羥基油酸及相關化合物作為功能性食品添加劑的應用的製作方法

2023-05-31 00:05:11

專利名稱：羥基油酸及相關化合物作為功能性食品添加劑的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及羥油(2-羥油)酸及類似結構的分子作為通常被稱為功能性食品添加劑的食品添加劑的應用，所述食品添加劑具有心血管疾病和肥胖症的預防性性質。
本發明還涉及將2-羥基油酸和類似化合物用於製備食品的應用。
背景技術：
脂肪酸是在食品和工業中廣泛應用的分子。各種飲食產品包含這種和其它類型的脂肪。在它們之中，可以提及的有油(橄欖油，豆油，向日葵油，月見草油，芝麻油等)，(動物)脂肪/黃油和(植物)人工奶油，其組成由超過95％的脂肪組成。許多其它的食品以更多或更少的量包含植物和/或動物脂肪，其在某些情形中具有關於各種疾病的發展的預防性性質，諸如例如ω-3脂肪酸。脂肪酸通常以兩種形式見於食品和飲食產品游離的(通常以低百分比)或與其它分子結合的，諸如磷脂，膽固醇酯，甘油三酯等(脂肪酸存在的主要形式)。在大多數食品和飲食產品中，不管存在的形式如何，通常如在性質上，脂肪酸一般不會被明顯修飾。然而，已經證明，在一些植物種子的油中存在大量的羥基化脂肪酸(多到60％)(Moon等，2001，Plant Physiol.127，1635)。但是，在不同的生物和生物系統之間，天然中的羥基化脂肪酸的多度變化明顯。
在本文上下文中，2-羥基油酸，其合成先前已經描述(Adam等，1998，Eur.J.Org.Chem.9，2013-2018)，在工業上已經被用作化妝品製劑的乳化劑。因為其已為人知的乳化能力，羥基化的脂肪酸被原樣用在食物用途和其它應用中。
因此，例如，在一方面，專利JP 10182338涉及顯示低應激性和與鹽的高相容性的水包油型乳化組合物，其包含[A]非離子表面活性劑如聚氧乙烯山梨糖醇單月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇單硬脂酸酯，[B]2-羥基C10-C22脂肪酸如2-羥基硬脂酸，[C]油和[D]水，其中A/B的比率在1∶0.01和1∶2之間。
沿與乳化劑相同的路線，專利JP 09110635涉及可以用作藥品，化妝品和食品的組合物，其包含[A]聚脂肪酸甘油酯，[B]2-羥基C10-C22脂肪酸，[C]油和[D]水，其中A/C和B/C的重量比分別為2.0和0.5，並且具有10-300nm的平均粒徑。即使在酸性條件下或在低粘度下或在提高量的鹽存在下這些組合物顯示良好的穩定性，因此與皮膚相容。
我們早期的專利，WO 03/030891公開了將羥基油酸和類似化合物用在藥物製備中，其可以用作抗腫瘤劑，作為具有降血壓活性的藥劑和作為能引起體重減輕的藥劑。使用羥基油酸和類似化合物製備的藥物化合物的這些治療效果，似乎是由膜結構的這些化合物的調節，由此調節G蛋白的活性和/或定位從而調節與其連接的受體的活性而導致的。目前本發明的目的是要求羥基油酸和類似化合物作為營養性飲食添加物(supplement)預防心血管疾病和肥胖症的效果。
六角形膜結構膜脂自身能夠以比蛋白質和核酸更大量的二級結構排列。生物膜的典型脂雙層只是這些二級構型中的一種。關於活細胞中其它二級結構的多度和作用了解的很少。這些結構的一種功能在先前為增加G-蛋白與膜的結合親和力的工作中描述(EscribáPV，Ozaita A，Ribas C，Miralles A，FodorE，Farkas和García-Sevilla JA；1997Proceeding of the National Academy ofScience of USA 94，11375-11380)。
膜結構的概念超出在有些現有技術的專利中(WO 87/04926和WO80/11286)所描述的範圍，在所述專利中只提及膜的流動性。在所述發明中，該概念延伸至廣泛得多的領域膜結構。我們專利所覆蓋的分子作用於從片狀結構到六角形結構的轉換或過渡(

圖1)。
與G蛋白連接的受體是普遍存在的，組成了膜受體的80％，其傳遞由神經遞質，激素，神經調節劑，細胞因子，生長因子等激發的信號。它們調節一些生理過程，包括血壓和體重。在本發明中描述的分子可以因此調節所述生理過程。
研究引用的現有技術，在現有技術中沒有其它與2-羥基油酸或類似化合物有關的應用，所述2-羥基油酸或類似化合物在用於預防心血管疾病和和肥胖症的發展的食品領域中特別有價值。
只有關於飲食產品(GB 2140668，EP 0611568和WO 02/0042)或提取自M.cryophilus的培養物(WO 89/11286)的描述，其由各種化合物的複雜混合物組成，所述化合物包括與本發明所述的那些相似的一些，如脂肪酸，特別是例如油酸和棕櫚油酸，但這些專利未將所述混合物組分中的任何一種設想為在預防心血管疾病的療效中的發揮了具體作用。
已經研究了細胞的脂質組成對高血壓發展的影響(Escribá等，Hypertension 41，176-182；2003)。在該方面，已經觀察到形成膜的脂質的不同組成涉及高血壓的形成並且膜組成的飲食控制(因此控制其結構)涉及其正常化。這種效果由膜結構控制G蛋白的定位和活性的能力調節，如先前所指出的。
我們已經從現有技術中的其它專利獲得認知，所述專利描述將羥基油酸或類似化合物作為藥物用在與在此提出的那些相關的適應證中。
因此，WO 02/43662公開了基於亞油酸，DHA，維生素E，G，B6和B12，和葉酸以及鈣的營養添加物，其可以用於減少膽固醇水平升高和高血壓。此外，專利CN 1098920公開了口服翅果油(samara oil)溶液劑(富含亞油酸和維生素E)，其可以用作降壓藥，降膽固醇血症藥(hypocholesterolaemics)並用於治療肝炎，腎炎和其它疾病。亞油酸不是本發明的主題。US 5059622和US 6140304提及使用eicosapentanoic酸和γ-亞油酸，這種相同的治療適應證。還已經公開了可以使用棕櫚油酸治療的與腦中風關聯的高血壓(GB2140688)。在現有技術中，還存在包括脂肪酸甘油二酯和三酯的飲食，所述脂肪酸甘油二酯和三酯在包含少於20個碳原子的ω-3不飽和脂肪酸的情形中作為幫助燃燒脂肪的化合物(WO 02/11552)，或在具有4-14個碳原子的脂肪酸的情形中，作為有助於體重減輕的化合物(WO01/91587)。甘油三酯不是本發明的主題。WO 02/00042公開了誘導飽腹感的棕櫚油脂肪酸和油脂肪酸。本發明的體重控制機制不是由飽腹感的控制所介導的。
關於改進膜的狀態這方面，這已經被公開過(WO 89/11286-棕櫚油酸；WO 87/04926-C12-28單不飽和的)，但是是通過涉及流動性的改變，而不是通過結構轉變的機制的方式進行。同樣，已知將神經酸除了用於預防疾病諸如多發性硬化之外，還用作新生兒或早產兒和妊娠婦女的營養添加物(WO 96/05740)。甚至已經將腸製劑用於遭受癌症的患者，所述腸製劑基於特別是，油酸，亞油酸或eicosapentanoic酸(EP 0 611 568)。
在本發明中沒有要求任何這些適應證。
發明概述本發明的目的是發現2-羥基油酸及類似化合物的新應用，其在現有技術中沒有描述過並且在現有技術的基礎上不顯而易見。
本發明的目的是顯示2-羥基油酸及其類似物具有作為功能性食物添加劑的活性，所述食物添加劑能夠通過減少血壓而預防心血管疾病並能導致體重的減輕。將羥基油酸以一定量加入人的食品中產生了明顯的、表現在直接與心血管疾病相關參數血壓和體重方面的益處，所述量依照其被消費的量可以被考慮為飲食量(多到每天0.5g/kg體重的等級)。
以下所述的關於2-羥基油酸及其類似物的應用以前還未被任何人提到，它們的使用可能證明通過將它們包含在飲食中對於某些疾病的預防有益。特別是，已經發現2-羥基油酸及其類似物顯示心血管活性，誘導血壓減少和體重減輕。
在本發明中通過使用實驗細胞模型和動物模型證明2-羥基油酸及其類似物的新應用。這些分析模型毫無疑問地顯示2-羥基油酸及其類似物是能夠用於製備人消耗的藥物的分子，目標是預防心血管疾病。
應該將本發明的化合物被要求的應用理解為以其可能的最廣泛的意義應用在食品領域中並且它們包括，特別是食品添加劑和/或組分，飲食產品，可接受的食物形式和通常的食物。
發明詳述在本發明中，「2-羥基油酸」沒有區別地指α-羥油酸，十八碳烯酸C18:1順Δ9或順-2-羥基-9-十八碳烯酸。「它們的功能類似物」是指含有偏移中心區1或2個位置的雙鍵或含有偏移中心區1至5個位置的雙鍵和/或在雙鍵的每一側含有1-6個碳原子(CH2基團)和/或在位置2含有不同於OH的小原子量(Mw小於或等於200Da)並且是非H的殘基(R)的那些脂肪酸。對應於R基團投影的立體異構體是R還是S無關緊要。關於測試的各種分子，已經觀察到具有以下所示通式的那些顯示一些類似於羥基油酸的效果，因此可以被歸類為其功能類似物。
通式ICOOH-CHR-(CH2)m-CH＝CH-(CH2)n-CH3，其中m和n獨立地具有0-15的值，R可以是H，OH，NH2，CH3，或一些分子量低於200Da的其它殘基。
在本發明中「G-蛋白」是指這樣的蛋白質，其是由3個亞基(1個α，一個β和一個γ)形成的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白，其將信號從與G-蛋白結合的受體傳遞到效應物(腺苷酸環化酶，鳥苷酸環化酶，磷脂酶C，離子通道等)。
在本發明中「膜結構」是指脂質在天然或合成膜(脂質體)中的二級結構或排列。
在本發明中，「飲食上可接受的形式」指通常用在所述領域(sector)中的任何形式，包括，但不限於酯，尤其是乙酯，因為它們對於脂肪酸，醚，醯胺，鹽等的溶解性質。
術語「功能性食品添加劑」應該被理解為指這樣的添加劑，當所述添加劑被攝入時，其產生預防疾病的發展的效果，這比營養攝入本身的內在效果要大。
調節G-蛋白的活性來控制血壓羥基油酸和相關化合物能夠調節G-蛋白的活性，所述活性通過[35S]GTPγS的結合來測量(圖2)。
在本發明的化合物和G-蛋白活性以及血壓之間存在關係。在人中進行的一項研究的結果是證實前面所述的結果，在研究中發現高血壓個體具有膜脂質水平的變化(表1)。所述膜脂質對片狀-六角形轉換具有影響，該轉換又確定G-蛋白的定位和功能性。實際上，在高血壓患者中我們觀察到G-蛋白與膜結合水平的改變，這是由於膜脂質的上述變化和易於形成六角相。如果非片狀膜結構的調節和由此導致的G-蛋白的重新定位產生高血壓，通過調節膜脂質的片狀-六角形轉換，實現膜蛋白定位和最終血壓的調節是可能的(圖3)。
表1在血壓正常(對照)和高血壓受試者的紅細胞膜中的磷脂和膽固醇酯的脂肪酸組成(mg/100mg)。
值為平均值±平均值的標準誤差(n＝28)。SFA，飽和脂肪酸；MUFA，單不飽和脂肪酸；PUFA，多不飽和脂肪酸。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。n.d.未檢測到。
證明2-羥基油酸及其類似物也具有顯著的降血壓效果，因為它們導致血壓減少，而不改變心率(圖4a，4b和5)。由2-羥基油酸及其類似物的攝入產生的降血壓效果在攝入的2小時內導致血壓的減少，並且當持續攝入該化合物時，該效果將維持數天和數周。例如氨基油酸在持續1周的慢性治療中將血壓降低15mmHg。
血壓受各種與G-蛋白偶聯的受體的系統控制，如血管升壓素受體，腎上腺素能受體等。
與血壓控制有關的激素和被結合以刺激G-蛋白的受體之間的相互作用受2-羥基油酸類型的脂肪酸和類似功能分子的作用調節。
這些脂肪酸調節受體，G-蛋白和效應物之間的溝通。結果是環AMP，磷脂酶C和一氧化氮的信號的調節，其引起血壓降低。該效果還與膜結構的調節有關。這些化合物一個另外的優勢是它們控制其它心血管危險因子血清脂質/脂蛋白分布圖和體重。因為血壓控制其本身不足以延長高血壓患者的壽命，因此控制其它心血管危險因子是必要的。所以，這些脂肪酸是用來預防心血管疾病的發展的最佳的(unsurpassable)飲食添加物。
-降血壓測試-2-羥基油酸在大鼠中誘導顯著的血壓降低(圖4a)。這些降低快速地(在處理2小時，19±6mmHg，P＜0.01，n＝6)以及在長期之後(1周，26±7mmHg，P＜0.001，n＝6)發生。在遺傳上高血壓的大鼠，SHR品系中，攝入2-羥基油酸(600mg/kg每12小時)產生非常顯著的血壓降低。這些大約70mmHg的降低，誘導高血壓SHR大鼠中心臟收縮壓的正常化。相反地，所用的全部對照(有和無飲食的WKY大鼠和無飲食的SHR大鼠)的血壓在處理期間並不改變(圖6)。
在人中，2-羥基油酸也產生顯著的，大的血壓降低，見圖4b。
而且，滿足上面給出的通式的2-羥基油酸的類似物具有降血壓效應(圖5)。在所有情況中，血壓的降低與對照相比是顯著的(*P＜0.05，**P＜0.01)。
這些結果清楚地顯示2-羥基油酸及其功能性類似物能夠用作改善高血壓的食物添加劑。
除了它們的降血壓作用之外，2-羥基油酸及其功能性類似物通過體重的減輕對心血管參數具有有益作用(圖5)。
體重由，除了別的因素外，諸如個體代謝能力和食物攝入控制的因素所調節。
食物攝入控制由飽腹感決定，其又在激素水平上受調節。例如，營養缺陷刺激引起食慾感覺的激素的分泌。在進食後，一旦營養水平已恢復，就有引起飽腹感的激素分泌的刺激。
已經發現2-羥基油酸類型的脂肪酸及其功能性類似物產生飽腹效應，誘導食物攝入的減少。這種控制還由細胞因子的受體、瘦蛋白、腎上腺素受體和其它偶聯到G蛋白上的受體介導，它們的活性由這些脂肪酸調節。這些結果符合對於體重的地中海飲食(富含單不飽和脂肪酸如羥基油酸和衍生物)效應。在這一點上，眾所周知肥胖症在地中海國家沒有北方國家更普遍。
由於羥基油酸及衍生物對於攝食所發揮的控制，接受羥基油酸及衍生物的營養添加物的動物體重減輕，儘管它們可以自由取食物和水。這種對飽腹感的影響意味著比對照動物少15％和30％之間的進食消費。
-體重控制測試-接受含有本發明的分子的營養添加物的大鼠在5-17天的食物攝入期間體重減輕。在這些實驗中，以與大鼠對照組相同的方式，給予大鼠2-羥基油酸或其功能性類似物，特別是氨基油酸，並且可以自由取食物和水，所述大鼠對照組接受相同的飲食而不添加脂肪酸(圖7)。在這些條件中，接受添加物的大鼠的體重日益降低，從第一天開始，在第七天減輕高達17克(2-3月齡Sprague-Dawley大鼠正常體重的5％)。對提供給這上動物的飼料進行稱重並且發現在處理期間消耗更低，證實用與本發明有關的分子進行處理在動物中產生飽腹效應。用2-羥基油酸在成體小鼠上進行了多到28天時期的類似實驗，顯示體重相對於對照小鼠(無營養添加物)減輕15％-25％。
在其它系列的實驗中，將血壓正常的大鼠(WKY)和高血壓大鼠(SHR)的飲食補充以羥基油酸(600mg/kg，每12小時)，證實所述動物的體重在8天飲食期間減少了30-40克(體重的15-20％)(圖8)。
附圖描述圖1除了片狀之外，膜可以採用的許多結構中的一些。A)脂質分子可用的形式；B)分子組織(L)具有卵磷脂優勢的片層；(HI)(HII)分別具有溶血磷脂膽鹼和磷脂醯乙醇胺優勢的六角形。
圖2顯示[35S]GTPγS與用大鼠腎上腺素受體α2A/D轉染的NIH 3T3細胞的膜的結合。該參數測量G-蛋白的活性。2-羥基油酸(2OHOA)的存誘導甚至大於道諾黴素(DNM)的G-蛋白功能的降低。
橫坐標C＝對照；2OHOA＝2-羥基油酸；DNM＝道諾黴素。
縱坐標[35S]GTPγS的結合(對照的％)。
圖3在血壓正常(空條)受試者和高血壓受試者(填充條)的紅細胞膜中G蛋白的水平，測量為對照的％。在高血壓受試者中蛋白Gαi1/2(Gi)，Gαo(Go)，Gαs(Gs)和G Gβ(Gb)的水平顯著較低。條的值是平均值±平均值的標準誤差*P＜0.05，**P＜0.01。
圖4a顯示羥基油酸(2OHOA)對雌性Sprague-Dawley大鼠動脈收縮壓(mmHg)的急性作用(30mg/kg，2小時，黑條)和慢性作用(90mg/kg每天，持續7天，白條)。*相對於對照(C)，P＜0.01。
圖4b顯示2-羥基油酸(90mg/kg每天，持續8天)對人血壓(mmHg)的影響。該圖顯示動脈收縮血壓為處理天數的函數。處理前的日子用負值表示。*P＜0.05，**P＜0.01。
圖5顯示2-羥基油酸(2OHOA)和它的功能性類似物2-甲基油酸(2MOA)，油酸(OA)，棕櫚油酸(POA)，順-11-十八碳烯酸(VA)和神經酸(NA)短期施用的效果。相對於對照(C)，所有用所述2-羥基油酸和類似物進行的處理誘發雌性Sprague-Dawley大鼠動脈收縮壓(mmHg)的顯著降低(*P＜0.05，**P＜0.001)。
圖6顯示2-羥基油酸對雄性遺傳性高血壓的SHR品系大鼠的動脈收縮壓(mmHg)的效應；(SHR 2OHOA，黑色方形)。2-羥基油酸的消耗(600mg/kg，每12小時持續7天)誘發顯著的，大的動脈收縮壓降低。在未給予2-羥基油酸的SHRs中(SHR空心方形)，沒有觀察到動脈壓的降低。在WKY品系(正常血壓的)的雄體中，2-羥基油酸(黑色圓形)或媒介物(空心圓形)都未產生統計學上顯著的動脈壓變化。由羥基油酸誘導的動脈壓的降低意味著在高血壓和正常血壓的大鼠的飲食期結束時登記的值之間沒有顯著差異。
圖7顯示2-羥基油酸(OHOA)和它的類似物，油酸(OA)和棕櫚油酸(POA)(90mg/kg每天)對體重的影響，以每一處理天克數的減少進行測量。動物(Sprague-Dawley大鼠)可以在全部時間自由取食物和水。
圖8顯示羥基油酸(黑色圓形和方形)(600mg/kg，每12小時持續7天)對高血壓(SHR)和正常血壓(WKY)大鼠體重的影響。在羥基油酸攝入八天後，兩種品系都顯示明顯的體重減少(15-20％減少)，而用媒介物處理(無2OHOA)的對照動物(白色圓形和方形)並未出現任何體重的顯著改變。
權利要求
1.通式ICOOH-CHR-(CH2)m-CH＝CH-(CH2)n-CH3的化合物在製備食物添加劑和/或組分，飲食產品，可接受的食物形式和通常的食物中的應用，其中R可以是分子量低於200Da的任何基團，m和n獨立地具有0-15的值，所述化合物的攝入有效用於預防和控制心血管疾病和肥胖症。
2.按照權利要求1的應用，其特徵在於R優選地是H，OH，NH2或CH3。
3.按照權利要求1或2的應用，其特徵在於通式I的化合物優選地具有12-28個碳原子。
4.按照權利要求1-3任一項的應用，其特徵在於通式I的化合物優選地是2-羥基油酸，2-甲基-油酸，11-十八碳烯酸，神經酸或氨基-油酸，及其混合物。
5.按照前述權利要求任一項的應用，其中所述食物添加劑和/或組分，飲食產品，可接受的食物形式和通常的食物的攝入作為輔助用於控制血壓及相關疾病。
6.按照前述權利要求任一項的應用，其中所述食物添加劑和/或組分，飲食產品，可接受的食物形式和通常的食物的攝入作為輔助用於體重控制。
全文摘要
羥基油酸及其類似化合物在製備功能性食物添加劑中的應用。描述了羥基油酸和通式ICOOH－CHR－ (CH
文檔編號A61K31/201GK1901813SQ200380110780
公開日2007年1月24日 申請日期2003年11月28日 優先權日2003年10月10日
發明者P·V·埃斯克裡瓦魯伊斯 申請人:巴利阿里群島大學