新型甲型h1n1流感na蛋白b細胞表位及其應用的製作方法
2023-05-31 02:29:21 1
專利名稱：新型甲型h1n1流感na蛋白b細胞表位及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥工程技術領域，具體涉及新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞的抗原表位及其應用。
背景技術：
自2009年新型甲型Hmi流感在墨西哥和美國流行以來，該型流感已蔓延全球；根據廣東地區流感監測結果顯示，截至2010年1月底，前6個月的分離毒株中，新型甲型Hmi 流感毒株佔90 %以上，是最明顯的優勢毒株。根據Garten RJ報告，新型甲型Hmi流感NA基因來自歐亞豬流感基因 [GartenRJ, Davis CT, Russell CA, et al. Antigenic and Genetic Characteristicsof Swine-Origin 2009 A(HlNl) Influenza Viruses Circulating in Humans. Science. 2009 ； 325(5937) :197-201.感染人類的豬流感Hmi的抗原性及遺傳特徵；科學；2009.]； Maurer-Stroh S 等[Maurer-Stroh S, Ma J, Lee RTC, etal. Mapping the sequence mutations of the 2009 HlNl influenza A virusneuraminidase relative to drug and antibody binding sites. BiologyDirect. 2009,4(18) : 1-9. 2009 年 Hmi 中與藥物和抗體結合位點有關的神經氨酸酶的突變序列圖譜研究；生物直接；2009.]分析了該型流感NA與藥物和抗體結合位點，採用 Califonia-04-2009(新型 H1N1) ,Hong Kong-516-1997 (H5N1)、 Iowa-1945 (豬H1N1)等某些序列位點的胺基酸序列差異，發現位點變異沒有改變藥物作用，但改變了抗原表位。吳迪等[吳迪，徐天幕，孫靜，等.甲型Hmi流感病毒HA蛋白結構模建與構象表位分析.科學通報.2009 ；54(12) :1642-1644.]根據甲型Hmi流感病毒HA 蛋白的一級結構序列，採用蛋白質分析軟體，分析其可能的構象表位；王國戧等[王國戧， 牛菊霞，賈安奎.甲型Hmi流感病毒血凝素的B細胞抗原表位預測.中國病原生物學雜誌.2009 ；4(12) =890-893.]預測了甲型Hmi流感病毒血凝素的B細胞抗原表位。但已公開發表的研究具有以下缺陷=(I)Maurer-Mroh S等沒有對新型甲型Hmi 流感NA蛋白表位進行全面研究，僅對IETCNQS胺基酸序列(序號第46-52位，作者認為可能是表位；其它亞型毒株具有不同胺基酸序列序號)等進行理論剖析，沒有實驗數據支持； (2)吳迪等對血凝素(注不是NA)三維構象進行分析，不涉及表位序列，也無實驗數據支持；C3)王國戧等僅採用分子生物學軟體對血凝素(注不是NA)B細胞抗原表位進行預測， 發現可能的45個表位肽；後者研究較為粗淺，是理論預測的初級階段。B細胞表位是指抗原中可被B細胞抗原受體(BCR)或抗體特異性識別並相互結合的線性片段或空間構象型結構。B細胞表位預測有助於免疫原性多肽和新型疫苗分子的設計，並有利於診斷試劑的開發以及臨床治療。如果單純使用實驗去尋找所需要的B細胞表位，在目前的生物實驗技術水平下是不可能達到的。而採用免疫信息學方法對抗原表位進行預測成為表位定位必不可少的工具，並發揮巨大作用。參與高能量連接的胺基酸殘基構成抗原-抗體的關鍵性結合殘基(CBR)，CBR上胺基酸的替換將極大地影響其親和性。若CBR位於較短的連續性多肽序列內，則其形成線性表位；若CBR位於多肽序列間隔較遠的位置，通過蛋白摺疊聚集在抗原表面，則其形成構象性表位。抗體一般通過深而狹窄的袋狀抗原結合槽與多糖、核酸、多肽、半抗原等形成的B 細胞表位相結合，在結合槽中的氨基端和羧基端通過範德華力聚合在一起。研究認為蛋白的親水部位與蛋白的抗原性有關，計算局部平均親水性峰值發現蛋白中平均親水性峰值區域大多位於線性B細胞表位內或與之相連。運用數學方法對球蛋白的研究發現極性胺基酸殘基大多位於球狀蛋白表面，而非極性胺基酸大多位於蛋白內部，並計算了蛋白中位於球狀蛋白表面的突出指數，發現理論計算的蛋白突出部位與實驗確定的B細胞表位間具有較高的一致性。對蛋白的可及性即抗原中胺基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性參數和蛋白的電荷分布參數等研究發現，這些參數值均可用作為預測某些蛋白抗原決定簇的重要參數。人們希望獲得相對準確、儘可能短的肽鏈作為有效抗原。目前以蛋白質的理化性質和胺基酸結構上的特點為理論基礎，不斷改進新的預測方法和加入新的計算方法，如綜合預算法、疊加預算法等，一些新的分析軟體也相應開發使用。目前，國外B細胞表位預測方法多數是從抗原蛋白的胺基酸一級結構出發，以線性表位預測為主，其基本思想是綜合抗原蛋白理化性質、結構特點、統計顯著性度量等指標進行表位預測。但是基於上述參數的表位預測，預測準確度一般低於60 %，難以令人滿意。
發明內容
本發明的目的是提供新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞的抗原表位，並篩選出其表位肽，同時製備作用於表位肽的抗體，這些表位肽或抗體可應用於Hmi的疫苗、藥物的研製以及檢測等方面。為實現上述目的，採用如下的技術方案本發明的新型甲型Hmi流感NA蛋白的毒株編號為⑶-801-2009，其NA基因在 GenBank的序列號為GenBank⑶471691。本發明的新型甲型Hmi流感NA蛋白共469個胺基酸，序列如下MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISHSIQLGNQNQIETCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSK⑶VFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAffSASACHDGINVLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSffRNNILRTQESECACYNGSCFTYMTDGPSNGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNVHGSNRPffVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVfflGRTKSISSRNGFEMIffDPNGffTGTDNNFSIKQDIVGINEffSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFffVELIRGRPKENTIffTSGSSISFCGVNSDTVGffSffPDGAELPFTIDK其中，下劃線部分的序列為其B細胞表位，具體來說，其B細胞表位的胺基酸序列及其位置如下所示位置肽段序列_101-104 SKDN
140-156 LNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGS376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 RGRPKE_其中，為了使上述肽段能較好的和偶聯蛋白結合，進而可以增強表位肽的免疫原性以產生高效價相應抗體，在化學合成這些表位肽時，我們在有的肽段序列的前端或末端增加了半胱氨酸(C)。因而，實際應用中，我們使用的肽段序列如下所示位置肽段序列_101-104 SKDNC140-156 CLNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGSC376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 CRGRPKE_其中，下劃線標註的C為化學合成中加入的胺基酸。上述八段表位序列是通過生物信息學方法分析獲得的，利用生物分析軟體進行目的基因的核苷酸和胺基酸一般特性和胺基酸變異研究，對胺基酸變異進行評估；然後進行蛋白特性和結構的分析，設置預測、篩選和評估程序，篩選B細胞表位，最後建立3D模型， 對於目的蛋白(目的基因)胺基酸變異位點進行變異前後的胺基酸特性改變的比較，分析特定胺基酸位點變異對目的基因蛋白表位的可能影響，得到上述八段表位序列及其具體位置。進而通過實驗確證表位肽的特異性、表位肽抗體的敏感性、中和病毒等作用。 實驗表明，本發明的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位肽具有明顯的NA蛋白的某些特異性功能，具有免疫原性，與其相作用的抗體具有中和病毒作用；這就意味著表位肽在感染宿主細胞中發揮著非常重要的作用。這就為用於製備新型疫苗和藥物提供了科學依據；其免疫產生的抗體具有開發免疫診斷試劑的作用，尤其是表位肽胺基酸數目較長的肽段。上述表位肽可以作為檢測抗原用於開發新型甲型Hmi流感相關診斷試劑盒(檢測特異性抗體)；上述表位肽抗體能特異地與相應的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位中的分別結合，也可以作為開發新型甲型Hmi流感相關診斷試劑盒(檢測特異性抗原)。上述表位肽可以作為靶蛋白，用於新型甲型Hmi流感的治療；其相應抗體可進一步做拮抗新型Hmi病毒的藥物。
上述疫苗可包含新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位中的一種或多種抗原表位肽。本發明的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位為新型甲型Hmi流感的診治預防奠定了基礎，為用於製備新型疫苗和藥物提供了科學的依據。
圖1是本發明利用生物信息學分析預測目的基因線性B細胞表位的三維立體結構圖，紅色的部分即是已鑑定的表位肽位置。
具體實施方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。需要說明的是其中所用到的生物信息學分析軟體、分析方法和相關資料庫都為本領域中專用，本領域技術人員可以通過查閱文獻或資料庫網站而獲得。實施例1 新型甲型Hmi流感病毒NA蛋白B細胞表位的分析新型甲型Hmi流感病毒NA蛋白B細胞表位的分析按如下方法進行(1)基因序列檢測與變異分析採用Primer Premier 5. 0設計併合成甲型流感病毒(Hmi毒株)的目的基因(神經氨酸酶，NA)的RT-PCR引物；檢測目的基因核苷酸序列，根據流行病學(時間、地點分布) 資料，選擇目的毒株；下載國內、外目的基因核苷酸序列；採用Lasergene 7. 1軟體和Mega 4. 0軟體，進行目的基因的核苷酸和胺基酸一般特性和胺基酸變異研究，對胺基酸變異進行評估。與此比較毒株目的基因核苷酸序列來自資料庫GenBank和LANL。(2)蛋白特性和結構分析根據流感病毒目的蛋白核苷酸序列，採用SWISS-MODEL軟體分析其螺旋區和片層區(AS和SS)並採用Chimera軟體分析其螺旋區和片層區(AC和SC)；使用Protean軟體，採用Karplus-Schulz方法分析蛋白質的表面柔性O7K)，採用Kyte-Doolittle的胺基酸親水性指標(HPK)分析其親水性，採用Emini方法分析蛋白質的表面可及性(SPE)，採用 Jameson-Wolf方法分析其抗原指數(AIJ)。(3)預測、篩選和評估程序①聚類與相關分析用SPSS 13.0統計軟體分析目的基因編碼蛋白的相關數據。 SWISS-MODEL軟體分析的目的蛋白的螺旋區和片層區(AS和SS)中，將結果「h」設為1， 將無「h」設為0，將結果「S」設為1，將無「S」設為0 ；Chimera軟體分析的螺旋區和片層區(AC和SC)中，將結果「h」設為1，將無「h」設為0，將結果「S」設為1，將無「S」設為0。 Karplus-Schulz方法中，將結果「F」設為1，將無「F」設為0。Kyte-Doolittle方法預測其親水性、Emini方案預測蛋白質的表面可及性、Jameson-Wolf方案預測抗原性指數按具體數值處理，計算各數值統計學分布和四分位數。目的基因蛋白相關數據經SPSS 13. O統計學軟體聚類、相關分析，對於各變量進行歸類，並進行兩兩相關性分析。②篩選B細胞表位以4個以上連續胺基酸殘基為一組的方案，初步預測篩選和預測目的蛋白抗原的B細胞表位。根據目的蛋白的螺旋結構、片層結構、柔性區，蛋白表面親水性、可及性、抗原指數(Al)的特性，建立一種篩選方法，進行目的蛋白的B細胞表位預測和篩選。 篩選的具體入選程序如下a.排除條件SWISS_M0DEL方法和Chimera方法預測均無螺旋區；SWISS-MODEL方法和Chimera方法預測均無片層區(一般螺旋區和片層區常位於各自不同殘基區域)。所以，兩種方法預測均無螺旋區或兩種方法均無片層區的區域入選；b.入選參數入選參數有三項，包括Kyte-Doolittle方法分析胺基酸親水性、 Jameson-Wolf方法預測蛋白序列抗原指數、Emini方法預測胺基酸殘基位於蛋白質表面； 入選條件①三項參數中，各單項參數數值> 50%四分位數；或②如果三項參數中，有兩項參數數值> 50%四分位數，此外應滿足以下條件該區域不出現螺旋區和片層區。c.肽段選擇以4個及4個以上連續胺基酸殘基為一組的方案，初步預測篩選和預測目的基因蛋白的B細胞表位。根據以上a、b、c條件，綜合預測結果。③評估預測肽段參考SPSS抗原指數(SPSS』 Al)，評價目的蛋白抗原表位，SPSS 抗原指數表見表2。平均AI =總Al/胺基酸數量。具有較高平均AI的肽段是表位的主要候選者。(4)建立3D模型①建模採用SWISS-MODEL軟體和Chimera軟體，分別建立目的基因蛋白三維立體結構模型；並用Swiss-PdbViewer軟體分析。②變異前後比較對於目的蛋白(目的基因)胺基酸變異位點，進行變異前後的胺基酸特性改變的比較，分析特定胺基酸位點變異對目的基因蛋白表位的可能影響。通過上述分析，從目的蛋白NA胺基酸序列(本研究檢測的毒株包括GenBank中， GU471691, GU471692, GU471693, GU471694, GU471695, GU562466, GU562467, GU562468, ⑶562469 ；以及從GenBank中下載全球200餘株NA胺基酸序列)，比較胺基酸位點變異，得到目的基因線性B細胞表位如表1所示，表1是目的基因線性B細胞表位的胺基酸序列。目的基因線性B細胞表位的三維立體結構圖見圖1，紅色的部分即是鑑定的表位位置。表 1_______________________________________________________位置肽段_______________________________________________________101-104 SKDN140-156 LNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGS376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 RGRPKE______________________________________________________
由於表位肽分子較小且抗原性較弱，表位肽與偶聯蛋白結合後可以增加其免疫原性並刺激產生足以檢測的免疫抗體；而在某些表位肽段序列的前端或末端增加了半胱氨酸 (C)，其目的是便於結合上偶聯蛋白。因而，在後續實驗中我們使用的表位肽的序列如下所示位置肽段序列_101-104 SKDNC140-156 CLNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGSC376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 CRGRPKE_其中，下劃線標註的C為化學合成中加入的半胱氨酸。表 權利要求
1.新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位，其特徵在於，具有如下所示的胺基酸序列 SKDN、LNDKHSNGTIKDRSPYR、SPYNSRFE、SffRNNILRTQES, DNffHGSNRP, DNPRPNDKTGS、DPNGffTGTDNNFSI, RGRPKE ；以及含有一個或多個胺基酸插入、缺失、替代或添加並保持其結構和活性的胺基酸序列。
2.權利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位的應用，其特徵在於，用於製備新型甲型Hmi流感疫苗或藥物。
3.一種疫苗，其特徵在於，包含權利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位中的一種或多種的抗原表位肽。
4.一種抗體或抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體或抗原結合片段特異地與權利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位中的一種或多種分別結合或序列一致。
5.一種藥物，其特徵在於，所述藥物含有權利要求4所述的抗體或抗原結合片段。
6.預防治療新型甲型Hmi流感感染的方法，其特徵在於，施用免疫有效量的權利要求 3所述的疫苗或有效量的權利要求5所述的藥物。
7.權利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細胞表位的應用，其特徵在於，作為靶蛋白用於開發新型甲型Hmi流感相關診斷試劑盒。
8.檢測新型甲型Hmi流感的方法，其特徵在於，使用了權利要求7所述的診斷試劑盒。
全文摘要
本發明涉及採用生物信息學結合實驗鑑定的方法研究新型甲型H1N1流感NA蛋白B細胞表位。該B細胞表位有8段胺基酸序列，其序列如下SKDN、LNDKHSNGTIKDRSPYR、SPYNSRFE、SWRNNILRTQES、DNWHGSNRP、DNPRPNDKTGS、DPNGWTGTDNNFSI、RGRPKE。本發明的B細胞表位肽具有中和病毒等作用，可用於研發新的表位肽疫苗和藥物，開發新型甲型H1N1流感診斷試劑，還可用作治療靶點。
文檔編號C07K5/10GK102153621SQ20101011663
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月12日 優先權日2010年2月12日
發明者倪漢忠, 張永慧, 許元生, 黃平 申請人:廣東省疾病預防控制中心