一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法
2023-05-31 00:07:36
專利名稱：一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法
技術領域：
本發明屬於蛋白質親和沉澱劑的製備領域，特別涉及一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法。
背景技術：
生物物質，特別是酶和抗體等蛋白質，具有識別特定物質並與該物質的分子相結合的能力，這種識別並結合特定分子的能力具有排他性，即生物分子能夠區分結構和性質非常相近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結合。這種生物物質間的特異性相互作用即為親和作用(affinity)。利用生物分子間的親和作用的原理進行生物物質分離純化的技術稱為親和分離(affinity separation)或親和純化(affinity purification)金屬螯合親和純化是一種利用過渡金屬離子(Cu2+、Ni2+、Zn2+或Co2+)和蛋白質上的電子供體基團之間的親和作用分離純化蛋白質的方法。早在1948年，就有研究發現水溶液中的His和Cys可以與Cu2+、Ni2+形成穩定的複合物。後續研究表明，蛋白質中的His殘基的咪唑基、Cys殘基的巰基、Try殘基的吲哚基和Arg殘基的胍基都是很強的電子供體，當蛋白質上的這些胺基酸殘基暴露在水溶液中時，蛋白質可以結合在固定在凝膠上的金屬離子Cu2+或Ni2+上。N-乙烯基己內醯胺(NVCL)的高聚物聚(N-乙烯基己內醯胺)簡稱PNVCL，一種具有最低臨界溶液溫度(LCST)特性的熱敏性智能聚合物材料，由於其大分子側鏈上同時具有親水和疏水基團，使PNVCL的水溶液隨著外界溫度的變化可在其LCST附件發生可逆相變。其相變溫度在人體生理溫度(30 40°C)附近，具有良好的離子型水溶性、熱敏性以及生物相容性，因而在藥物控釋、酶固定化、免疫分析、生化分離等領域有潛在的應用價值。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法， 該方法操作簡單，所使用的聚合物可回收利用，有效降低蛋白質分離純化成本，適合規模化生產；所製備的溫敏型親屬螯合親和沉澱劑，操作簡單，反應時間短，蛋白吸附效果好。本發明的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，包括(1)將0. 25 2. Og N-乙烯基己內醯胺與25 300 μ 1甲基丙烯酸溶解在去離子水中，得混合液，然後將所述的混合液置於反應容器中，真空脫氣，再加入0. 1 0. 60ml含有0. 01 0. 06g過硫酸銨的過硫酸銨水溶液，並調節體系pH值至7. 0，通氮氣鼓泡後密封后，在50 70°C反應1 池；反應結束後加入氯化鈉溶液沉澱，收集反應生成的沉澱，得到溫敏聚合物PNVCL-co-MAA聚合物；(2)用Tris-HCl緩衝液將上述溫敏聚合物PNVCL-co-MAA配製成濃度為0. 05 0. 10g/ml的PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩衝液溶液，然後加入濃度為0. 1 0. 6mol/ L硫酸銅溶液，在室溫下振蕩反應0. 5 2h，收集反應生成的沉澱，得到親和溫敏聚合物 PNVCL-co-MAA-Cu，即為該溫敏型親屬螯合親和沉澱劑。
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步驟(1)中所述的N-乙烯基己內醯胺的質量為0. 5 1. 5g，甲基丙烯酸的用量為 50 150 μ 1。步驟(1)中所述的真空脫氣是時間為10 30min，氮氣鼓泡的時間為15 30min。步驟(1)中所加入的過硫酸銨水溶液中過硫酸銨的含量為0. 03 0. 05g。步驟(1)中所述的調節體系pH值至7. 0為採用濃度為lmol/L的氫氧化鈉水溶液調節。步驟(1)中所述的氯化鈉溶液的濃度為0. 2mol/L。步驟(2)中所述的Tris-HCl 緩衝液為 0. 05mol/L、pH 值為 4. 0 8. 0 的 Tris-HCl 緩衝液。上述Tris-HCl緩衝液的pH值為5. 0 7. 0。步驟O)中所加入的硫酸銅溶液濃度為0. 2 0. 4mol/L,室溫反應時間為1 1. 5h。步驟⑵中所述的硫酸銅溶液與PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩衝液溶液的體積比為5 10 5 10。步驟( 中所得的溫敏型親屬螯合親和沉澱劑應用於牛血清蛋白BSA的親和沉澱純化。
本發明的PNVCL-co-MAA-Cu的合成路線，如下
權利要求
1.一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，包括(1)將0.25 2. Og N-乙烯基己內醯胺與25 300 μ 1甲基丙烯酸溶解在去離子水中，得混合液，然後將所述的混合液置於反應容器中，真空脫氣，再加入0. 1 0. 60ml含有 0. 01 0. 06g過硫酸銨的過硫酸銨水溶液，並調節體系pH值至7. 0，通氮氣鼓泡後密封后， 在50 70。C反應1 池；反應結束後加入氯化鈉溶液沉澱，收集反應生成的沉澱，得到溫敏聚合物PNVCL-co-MAA聚合物；(2)用1Tris-HCl緩衝液將上述溫敏聚合物PNVCL-co-MAA配製成濃度為0. 05 0. 10g/ml的PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩衝液溶液，然後加入濃度為0. 1 0. 6mol/ L硫酸銅溶液，在室溫下振蕩反應0. 5 2h，收集反應生成的沉澱，得到親和溫敏聚合物 PNVCL-co-MAA-Cu，即為該溫敏型親屬螯合親和沉澱劑。
2.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟(1)中所述的N-乙烯基己內醯胺的質量為0. 5 1. 5g，甲基丙烯酸的用量為50 150 μ 1。
3.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟(1)中所述的真空脫氣是時間為10 30min，氮氣鼓泡的時間為15 30min。
4.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟(1)中所加入的過硫酸銨水溶液中過硫酸銨的含量為0. 03 0. 05g。
5.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟(1)中所述的調節體系PH值至7. 0為採用濃度為lmol/L的氫氧化鈉水溶液調節；所述的氯化鈉溶液的濃度為0. 2mol/L。
6.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟(2)中所述的Tris-HCl緩衝液為0. 05mol/L、pH值為4. 0 8. 0的Tris-HCl緩衝液。
7.根據權利要求6所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 所述的Tris-HCl緩衝液的pH值為5. 0 7. 0。
8.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟⑵中所加入的硫酸銅溶液濃度為0. 2 0. 4mol/L，室溫反應時間為1 1.證。
9.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟O)中所述的硫酸銅溶液與PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩衝液溶液的體積比為5 10 5 10。
10.根據權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，其特徵在於 步驟O)中所得的溫敏型親屬螯合親和沉澱劑應用於牛血清蛋白BSA的親和沉澱純化。
全文摘要
本發明涉及一種溫敏型親屬螯合親和沉澱劑的製備方法，包括(1)將N-乙烯基己內醯胺與甲基丙烯酸溶解在去離子水中，得混合液，然後將所述的混合液置於反應容器中，真空脫氣，再加入過硫酸銨水溶液，調節體系pH值至7.0，通氮氣鼓泡後密封后，反應結束後，收集反應生成的沉澱，得到溫敏聚合物PNVCL-co-MAA聚合物；(2)配製PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩衝液溶液，然後加入硫酸銅溶液，振蕩反應，收集反應生成的沉澱，即得。本發明的製備方法簡單，所使用的聚合物可回收利用，有效降低蛋白質分離純化成本，適合規模化生產；本發明所製備的溫敏型親屬螯合親和沉澱劑，操作簡單，反應時間短，蛋白吸附效果好。
文檔編號C12N9/00GK102391422SQ20111034404
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者凌元清, 朱利民, 聶華麗 申請人:東華大學