用於純化核酸的裝置、系統和方法

2023-05-31 07:47:46 2

專利名稱：用於純化核酸的裝置、系統和方法
技術領域：
本發明涉及化學物質的純化，更具體而言，涉及用於進行化學純化和分析的裝置、 方法和系統。再具體而言，本發明所提供的裝置、方法和系統在核酸的純化和分析方面具有 特別有用的應用，尤其是用於進行所述純化和分析的微流體裝置。本發明可用於分析化學、 法醫化學、微流體和微型裝置、醫藥和公共健康領域中。
背景技術：
創造高度小型化化學裝置的半導體製造技術的發展(Beach，Strittmatter等 2007)已為分析化學帶來了革命，所述革命特別是通過提供以極高的精密度和準確度鑑定 複雜混合物中以低濃度存在的化學物質的工具而得以實現。該革命對於化學處理、醫藥、法 醫科學和國防等領域已經產生了重要影響，在這些領域中，所述裝置能夠提供快速、便攜並 且經濟的生物檢測器。這種裝置的實例包括用於收集和鑑定微粒的裝置(Wick 2007)、用於 檢測分子汙染物的系統(Knollenbergjodier等2007)和用於檢測蛋白質的裝置(Terry， Scudder等2004 ；Deshmukh 2006)。其它裝置利用自動化系統中的聚合酶鏈反應(PCR)，使 用流體技術分離和/或擴增核酸。這種裝置的實例為由Qiagen (德國希爾敦)、Roche (瑞 士巴塞爾)^Applied Biosystems (加利福尼亞州福斯特城)、Idaho Technologies (猶他州 鹽湖城)和C印heid(加利福尼亞州桑尼維爾)市售的裝置。但是，與任何分析方法一樣，處理之前製備樣品對於能否獲得良好效果至關重要。 過多複雜因素的存在和可掩蓋所關注的分析物的物質的濃集使得有效的檢測幾乎不可能 實現。當試圖分析細胞溶解產物(其為極其複雜的異質混合物)的核酸含量時，這一問題 尤其令人關注(Colpan2001)。涉及可攜式分析裝置時，製備任務變得更為困難，因為這些裝 置預期用於無法獲得常用實驗室支持設備如離心機和分離柱等的場合。在這些情況下，一 些用於過濾如血樣或尿樣等原始樣品的手段對於提供有意義的結果至關重要。當前的基於 流體技術的裝置(特別是上述Qiagen裝置)使用需要支架的軟而柔順的玻璃過濾器。該 過濾器具有通常為約1 3微米的小孔徑，以便能夠從樣品中有效地捕獲核酸。由於這種 小孔徑，該過濾器因而也較薄，通常小於2毫米厚，由此可減小樣品受迫穿過小孔徑時的流 體流動阻力。在Qiagen程序中，通常將樣品與如胍等離液劑混合，並且利用離心力使該混 合物穿過玻璃過濾器，其中流體只沿一個方向流動。核酸粘在玻璃過濾器上；使用乙醇或異 丙醇將其洗下，然後使用10毫摩爾(lOmM)pH為約8(pH 8.0)的三羥甲基氨基甲烷(Tris) 緩衝液或水將其釋放。然而，由於流體流動所產生的阻力和較大流速所產生的堵塞的可能 性，小孔徑限制了可處理的樣品的量。因此，如Qiagen裝置等裝置可能容易損壞或者容易 變得無效。此外，這些特性限制了樣品輸入量、可檢驗的樣品類型、大體積樣品、濃集係數和 簡單的流體整合。較大的玻璃過濾器已被用於提供樣品的預處理過濾。例如，美國專利第4，912，034 號(Kalra、Pawlak等1990)描述了一種檢測液體樣品中的靶分析物的免疫測定法，其中包 括由玻璃纖維製成的可選的預濾器組件。然而，該裝置不是微流體裝置並且未明示或暗示可使用玻璃料過濾器板(glass frit)作為微小規模的PCR反應之前的過濾器。美國專利第4，923，978號(McCormack 1990)描述了玻璃纖維過濾器的從水性DNA樣品中除去不合 需要的蛋白質和蛋白質-DNA複合物的在先應用，但以貶低的方式提到這種過濾器具有較 低的粘合能力(參見第2列)。的確，美國專利第4，923，978號要求保護的是用於進行這種 過濾的截然不同的材料。美國專利第6，274，371號(Colpan 2001)描述了將矽膠、氧化鋁 和硅藻土作為優選過濾劑，以用於在核酸分析之前從細胞溶解產物中除去不合需要的汙染 物。美國專利第6，800，752號(Tittgen 2004)描述了使用色譜材料分離包含核酸的混合 物，其中，所述材料包含載體和離子交換劑功能，其中所述載體包括位於支持物上的纖維材 料，如塑料過濾器板(plastic frit)。然而，鑑於以上原因，對於提供可克服當前這代裝置的缺陷、能夠有效地分離和鑑 定核酸的流體裝置仍存在需求。本發明滿足這些需求和其它一些需求。

發明內容
本發明的第一方面提供了一種從含有核酸和外來雜質的混合物中分離所述核酸 的方法。用於本發明的適當的核酸包括微生物DNA和人基因組DNA。在一個實施方式中，本 發明的方法包括在可有效地將核酸與外來雜質分離的條件下，使所述混合物穿過玻璃料過 濾器板。在一個更特定的實施方式中，玻璃料過濾器板為燒結的玻璃料過濾器板。在一些 實施方式中，玻璃料過濾器板具有約2微米 約220微米的孔徑；在一些更特定的實施方式 中，玻璃料過濾器板具有約150微米 約200微米的孔徑；在另一些更特定的實施方式中， 玻璃料過濾器板具有約2微米 約100微米的孔徑；更特定的是，玻璃料過濾器板具有約 40微米 約75微米的孔徑；而另一些更特定的實施方式包括玻璃料過濾器板具有約2微 米 約20微米的孔徑的那些情況。在另一個實施方式中，本發明的方法包括使所述混合物 穿過玻璃料過濾器板，由此產生第一過濾混合物，然後在可有效地從第一過濾混合物中分 離核酸的條件下，使第一過濾混合物穿過第二玻璃料過濾器板。本發明的第二方面提供了一種用於從含有核酸和外來雜質的混合物中過濾分離 所述核酸的裝置。在一些實施方式中，所述裝置包含具有入口和出口的空腔；和設置於空腔 中的孔徑為約2微米 約220微米的至少一個玻璃料過濾器板，所述玻璃料過濾器板布置 在入口和出口之間的位置。在一些更特定的實施方式中，玻璃料過濾器板為燒結的玻璃料 過濾器板。在另一些實施方式中，玻璃料過濾器板為燒結的玻璃料過濾器板。在一些實施 方式中，玻璃料過濾器板具有約2微米 約220微米的孔徑；在一些更特定的實施方式中， 玻璃料過濾器板具有約150微米 約200微米的孔徑；在另一些更特定的實施方式中，玻璃 料過濾器板具有約2微米 約100微米的孔徑；更特定的是，玻璃料過濾器板具有約40微 米 約75微米的孔徑；而另一些更特定的實施方式包括玻璃料過濾器板具有約2微米 約 20微米的孔徑的那些情況。本發明的第三方面提供了一種用於從含有核酸和外來雜質的混合物中鑑定一種 或多種所述核酸的流體裝置。在一些實施方式中，本發明的這種流體裝置包含入口、出口 和與入口和出口都相通的位於入口和出口之間的至少一個流體反應腔。所述裝置還包含 布置在下述位置(一個或多個)的至少一個玻璃料過濾器板，所述位置鄰近入口和反應腔 (一個或多個)並與入口和反應腔(一個或多個)流體連通。玻璃料過濾器板具有約2微米 約220微米的孔徑。混合物通過入口進入裝置並穿過玻璃料過濾器板，從而作為過濾 產物離開該處，然後進入流體反應腔中。在玻璃料過濾器板和反應腔(一個或多個)之間 布置有至少一個與它們流體連通的流體試劑分配器。在一個更特定的實施方式中，玻璃料 過濾器板為燒結的玻璃料過濾器板。在一些實施方式中，玻璃料過濾器板具有約2微米 約220微米的孔徑；在一些更特定的實施方式中，玻璃料過濾器板具有約150微米 約200 微米的孔徑；在另一些更特定的實施方式中，玻璃料過濾器板具有約2微米 約100微米的 孔徑；更特定的是，玻璃料過濾器板具有約40微米 約75微米的孔徑；而另一些更特定的 實施方式包括玻璃料過濾器板具有約2微米 約20微米的孔徑的那些情況。在另一個實施方式中，流體裝置包含鄰近玻璃料過濾器板(一個或多個)的加熱器。參照附圖閱讀下文中的說明時，這些和其它方面以及優點都將變得顯而易見。


圖1是本發明的用於純化核酸的玻璃料過濾器板裝置(「過濾器模塊」)的示意 圖。圖2A和圖2B是本發明的過濾器的圖。圖2A是本發明的用於純化核酸的玻璃料 過濾器板裝置(「過濾器模塊」)的分解圖。圖2B是同一裝置的截面圖。圖3是本發明的用於純化核酸的玻璃料過濾器板裝置(「空腔」)的示意圖。圖4是本發明的微陣列裝置的示意圖。圖5是本發明的用於純化和鑑定核酸的方法的流程圖。圖6是說明如圖2A和2B所示的本發明的裝置的改進的性能特點的圖，所述改進 的性能特點通過測量作為PCR周期的函數的樣品材料(IOOyL以IX IO5個細胞/mL的濃度 存在於全血中的炭疽桿菌細胞)的螢光來證明。實線(A)顯示的是根據本發明處理的樣品 的結果；虛線⑶顯示的是使用來自Qiagen的市售的裝置處理的樣品；虛線(C)和⑶為 未處理的樣品和陰性對照物。圖7是說明如圖3所示的本發明的裝置的改進的性能特點的圖，所述改進的性能 特點通過測量作為PCR周期的函數的樣品材料(500yL以1\104個細胞/!^的濃度存在 於痰中的炭疽桿菌細胞)的螢光而得到證明。實線(A)顯示的是根據本發明處理的樣品的 結果；虛線(B)顯示的是未處理的樣品；虛線(C)為陰性對照物。
具體實施例方式本發明提供用於從核酸與諸如蛋白質、小分子、細胞膜片段等其它物質組合的混 合物中至少部分純化核酸的方法和裝置。此處所用的「核酸」是指天然存在的或人工合成的單個核酸和核酸的聚合鏈，包括 DNA和RNA(包括其類似物)，或者其變體，特別是已知天然存在的具有任何長度的那些變 體。本發明的核酸長度的實例包括但不限於適於PCR產物(例如約50個鹼基對(bp))和人 基因組DNA(例如從約數千個鹼基對(Kb)至數十億個鹼基對(Gb)的數量級)的長度。因 此，應該理解術語「核酸」涵蓋了天然或人工的單個核酸和核苷酸、核苷的序列段(stretch) 及其小片段的組合(例如表達序列標籤或基因片段)，以及較長的鏈，如基因組物質所示 例，包括單個基因，甚至整個染色體。在更特定的實施方式中，核酸來自如細菌或病毒等病原體。所述病原體包括對人類和動物有害的病原體。就對人類有害的病原體而言，在一些 實施方式中，所述病原體為用作生物武器的病原體，包括已經武器化的天然存在的病原體。 在一些實施方式中，核酸包括微生物DNA。在本發明的一個實施方式中，微生物DNA來自炭 疽桿菌。在另一些實施方式中，核酸來自人類或動物。在一些實施方式中，核酸包括人基因 組 DNA。本發明的第一方面提供了從含有核酸和外來雜質的混合物中分離所述核酸的方法。在一些實施方式中，本發明的方法包括使混合物穿過具有入口和出口的空腔；其中，所 述入口和出口相同，並且空腔中設置有至少一個多孔的過濾器，並處在可有效地將核酸與 外來雜質充分分離的條件下。此處所用的「外來雜質」是指樣品中不同於核酸的所有物質。 所述外來雜質的實例包括但不限於蛋白質、澱粉、脂質、金屬離子和較大的細胞結構，如膜 片段。此處所用的短語「充分分離」是指下述分離，在一些實施方式中所述分離可提供相對 於外來雜質其純度至少為30%的核酸，在更特定的實施方式中可提供相對於外來雜質其純 度至少為50%的核酸，在更特定的實施方式中可提供相對於外來雜質其純度至少為70% 的核酸，在更特定的實施方式中可提供相對於外來雜質其純度至少為95%的核酸，在更特 定的實施方式中可提供相對於外來雜質其純度至少為99%的核酸。在此處所描述的本發明的各實施方式中，玻璃料過濾器板通過使用本領域普通技 術人員所知的標準方法由標準材料製成，或者如下所述商購獲得。在一些實施方式中，玻璃 料過濾器板具有基本上為約1毫米 約20毫米的厚度，更特定的是為約2毫米 約5毫米， 進而更特定的是為約2毫米 約3毫米。適用於本發明的示例性玻璃料過濾器板孔徑(包 括此處所述的各實施方式)為約2微米 約200微米。在更特定的實施方式中，孔徑為約 150微米 約200微米。在另一些更特定的實施方式中，孔徑為約2微米 約100微米，更 特定的是為約40微米 約75微米。另一些實施方式包括孔徑為約2微米 約20微米的 那些實施方式。對於涉及微生物DNA的應用，玻璃料過濾器板孔徑以約10微米 約15微 米為宜。較大的玻璃料過濾器板孔徑可用於人基因組應用。適當的玻璃料過濾器板由燒結 的玻璃構成，通常用在化學玻璃器皿中，並可由Robu(德國)商購獲得。本領域普通技術人 員知道這種玻璃料過濾器板的選擇和製造。在另一些實施方式中，所述玻璃料過濾器板由多孔過濾器代替，或與其聯用。此處 所用的「多孔過濾器」是指允許至少一種液體中所含物質選擇性通過的任何材料。更具體而 言，「多孔過濾器」是指能夠從含有核酸的液體中充分除去所述核酸的那些材料。適當的多 孔過濾器的實例包括但不限於被構造為可捕獲核酸的濾紙(例如可由Whatman獲得的FTA 紙)、玻璃纖維、玻璃珠、可由Invitrogen獲得的具有Charge SwitchTechnology塗層的珠、 氧化鋁過濾器和多孔式整體聚合物。所述材料和產品為本領域普通技術人員所熟悉。在一 些實施方式中，多孔過濾器為玻璃料過濾器板。在另一些實施方式中，玻璃料過濾器板為燒 結的玻璃料過濾器板。其它適合提供玻璃料過濾器板或燒結的玻璃料過濾器板的過濾功能 的材料為聚矽氧烷和XTRABIND(Xtrana，Inc.，科羅拉多州布魯姆菲爾德)。執行本發明的 過濾功能的所述材料的構造對於本領域普通技術人員而言是顯而易見的。在一個實施方式中，上述玻璃料過濾器板被包裝在玻璃料過濾器板支持體或流體 模塊中。所述支持體或模塊的一個示例性實施方式的截面圖如圖1中的1000所示。其中， 如上所述的玻璃料過濾器板(1004)被放置在外殼(1008)中。外殼包含入口(1012)，包含所關注的核酸的流體混合物通過所述入口(1012)進入外殼，並與此處所述的玻璃料過濾 器板相互作用，產生穿過外殼出口(1016)的第一過濾混合物。離開過濾器保持體或模塊之 後，第一過濾混合物可以進入如下所述的與所述出口流體接觸的其它腔室中或者進入收集 器中。一些實施方式中包含如1020所示的可選的加熱器。本領域普通技術人員知道這種 裝置的設計和製造。本發明的此方面的第二實施方式如圖2A和2B所示。本領域普通技術人員知道這種裝置的設計和製造。圖2A顯示了玻璃料過濾器板保持體(2000)的一個實施方式的分解 圖，所述玻璃料過濾器板保持體包含上殼體(2002)和下殼體(2004)。下殼體包含在圖2B 中更詳細描述的凹槽(2006)，在所述凹槽(2006)中設置有一個或多個上述玻璃料過濾器 板(2008)。利用墊圈(2010、2012)將玻璃料過濾器板裝入這兩個殼體中。下殼體(2004) 還包含入口(未示出)和出口(2014)，含有擬分離的核酸的物質通過所述入口被引至玻璃 料過濾器板，廢料和經純化的核酸由所述出口排出過濾器模塊。圖2B顯示了玻璃料過濾器 板外殼(2000)的截面圖。在該圖中，除了剛剛描述過的元件之外，還顯示了入口(2018)以 及引導物質流通過玻璃料過濾器板和出口的通道。本發明的另一方面提供了從含有核酸和外來雜質的混合物中分離所述核酸的裝 置。本發明的這種過濾器的一個實施方式如圖3中的3000所示。在該圖中，空腔(3004) 具有包含核酸的混合物所穿過的第一開口(3008)和第二開口(3012)以及排出至少部分溶 解的混合物的出口。在入口和出口之間存在上述玻璃料過濾器板(3018)，所述玻璃料過濾 器板沿軸向延伸通過空腔的至少一部分內部體積，延伸程度如3016處所示。在一些實施方 式中，使用超過一個的這種玻璃料過濾器板。在另一些實施方式中，玻璃料過濾器板中至少 有一個由燒結的玻璃製成。本領域普通技術人員知道這種裝置的設計和製造。在一些更特定的實施方式中，空腔的一端具有截頭圓錐體形狀，該腔室的尺寸被 設計為可安裝在吸移器具的末端如吸移管尖端，使得物質首先被吸收通過第二開口、穿過 玻璃料過濾器板、過濾，然後保留在玻璃料過濾器板上方的腔室部分中。在一些實施方式 中，保留在玻璃料過濾器板上方的腔室部分中的樣品穿過玻璃料過濾器板返回並穿過第二 開口 (3012)。在另一個實施方式中，將上述吸移管尖端與被構造為可加熱玻璃料過濾器板的加 熱裝置聯用，以促進核酸從混合物中的分離。在更特定的實施方式中，加熱器的尺寸被設計 為可安裝在吸移管尖端內。本領域普通技術人員知道這種裝置的設計和製造。在另一些實施方式中，吸移管尖端與電子吸移器或自動吸移工作站偶聯來控制穿 過玻璃料過濾器板的流速。在一些實施方式中，電子吸移器為手持式裝置。本領域普通技 術人員知道這種裝置的設計、製造和操作。在本發明的一些實施方式中，組合使用兩個以上的多孔過濾器。在更特定的實施 方式中，各層具有不同的孔徑。不希望受限於任何特別的作用理論，較大的多孔過濾器孔徑 捕獲較大的顆粒，因此可以起到預濾器的作用。例如，可以將40微米 60微米的多孔過濾 器與10微米 15微米的多孔過濾器串聯使用，來濾除樣品(例如血液)中的人基因組DNA， 從而分離微生物DNA。使用40微米 60微米的多孔過濾器除去大量人類DNA可使低拷貝 微生物DNA更好地粘合在10微米 15微米的多孔過濾器上並進行更穩定的分析，因為人 基因組DNA不再以大至足以產生顯著幹擾(例如，通過全基因組擴增)的濃度存在。多孔過濾器可以如上所述位於吸移管尖端，厚度和直徑各自為約5毫米(mm)。在一些實施方式 中，將兩個以上多孔過濾器結合在一起，以形成基本上為整體式的結構。本領域普通技術人 員知道這種裝置的設計、製造和操作。在使用吸移管尖端設置過濾器的更特定的實施方式中，將具有較大孔徑的玻璃料過濾器板(一個或多個)設置得較靠近吸移管尖端入口。同樣，不希望受限於任何特別的作 用理論，但是本領域普通技術人員將會理解的是，將較大孔徑的過濾器布置得較靠近吸移 管尖端入口可以提供粘合在玻璃料過濾器板之內的核酸的更均勻的分布。通過比較，本領 域普通技術人員會預料到，若非如此，核酸將傾向於在最靠近吸移管尖端開口的區域粘合 至玻璃料過濾器板上，因為在核酸剛一進入玻璃料過濾器板時，核酸更可能發生初步接觸。本發明的又一個方面提供了用於分析核酸的微流體裝置。所述微流體裝置的一個 實施方式如圖4的4000所示。設置有如此處所述的玻璃料過濾器板保持體(4002)。上遊 有與洗脫緩衝液源(4004)流體連通的玻璃料過濾器板保持體、鹽酸胍(Gu)貯存器(4006) 和Gu混合塔(4008)，來自所述Gu貯存器和Gu混合塔的液流受閥(4010)控制。Gu混合塔 還與乙醇-空氣源(4012)流體連通。本領域普通技術人員將會發現，本發明也可以使用Gu 以外的離液劑。另外還有與樣品收集塔(4016)流體連通的珠磨式組織研磨器(4014)和電 觸頭(4020)，所述樣品收集塔(4016)又與入口止回閥(4018)流體連通。這些元件的輸出 受閥4022控制。繼續參考圖4，玻璃料過濾器板保持體(4002)的下遊有廢料槽(4024)，向其流動 的液流受閥(4026)控制。來自玻璃料過濾器板保持體的下遊液流也受第二個閥(4028)控 制，所述第二個閥(4028)控制沿第一支路流向洗脫塔(4030)和止回閥(4032)的液流；和 沿流路的第二支路流向另一個閥(4034)的液流。閥4034的再下遊有一個以上的PCR試 劑貯存器(4036)和通向PCR腔室(4040)的閥(4038)。PCR腔室的下遊是閥(4042)，所述 閥(4042)與閥4046 —起控制從PCR腔室流向微陣列腔室(4050)的液流，所述微陣列腔室 (4050)還與混合及衝洗緩衝液貯存器(4048)和廢料容器(4052)流體連通。本領域普通技 術人員知道這種裝置的設計和製造。參考圖4所描述的裝置的運行如圖5的流程圖所示。獲得例如含有所關注的細胞 的痰樣品等原始樣品(5002)之後，利用珠磨式組織研磨器4014使細胞溶解(5004)，並使 混合物穿過玻璃料過濾器板4002以純化核酸(5006)，從而通過PCR腔室4040擴增(5008) 和通過微陣列腔室4050檢測(5010)。不受限於任何特別的理論或作用，本發明通過提供下述剛性、自支持的玻璃料過 濾器板結構而滿足上述需要，所述玻璃料過濾器板結構較厚因而可提供高粘合能力，含有 較大的孔隙因而可提供低流體阻力、較高的流速和對臨床和環境樣品中的顆粒的高耐受 性，並且既不由鬆散的材料(例如矽膠、硅藻土、玻璃球)構成也不由易壞、脆弱的材料(例 如纖維過濾器、膜過濾器、矽微結構)構成，因而可提供在惡劣條件下的操作和包裝以及簡 化的製造。實施例提供以下實施例旨在說明本發明的某些方面並幫助本領域技術人員實施本發明。 絕不能認為這些實施例以任何方式限制本發明的範圍。I.使用本發明的裝置的方案
參考圖2A和2B，實施本發明的純化和檢測的方案提供如下。1.將玻璃料過濾器板插入保持體中(下述四種不同孔隙之一細、中、粗和特粗)。 固定外殼。2.將 500 μ L 樣品(IO4 拷貝 /mL)與 500 μ L 6Μ 的胍(ρΗ 6. 5)混合。3.使用ImL注射器使混合物(ImL)以100 μ L/分鐘的流速穿過玻璃料過濾器板。使用5mL注射器，手動使空氣穿過玻璃料過濾器板，以清洗樣品。 4.使用ImL注射器，以ImL/分鐘的速度注入ImL 70%的乙醇(EtOH)，以洗滌粘合 的核酸。使用5mL注射器，手動使空氣穿過玻璃料過濾器板，以清洗EtOH。5.使用ImL注射器，以100 μ L/分鐘的速度小心地將洗脫緩衝液(lOmMTris，ρΗ 8. 0)注入玻璃料過濾器板保持體中，直至在出口管中首先看到緩衝液為止。6.將加熱器(heat block)放在玻璃料過濾器板保持體下方，並在70°C加熱3分 鍾。7. 3分鐘後，繼續使洗脫緩衝液穿過玻璃料過濾器板保持體。收集組分(50 μ L IOOyL)用於PCR分析。8.使用ImL 10 %的漂白劑(漂白劑稀釋時間不超過1周)、5mL 10 %的 Tris-HCKpH 8.0)和5mL水衝洗玻璃料過濾器板保持體。將玻璃料過濾器板放回原處。II.實施本發明的第二方案參考圖3，實施本發明的純化和檢測的方案提供如下。1.向A瓶中的500 μ L6M的胍中加入500 μ L樣品。並進行渦旋混合。2.將內置有玻璃料過濾器板的1. 2mL的吸移管尖端連接於電子吸移器(Gilson Concept)上。3.將電子吸移器設置為速度1 (最低速)。吸入A瓶中的ImL樣品混合物。推注 樣品混合物，使其完全穿過玻璃料過濾器板。樣品混合物的推注使其立即位於玻璃料過濾 器板的上方。4.將樣品放回A瓶中。樣品混合物的推注使其被完全排回瓶中。5.重複步驟3和4四次。6.將電子吸移器設置為速度5 (最高速)。吸放B瓶中的ImL 70%的乙醇，以洗滌 玻璃料過濾器板上的粘合的核酸。重複四次。7.通過使尖端位於乙醇溶液的上方來除去痕量的乙醇。吸放空氣五次以乾燥玻璃 料過濾器板。8.將容納有100 μ L IOmM Tris-HCl (ρΗ 8. 0)的C瓶放入設置為70°C的加熱器中。 加熱5分鐘。9.將電子吸移器設置為速度1。吸入洗脫緩衝液並將其放回C瓶中，重複五次，以 從玻璃料過濾器板中除去核酸。III.本發明的優良結果的證明採用所述方案的兩個實驗的結果如圖6和圖7中所示，其中，使用本發明的物質和 方法處理了全血和痰中的炭疽桿菌(Ba)樣品。圖6中，使用本發明的方法和裝置(圖2A和圖2B)處理的樣品(曲線A)優於使用 由Qiagen商購獲得的裝置處理的樣品(曲線B)。曲線C和曲線D分別為未處理的輸入樣品和陰性對照物。實驗中，輸入 οομ L在全血中為105/mL的炭疽桿菌細胞，使其通過此處 所述的中(孔徑為10 μ m 15 μ m)玻璃料過濾器板或者進入Qiagen裝置中，收集約50 μ L 的洗脫液並使用PCR進行分析。如圖所示，在PCR擴增約25個周期之後，使用本發明的物 質和方法處理的樣品清楚且顯著地優於使用現有技術的裝置處理的樣品所獲得的結果。圖7說明了使用所述方法和裝置(圖3)的另一實驗的結果，其中，使用本發明的物質和方法處理痰中的炭疽桿菌樣品。使用本發明的方法和裝置處理的樣品(曲線Α)優 於未處理的樣品(曲線B)。曲線C為陰性對照物。該實驗中，輸入500yL在痰中為IO4/ mL的炭疽桿菌細胞，使其通過此處所述的中玻璃料過濾器板，收集約100 μ L的洗脫液並使 用定量、實時PCR進行分析。如圖所示，在PCR擴增約27個周期之後，使用本發明的物質和 方法處理的樣品清楚且顯著地優於未處理的樣品所獲得的結果。上述方法和裝置可成功地用於從表1所列的各種有機物中鑑定DNA和/或RNA，所 述有機物存在於表2所列的各種基質(即，樣品類型)中。表 1病毒性馬腦炎(VEE)牛痘病毒鼠疫桿菌炭疽桿菌腺病毒化膿鏈球菌肺炎衣原體A型流感B型流感腺病毒+化膿鏈球菌的混合物A型流感和腺病毒的混合物使用本發明的方法和裝置有效地分析了以下物質表 2水/TE(10mMTris-HCl，1. OmM EDTA 緩衝液)棉籤提取物(swab extracts)痰洗鼻水全血結論與現有技術相比，本發明提供了幾個優點1)不需要離心分離或用以移動流體的 高壓的簡化的方法和裝置；2)流體整合至完整的分析系統的模塊式裝置；3)可在保持低流 體阻力的同時處理複雜樣品的大孔徑；4)因流體可由兩個方向移動而具有的高提取和洗 脫效率；5)不需附加支持結構的剛性；和6)可將裝置再利用於連續取樣的耐用性。雖然此 處描述了多個具體實施方式
和實施例，但是本領域普通技術人員將會理解，可以實現本發 明的許多不同實施方式，而不背離本公開文件的要旨或範圍。例如，具有核酸親合力的其它材料可用於玻璃料過濾器板，或者可將玻璃料過濾器板修改為能夠更好地吸引核酸和不需使用如胍等離液鹽即能夠更好地吸引核酸。玻璃料過濾器板可以含有固定抗體來提取微生 物和毒素。對於本領域普通技術人員而言其它變化是顯而易見的。文獻目錄以下參考文獻通過援弓I整體併入本說明書中，其適用於各種目的。Beach, R. A. , Strittmatter, R. P.等(2007). Integrated MicropumpAnalysis Chip and Method of Making the Same (集成微泵分析晶片及製造其的方法)US 7，189，358.Co Ipan, Μ. (2001) . Process and device for the Isolation of CellComponents, Such as Nucleic Acids, from 20 Natural Sources (從 20 種天然來源 分離如核酸等細胞成分的方法和裝置)US 6，274，371.Deshmukh, A. J. (2006). Method and Automated Fluidic System forDetecting Protein in Biological Sample (用於檢測生物樣中的蛋白質的方法和自動化流體系統) US 6，989，130.Kalra, K. L. , Pawlak, K.等(1990). Immunoassay Test Device andMethod (免疫 測定裝置和方法)US 4，912，034.Knollenberg, B. Α. ，Rodier, D.等(2007). Molecular ContaminationMonitoring System and Method (分子汙染監控系統和方法)US 7, 208, 123.McCormack, R. Μ. (1990).Process for Purling Nucleic Acids US4, 923, 978.Terry, B. R. ,Scudder,K. M.等(2004). Method and Apparatus for HighDensity Format Screening for Bioactive Molecules (高密度方式篩分生物活性分子的方法和裝 置).US 6，790，652.Tittgen,1(2004). Chromatography Material and a Method Using theSame(fe 譜材料和使用其的方法)US 6，800，752.Wick,C. H. (2007). Method and System for Detecting and RecordingSubmicron Sized Particles (用於檢測和記錄亞微型顆粒的方法和系統).US7, 250，138.
權利要求
一種從含有核酸和外來雜質的混合物中分離所述核酸的方法，所述方法包括使所述混合物流動通過空腔的內部體積；所述空腔具有設置於其中的至少一個玻璃料過濾器板，所述玻璃料過濾器板布置在所述空腔中，使得所述混合物在能有效地將所述核酸與所述外來雜質充分分離的條件下流動通過所述玻璃料過濾器板。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述玻璃料過濾器板為燒結的玻璃料過濾器板。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述核酸包括微生物DNA和RNA。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述核酸包括人基因組DNA和RNA。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述混合物通過玻璃料過濾器板的所述流動產生 第一過濾混合物，並且所述方法還包括在能有效地從所述第一過濾混合物中分離所述核酸 的條件下，使所述第一過濾混合物流動通過第二玻璃料過濾器板。
6.如權利要求1所述的方法，其中，所述玻璃料過濾器板具有約2微米 約220微米的 孔徑。
7.如權利要求6所述的方法，其中，所述玻璃料過濾器板具有約150微米 約200微米 的孔徑。
8.如權利要求6所述的方法，其中，所述玻璃料過濾器板具有約2微米 約100微米的孔徑。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所述玻璃料過濾器板具有約40微米 約75微米的 孔徑。
10.如權利要求8所述的方法，其中，所述玻璃料過濾器板具有約2微米 約20微米的孔徑。
11.一種從含有核酸和外來雜質的混合物中分離所述核酸的方法，所述方法包括使 所述混合物流動通過空腔的內部體積；所述空腔具有設置於其中的至少一個玻璃料過濾器 板，所述玻璃料過濾器板布置在所述空腔中，使得所述混合物流動通過所述玻璃料過濾器 板，其中，所述流動包括先使所述混合物沿第一方向流動穿過所述玻璃料過濾器板，再使所 述混合物沿與所述第一方向相反的方向流動穿過所述玻璃料過濾器板，從而所述混合物在 能有效地將所述核酸與所述外來雜質充分分離的條件下穿過所述玻璃料過濾器板至少兩 次。
12.—種從含有核酸和外來雜質的混合物中分離所述核酸的裝置，所述裝置包括其 中設置有至少一個玻璃料過濾器板的空腔，所述玻璃料過濾器板布置在所述空腔中，使得 當所述混合物穿過所述空腔時所述混合物流動穿過所述玻璃料過濾器板，並且所述玻璃料 過濾器板具有約2微米 約220微米的孔徑。
13.如權利要求12所述的裝置，其中，所述玻璃料過濾器板為燒結的玻璃料過濾器板。
14.如權利要求13所述的裝置，所述裝置還包含被配置為加熱所述玻璃料過濾器板的 加熱裝置。
15.如權利要求12所述的裝置，其中，所述玻璃料過濾器板具有約150微米 約200微 米的孔徑。
16.如權利要求15所述的裝置，其中，所述玻璃料過濾器板具有約2微米 約100微米 的孔徑。
17.如權利要求16所述的裝置，其中，所述玻璃料過濾器板具有約40微米 約75微米的孔徑。
18.如權利要求16所述的裝置，其中，所述玻璃料過濾器板具有約2微米 約20微米 的孔徑。
19.一種從核酸和外來雜質的混合物中鑑定一種或多種所述核酸的流體裝置，所述裝 置包括入口、出口和位於所述入口和所述出口之間並與所述入口和所述出口都相通的至 少一個流體反應腔室；所述裝置還包含設置在鄰近所述入口和所述至少一個反應腔室處 並與所述入口和至少一個流體反應腔室都流體連通的至少一個玻璃料過濾器板，所述玻璃 料過濾器板具有約2微米 約220微米的孔徑，使得所述混合物通過所述入口進入所述裝 置並穿過所述玻璃料過濾器板從而作為過濾產物離開，然後進入所述至少一個流體反應腔 室；設置在所述玻璃料過濾器板與所述至少一個反應腔室之間的至少一個流體試劑分配 器，所述至少一個流體試劑分配器與所述至少一個流體反應腔室流體連通。
20.如權利要求19所述的裝置，其中，所述至少一個玻璃料過濾器板包括至少一個燒 結的玻璃料過濾器板。
21.如權利要求19所述的裝置，其中，所述至少一個玻璃料過濾器板包括至少一個具 有約150微米 約200微米孔徑的玻璃料過濾器板。
22.如權利要求19所述的裝置，其中，所述至少一個玻璃料過濾器板包括至少一個具 有約2微米 約100微米孔徑的玻璃料過濾器板。
23.如權利要求22所述的裝置，其中，所述至少一個玻璃料過濾器板包括至少一個具 有約40微米 約75微米孔徑的玻璃料過濾器板。
24.如權利要求22所述的裝置，其中，所述至少一個玻璃料過濾器板包括至少一個具 有約2微米 約20微米孔徑的玻璃料過濾器板。
25.如權利要求24所述的裝置，所述裝置還包含鄰近至少一個所述至少一個玻璃料過 濾器板的加熱器。
全文摘要
本發明提供從含有核酸和外來雜質的混合物中分離所述核酸的方法和裝置。在一個實施方式中，本發明的方法包括在能有效地將核酸與外來雜質分離的條件下，使所述混合物穿過玻璃料過濾器板。在一個更特定的實施方式中，玻璃料過濾器板為燒結的玻璃料過濾器板。
文檔編號G01N33/543GK101883776SQ200880116501
公開日2010年11月10日 申請日期2008年3月11日 優先權日2007年10月31日
發明者菲利普·貝爾格勒 申請人:阿考尼生化系統公司