超過國家規定的標準。而蔬菜中農藥殘留量超標會嚴重影響人類健康水平，已成為不容忽視的食品汙染源。政府和各職能部門對食品的農藥殘留問題十分關注。但由於農藥的毒性和害蟲的抗藥性形成一個惡性循環，因此全面徹底禁止高劇毒農藥的使用將有一個較長的過程，即使是全面使用中、低毒農藥，農藥惡性中毒事件仍然發生。因此對分析檢測的對象、種類、數量、範圍、指標等諸多方面都提出了新的要求和更高標準。
苯菌靈(1-正丁氨基甲醯-2-苯並咪唑氨基甲酸甲酯)，可用於防治蔬菜、果樹、稻麥等作物的多種病害，常用作拌種、噴霧和土壤處理，除有保護和治療作用外，還具有殺蟎作用。此農藥是杜邦公司生產了30多年的產品，由於毒性等原因，官司不斷，杜邦公司不得不於2001年停止生產。苯菌靈可使皮膚過敏，在實驗動物中用管飼法大劑量服食但不在食譜中接觸，可觀察到致畸效應。吸入和口服接觸可減少實驗動物的精子發生活動。FAO/WHO召開的食品和環境中農藥殘留物聯席會議上對各種農產品和食品建議了最大殘留水平，1983年，JMPR確定了每日允許攝入量(ADI)為0～0.02mg/kg/b.w.。1998年美國對多種農作物中苯菌靈的最大殘留量進行了明確規定，此標準中規定苯菌靈的殘留限量範圍為0.2mg/kg～15mg/kg。我國目前對農作物中苯菌靈的殘留限量尚未作出明確規定，所以參考美國制定的標準。
目前，檢測農藥殘留的分析方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質譜(MS)聯用法(GC/MS)。「酶抑制率法+分光光度法」已被列為國家推薦標準(GB/T 5009.199-2003)。該法快速、靈敏、操作簡便且成本低廉，可實現快速初篩，但受檢測範圍和精度的限制。而氣相色譜法(GC)可實現精度的定量分析但速度較慢，檢測成本較高。總之，這些方法普遍存在著樣品前處理過程複雜，靈敏度受樣品的淨化、濃縮等步驟的影響很大，耗時，檢測設備昂貴，並要求有專業的技術人員及較長的分析周期。
因此，利用競爭法原理，在傳統免疫檢測法的基礎上引入了膠體金快速檢測技術，研製出苯菌靈膠體金競爭法檢測試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業人員檢測，真正達到複雜原理與簡易操作的有機統一，同時具有保存方便，有效期長的特點。

發明內容
本發明針對上述存在的一些問題，提供了一種適用於檢測苯菌靈是否超標的膠體金測定試紙。
為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的在苯菌靈殘留檢測試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和苯菌靈單克隆抗體金標墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米範圍)，在苯菌靈單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。關於底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標墊的組合方法按專利CN 2741052Y執行。
苯菌靈殘留檢測試紙的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，試驗線是由苯菌靈-合成免疫原包被。把檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入果蔬汁中，由於毛細管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當移動至苯菌靈單克隆抗體金標墊時，樣品中的苯菌靈與苯菌靈單克隆抗體金標探針發生特異結合，當移動至固定有苯菌靈-合成免疫原聯結物試驗線時，由於苯菌靈單克隆抗體金標墊中的抗體與樣品中苯菌靈優先結合成複合物而失去其與苯菌靈-合成免疫原結合，因此其膠體金不能滯留於試驗線上，試驗線處沒有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽性；相反如果樣品中沒有苯菌靈，苯菌靈單克隆抗體金標墊中的抗體移動到試驗線上，苯菌靈單克隆抗體就會與苯菌靈-合成免疫原聯結物發生特異結合，使膠體金滯留於試驗線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競爭法原理。試驗線的顏色深淺與樣品中苯菌靈含量高低成反比。從陽性過渡到陰性，由於所測苯菌靈含量不同，試驗線的顏色也不同，形成一個紅色顏色梯度差，以這種原理檢測出OD值，從而推斷出試驗線所反應實際苯菌靈的量。
用競爭法製成試紙其檢測苯菌靈設定檢出量以上，觀察窗處出現一條紅線為陽性；設定檢出量以下出現雙紅線為陰性；設定檢出量時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，從而得出判斷。
當移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無苯菌靈，標記的金標探針都會與已設定好的羊抗鼠多克隆抗體結合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產生則代表操作有誤，檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經過期。
由於採用上述技術方案，本發明所提供的一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，而且結果易讀。


圖1為本發明一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙的主視結構圖。
圖2為發明圖一的側視結構圖。
圖3為檢測顯示陽性結果圖。
圖4為檢測顯示陰性結果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗線，5、單克隆抗體金標墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實施例1.根據苯菌靈的分子結構，推斷其分子中的抗原決定區，選用苯菌靈農藥原藥經化學反應合成一種與苯菌靈分子結構相近的且具有羧基或氨基等易於蛋白質大分子相連接基團的分子結構(半抗原)。在縮合劑作用下使半抗原小分子與蛋白質大分子相連接製得苯菌靈免疫抗原。
2.單克隆抗體的製備(1)用合成的免疫原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射於BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能與苯菌靈分子結合的單克隆抗體用於膠體金標記。
3.膠體金的製備及與單克隆抗體的結合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到85～95℃，加入適量檸檬酸三納繼續加熱攪拌至沸騰3～10分鐘，冷卻後避光保存備用。
(2)把苯菌靈單克隆抗體標記的膠體金液，吸附纖維材料上，乾燥後備用。
4.制膜機制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合見說明書附圖，方法同專利CN 2741052Y。
6.使用方法把試紙的樣品吸液層端放入蔬菜浸汁中(液面不得超過MAX線圖中8)，1分鐘後取出試紙平放，由於毛細管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時觀察結果。
7.結果判斷檢測苯菌靈濃度0.2mg/kg以上，觀察窗處出現一條紅線為陽性；0.2mg/kg以下出現雙紅線為陰性；0.2mg/kg時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，此界限值為國家頒布的蔬菜農藥殘留檢測標準0.2mg/kg。從而得出判斷。
權利要求1.一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙，其特徵在於是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、苯菌靈單克隆抗體金標墊(5)、樣品吸液層(6)組成、MAX線(8)；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。
2.根據權利要求1所述的一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙，其特徵在於控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被製成。
3.根據權利要求1所述的種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙，其特徵在於試驗線是由苯菌靈合成免疫原包被製成。
4.根據權利要求1或3所述的一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙，其特徵在於所檢測的目標物是苯菌靈原藥包括苯菌靈配製的混合物。
5.根據權利要求1所述的一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙，其特徵在於金標墊是由苯菌靈單克隆抗體作為膠體金標記。
6.根據權利要求1所述一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙，其特徵在於試驗線的檢測值設定為最低檢出量為苯菌靈0.1～15mg/kg。
專利摘要一種快速檢測苯菌靈殘留的膠體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、單克隆抗體金標墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有苯菌靈合成免疫原試驗線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層，通過膠體金免疫競爭方法製成試紙，利用免疫膠體金法來檢測果蔬中的苯菌靈殘留量是否超標。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業人員檢測，真正達到複雜原理與簡易操作的有機統一，同時具有保存方便，有效期長的特點。
文檔編號G01N33/558GK2869864SQ20052014260
公開日2007年2月14日 申請日期2005年12月6日 優先權日2005年12月6日
發明者萬積成 申請人:萬積成