活細菌定量檢測技術PMA-qPCR的條件優化方法

2023-05-31 08:59:01

活細菌定量檢測技術PMA-qPCR的條件優化方法
【專利摘要】本發明屬於微生物檢測領域，涉及一項檢測技術的條件優化方法，尤其涉及一種活細菌定量檢測技術：PMA-qPCR的條件優化方法。為了克服在活細菌定量檢測中，現有PMA-qPCR技術的條件優化環節成本高、耗時長和操作強度大的不足，本發明提供了一種基於流式細胞術（Flow Cytometry,FCM）的活細菌定量檢測技術PMA-qPCR的條件優化方法，可以直接對PMA處理的細菌細胞進行FCM分析，由於省去了基因組提取和qPCR擴增的操作，因此可以在很低的成本下快速簡便地得到最佳的PMA濃度和曝光時間。針對PMA處理條件優化，本發明方法具有快速、簡便和低成本的優點。
【專利說明】活細菌定量檢測技術PMA-qPCR的條件優化方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物檢測領域，涉及一項檢測技術的條件優化方法，尤其涉及一種 活細菌定量檢測技術：PMA-qPCR的條件優化方法。

【背景技術】
[0002] 實時螢光定量PCR即qPCR技術作為特定核酸片段定量的金標準，是目前應用最為 廣泛和有效的核酸分子定量手段。考慮到細菌數量和其含有的特定核酸分子(如16S rDNA) 呈正比例關係，因此qPCR技術也被用於細菌定量檢測領域中。然而在實際的微生物生態體 系中，有活細菌也存在著死細菌；死細菌雖然已經死亡，但其DNA會在較長時間內存在，因 此採用qPCR定量反映的是某種菌總菌的結果。對於微生物體系的解析尤其涉及生態功能 的分析，活細菌的數目更加能反映該種菌在生態體系中發揮的實際影響和作用，因此如何 排除死細菌的幹擾準確定量活細菌變得十分重要，由此催生了PMA-qPCR等活細菌的定量 分析技術。
[0003] 疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA)是一種對核酸具有高度親和力的光敏 染料，由於不能透過完整的細胞膜，PMA只能修飾細菌死亡後暴露出來的DNA分子。用合適 濃度的PMA處理的細菌樣品暴露於強光下時，PMA所帶的光敏性疊氮基團轉化為高活性的 氮賓自由基，並與結合位點附近的任意碳氫化合物反應形成穩定的共價氮碳鍵。這樣使得 死細菌的DNA獲得永久修飾，導致其DNA分子的qPCR擴增被阻斷；而活細菌則不受影響。 相關研究表明，PMA與qPCR技術結合後可有效的抑制死細菌DNA的擴增，因此PMA-qPCR技 術是一種能有效用於細菌活細胞定量檢測的分子手段，現在被廣泛應用於致病菌或有害菌 活菌的定量檢測等領域中。
[0004] PMA對死細菌DNA的共價結合效率受到多種因素的影響，主要因素有細菌種類、菌 液濃度、PMA濃度和曝光時間等。PMA濃度和曝光時間的選擇在於：PMA濃度過低或曝光時 間過短則不能充分結合和修飾死細菌的DNA ;而PMA濃度高到一定程度則會有不容忽視數 量的PMA分子滲透進活細菌細胞內，長的曝光時間將增強其對活菌DNA的結合和修飾作用。 因此採用PMA-qPCR對某一研究體系中特定活細菌進行定量檢測時，往往先在固定的純菌 濃度下探究最佳的PMA處理濃度和曝光時間，之後用於實際從而達到更高的準確率。優化 流程(具體的可以參照：李聰聰，PMA-qPCR活菌檢測方法的建立與應用.華南理工大學碩士 學位論文，2012.等文獻）如下： (1)製備細菌懸液：培養好純菌後，適當稀釋到一定濃度(如〇D600=l，即經過稀釋使得 在600nm下的吸光值為1)，取若干份等體積的菌，其中一半採用加熱和超聲處理結合製備 死菌樣品，而另外一半不做處理為活菌樣品；（2) PMA處理：在不同的PMA濃度和曝光時間 下處理（1)中的活菌組和死菌組樣品；（3)qPCR擴增和數據分析：提取（2)中經PMA處理的 樣品的基因組DNA，以此為模板採用該細菌特異性的qPCR引物進行擴增，得到各組的Ct值 (qPCR螢光閾值同擴增曲線交點對應的循環數）綜合分析選出最佳的PMA處理條件。最低 的PMA濃度和曝光時間為死細菌組Ct值穩定時（即不隨PMA濃度和曝光時間的增加而發生 顯著的增高，如ct值增量不超過1)的處理濃度和時間，最高的PMA濃度和曝光時間為活細 菌Ct穩定時的處理濃度和時間；而最佳的PMA處理條件則在最高和最低的PMA濃度和曝光 時間之間的實際處理條件中擇優選定，這樣在保證充分抑制死細菌DNA擴增的同時又不會 影響到活細菌DNA的擴增。
[0005] 然而上述條件優化方法是利用qPCR進行評估和篩選的，需要對PMA處理的樣品進 行基因組提取和qPCR擴增。以六個PMA處理濃度（如0uM、10uM、20uM、30uM、50uM、100uM，OuM作為空白對照是必需的）和三個曝光時間（5min、8min、lOmin)為例，則活細菌組和死細 菌組合起來一共需要分析36個樣品。僅以細菌基因組提取試劑盒花費為5元/樣本、DNA 的qPCR擴增花費為10元/樣本進行估算，在不計其它試劑耗材和不做平行的情況下，一次 PMA濃度和曝光時間優化的保守花費為540元。而時間方面，基因組提取需要半天，qPCR擴 增需要半天，合起來需要8個小時左右。而且考慮到36個樣本如果同時進行基因組提取和 qPCR擴增，操作強度大因此對操作要求高，而且很難保證效果一致性，此外可能需要接觸有 毒試劑，如果分批做則時間和工作量將增加。
[0006] 通過上述分析可知，現有的PMA-qPCR技術最佳條件的優化方法成本、時間和操作 代價大。考慮到PMA處理的細菌細胞帶有螢光染料，因此可以避開基因組提取和qPCR擴增 直接對細胞進行分析，從而尋求一種快速、簡便和經濟的方法以篩選出最佳的PMA處理條 件。


【發明內容】

[0007] 為了克服在活細菌定量檢測中，現有PMA-qPCR技術的條件優化環節成本高、耗 時長和操作強度大的不足，本發明提供了一種基於流式細胞術（FlowCytometry,FCM)的 PMA-qPCR條件優化方法，可以直接對PMA處理的細菌細胞進行FCM分析，由於省去了基因組 提取和qPCR擴增的操作，因此可以在很低的成本下快速簡便地得到最佳的PMA濃度和曝光 時間。
[0008] 本發明解決其技術問題所採用的技術方案如下： (1) 同通常的PMA-qPCR條件優化一樣，先製備細菌懸液和進行PMA處理； (2)採用血球計數板計算所用細菌的大致濃度，根據得到的菌液濃度結果對（1)中不同 PMA濃度和曝光時間處理後的純菌樣品，用無菌生理鹽水將其都稀釋到106-107個/mL範圍 內； (3) 取500uL(2)中稀釋的細菌懸液按照流式細胞儀標準操作規程進行測定，設定檢測 細胞的數目不少於10000個，採用波長為488nm的雷射激發； (4) 測定結束後，首先對無PMA處理的死細菌細胞組即空白對照組，在FSCvs.SSC的 細胞二維散點圖上圈定細胞群集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量的比例 應不少於80% ; (5) 對（4)中圈定區域內的細菌細胞群做單獨分析，橫坐標設定為488nm激發光的檢測 信號記為FITC，在FITCvs.SSC散點圖上，用十字界標設門，尋找某一FITC螢光閾值，使 得95%以上的死細菌細胞都包含在該螢光閾值線左側區域；保存死細菌空白對照組的分析 方法，套用到其它PMA處理條件下的死細菌樣品； (6) 對比不同PMA處理條件下死細菌的流式細胞分析結果，在某一PMA濃度和曝光時間 下，有95%以上的細胞位於（5)中螢光閾值線的右側區域，並且隨著PMA濃度和曝光時間的 增加，該比例增加的幅度不會超過2% ;則此時的PMA濃度和曝光時間為最優PMA處理條件 的下限； (7) 再對無PMA處理的活細菌細胞組，在FSCvs.SSC的細胞二維散點圖上圈定細胞群 集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量的比例應不少於80% ; (8) 對（7)中圈定區域內的細菌細胞群做單獨分析，橫坐標設定為488nm激發光的檢測 信號記為FITC，在FITCvs.SSC散點圖上，用十字界標設門，尋找某一FITC螢光閾值，使 得95%以上的活細菌細胞都包含在該螢光閾值線左側區域；保存活細菌空白對照組的分析 方法，套用到其它PMA處理條件下的活細菌樣品； (9 )對比不同PMA處理條件下活細菌的流式細胞分析結果，在某一PMA濃度和曝光時間 下，仍有95%以上的細胞位於（8)中螢光閾值線的左側區域，並且隨著PMA濃度和曝光時間 的增加，該比例增加的幅度不會超過2% ;則此時的PMA濃度和曝光時間為最優PMA處理條 件的上限； (10)最佳的PMA處理條件則在最高和最低的PMA濃度和曝光時間之間的實際處理條件 中擇優選定。
[0009] 本發明的有益效果是，基於FCM技術的PMA-qPCR條件優化方法，無需基因組提取 和qPCR擴增步驟，可以直接對PMA處理的細菌細胞進行分析，得到同通常基於qPCR的PMA 處理條件優化方法一致的效果，因此本發明方法將會以很低的成本，快速簡便地得到最佳 的PMA濃度和曝光時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是OuMPMA處理死細菌5min即死菌空白對照的FCM圖譜，左側是FSCvs.SSC 散點圖，右側是FITCvs.SSC散點圖。
[0011] 圖2是OuMPMA處理活細菌5min即活菌空白對照的FCM圖譜，左側是FSCvs.SSC 散點圖，右側是FITCvs.SSC散點圖。
[0012] 圖3是OuMPMA處理死細菌8min即死菌空白對照的FCM圖譜，左側是FSCvs.SSC 散點圖，右側是FITCvs.SSC散點圖。
[0013] 圖4是OuMPMA處理活細菌8min即活菌空白對照的FCM圖譜，左側是FSCvs.SSC 散點圖，右側是FITCvs.SSC散點圖。

【具體實施方式】
[0014] 一、FCM用於PMA-qPCR技術中PMA處理環節的條件優化的原理 流式細胞術，即利用流式細胞儀對處在快速直線流動狀態中的生物顆粒，如各種細胞、 微生物及人工合成微球等進行多參數、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現代細 胞分析技術。該技術是細胞周期和DNA倍體分析的常用手段，利用的是核酸染料(如PI、 PADI等）與細胞內核酸的結合情況來反映細胞的生理狀態。採用qPCR評估PMA處理的細 菌細胞樣品，實質上是利用Ct值(擴增效應)來反映PMA與死細菌和活細菌細胞內核酸的結 合情況，然而核酸染料PMA結合的細胞也可以直接採用流式細胞術評估其核酸狀態。經試 驗表明PMA可以在常用的流式細胞儀激發波長488nm下發出強烈的螢光。
[0015] 最佳的PMA處理條件，應該使得死細菌細胞的核酸得到充分的結合，同時要在活 細菌完整細胞膜的阻擋能力之內。然而實際上，即使是最優的PMA濃度和曝光時間都不可 能使得所有死細菌細胞的核酸都有完全、均一而充分的結合和修飾效果，也不可能對所有 的活細菌細胞完全沒有影響。因此在實際操作中，可以設定一個基本的界限保證絕大多數 的細菌細胞，這裡確立的原則是：（1 )95%以上的死細菌細胞得到充分結合，而不影響95%以 上的活細菌細胞；而95%是基本的比例要求，該比例越高越好，最好是能達到97. 5%以上； (2)隨著PMA濃度和曝光時間的增加，以空白對照樣本確定的螢光閾值線為界，細菌細胞內 核酸與PMA結合的比例不再發生大幅度的變化，如不會在合理的相鄰條件下增加2%以上。 在這一原則下，具體分析過程如下： 對於死細菌組，首先分析空白對照即無PMA處理的樣品，由於沒有加入螢光染料PMA則 對於圈定的細胞群，理論上接近100%的細胞無螢光產生，此時在FITCvs.SSC可以選定一 FITC螢光閾值(橫坐標)，使得至少95%以上的細胞都包含於該螢光閾值線的左側，這一熒 光閾值可以認為是螢光本底信號。隨著PMA的加入，有一部分細胞由於PMA的充分結合和 修飾檢測時其螢光值將超過螢光本底，因此將跑到螢光閾值線的右側；隨著PMA濃度和\或 曝光時間的增加死細菌越來越多、越來越充分的得到結合和修飾，因此超過螢光閾值的細 胞數目將越來越多；直到某一PMA濃度和曝光時間，使得大部分細菌細胞(如95%以上）都 跑到螢光閾值線的右側，並保持穩定而不會隨著PMA濃度和\或曝光時間的增加而有大幅 度的增加。此時的PMA濃度和曝光時間為PMA處理條件的下限，即至少要使用這一濃度的 PMA處理這一時間，才能使得絕大多數死細菌細胞的核酸能夠被充分結合和修飾。
[0016] 對於活細胞組，原理相似。由空白對照即無PMA處理的活菌樣品設定螢光閾值線， 對於圈定的細胞群，使得至少95%以上的細胞都位於該螢光閾值線的左側。在低PMA濃度 和\或短曝光時間的情況下絕大多數活細菌細胞由於存在完整的細胞膜並不會被PMA結合 和修飾，因此大部分細胞仍位於在螢光閾值線左側區域；隨著PMA和\或曝光時間增加，跑 到螢光閾值線右側的活細胞數量會有小幅度的增加(相鄰條件間增幅小於1%);而直到PMA 和\或曝光時間增加到某一程度時，由於高PMA濃度的滲透作用和長曝光時間的反應等，導 致活細菌由於細胞內核酸被PMA結合和修飾而跑到螢光閾值線的右側區域的比例顯著增 力口 (如相比相鄰的低濃度？嫩和\或短曝光時間增幅超過1%)。則此時的PMA濃度和曝光時 間為PMA處理的上限，即不能超過這一濃度的PMA處理這一時間，否則會有不可忽視比例的 活菌細胞被PMA結合和修飾。
[0017] 低於PMA處理條件的下限和超過PMA處理條件的上限都將影響採用PMA-qPCR對 活菌進行精準的定量分析。而最高和最低的PMA濃度和曝光時間之間的實際處理條件都 是理想的PMA處理條件，然而實際應用的條件只有一個，因此可以根據實際情況從中擇優 選定最佳的PMA處理條件。FCM分析PMA處理的細菌樣本，除了鞘液、清洗劑等基本消耗外 幾乎無其它額外的成本，經核算小於2. 5元/樣本，以36樣的優化為例成本在100元以內。 此外每樣的分析時間在2min內，加上之前的計數(只需計數一次）稀釋(所有樣本做同樣的 稀釋）等簡單操作，36樣的優化僅需2h左右。此外，FCM的上機操作十分簡便，幾乎只需手 工換樣。因此相較於通常基於qPCR的優化方式採用FCM在成本、時間和操作方面代價都極 低。
[0018] 二、具體操作步驟 (1) 同通常的PMA-qPCR條件優化一樣，先製備細菌懸液和進行PMA處理； (2)採用血球計數板計算所用細菌的大致濃度，根據得到的菌液濃度結果對（1)中不同 PMA濃度和曝光時間處理後的純菌樣品，用無菌生理鹽水將其都稀釋到106-107個/mL範圍 內； (3) 取500uL(2)中稀釋的細菌懸液按照流式細胞儀標準操作規程進行測定，設定檢測 細胞的數目不少於10000個，採用488nm的雷射激發； (4) 測定結束後，首先對無PMA處理的死細菌細胞組即空白對照組，在FSCvs.SSC的 細胞二維散點圖上圈定細胞群集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量的比例 應不少於80% ; (5) 對（4)中圈定區域內的細菌細胞群做單獨分析，橫坐標設定為488nm激發光的檢測 信號記為FITC，在FITCvs.SSC散點圖上，用十字界標設門，尋找某一FITC螢光閾值，使 得95%以上的死細菌細胞都包含在該螢光閾值線左側區域；保存死細菌空白對照組的分析 方法，套用到其它PMA處理條件下的死細菌樣品； (6) 對比不同PMA處理條件下死細菌的流式細胞分析結果，在某一PMA濃度和曝光時間 下，有95%以上的細胞位於（5 )中螢光閾值線的右側區域，並且隨著PMA濃度和曝光時間的 增加，該比例增加的幅度不會超過2% ;則此時的PMA濃度和曝光時間為最優PMA處理條件 的下限； (7) 再對無PMA處理的活細菌細胞組，在FSCvs.SSC的細胞二維散點圖上圈定細胞群 集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量的比例應不少於80% ; (8) 對（7)中圈定區域內的細菌細胞群做單獨分析，橫坐標設定為488nm激發光的檢測 信號記為FITC，在FITCvs.SSC散點圖上，用十字界標設門，尋找某一FITC螢光閾值，使 得95%以上的活細菌細胞都包含在該螢光閾值線左側區域；保存活細菌空白對照組的分析 方法，套用到其它PMA處理條件下的活細菌樣品； (9 )對比不同PMA處理條件下活細菌的流式細胞分析結果，在某一PMA濃度和曝光時間 下，仍有95%以上的細胞位於（8)中螢光閾值線的左側區域，並且隨著PMA濃度和曝光時間 的增加，該比例增加的幅度不會超過2% ;則此時的PMA濃度和曝光時間為最優PMA處理條 件的上限； (10)最佳的PMA處理條件則在最高和最低的PMA濃度和曝光時間之間的實際處理條件 中擇優選定。
[0019]其中，步驟（2)中細菌細胞稀釋液濃度控制在106-107個/mL範圍內為宜：濃度太 低，上機檢測時的流速不得不採用高速或中速，影響結果的準確性；濃度太高，一方面細胞 容易聚集成團堵塞液路，使液流不穩，另一方面還會使核酸燃料的相對濃度偏低，影響實驗 結果；不同的PMA處理濃度應該包括無PMA處理的空白對照組；不需要精確計數和稀釋，因 為後續FCM上機分析環節有設定固定的檢測數目如10000個。
[0020] 其中，對於步驟（4)中的FSCvs.SSC的細胞二維散點圖，FSC表示前向偏振光維 度作為橫坐標，SSC表示側向偏振光維度作為縱坐標。
[0021] 其中，對於步驟（4)和步驟（7)中分析區域的選定，無論是死細菌細胞還是活細菌 細胞，由於細胞形態和狀態不可能完全一致，因此選擇細胞集中的區域，這裡界定為不少於 80%的區域進行分析，不僅不影響最終的結果反而可以很好排除一些細胞形態和狀態差異 幹擾，有助於最佳PMA處理條件的分析。
[0022] 其中，對於步驟（5)和步驟（8)的FITCvs.SSC二維散點圖，十字設門只針對FITC 進行分界，因此縱坐標不做區分，設定所有細胞都是SSC陰性；流失細胞儀具備自動保存某 一樣本分析方法並作為標準分析方法套用到其它樣本的功能，因此分別將死細菌組和活細 菌組的空白對照樣本的分析方法作為標準方法分析組內的其它樣本，這裡的分析方法主要 指空白對照組FSCvs.SSC的圈定區域和確定出的FITCvs.SSC螢光閾值。
[0023] 下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明並不限於此。
[0024] 實施例1:本實施例以大腸桿菌co/i)Top10菌株為研究對象，對 於利用PMA-qPCR進行活菌的定量檢測，採用基於qPCR的通常方法和基於FCM的新方法優 化其最佳PMA處理濃度和曝光時間。本實施例的具體步驟和結果如下： 1、製備大腸桿菌懸液 活菌懸液：將保存在斜面培養基中的大腸桿菌轉接到LB搖瓶培養基中，37°C下恆溫培 養約12h，取30mL均勻菌液於50mL滅菌離心管中，lOOOOrpm離心3min後棄上清，沉澱用 滅菌生理鹽水懸浮並混勻，靜置lmin後lOOOOrpm離心3min，棄上清收集菌體加入30mL滅 菌生理鹽水懸浮。
[0025] 死菌懸液：同樣取30mL培養好的均勻菌液於50mL滅菌離心管，放入80°C的水浴 鍋，水浴l〇min。水浴後，放入超聲波清洗器進行5min的超聲波處理(頻率100Hz)，使細胞 膜通透。然後lOOOOrpm離心3min後棄上清，沉澱用滅菌生理鹽水懸浮並混勻，靜置lmin 後lOOOOrpm離心3min，棄上清收集菌體加入30mL滅菌生理鹽水懸浮。
[0026] 用分光光度計將菌濃度調節為0D600=1，用血球計數板計算培養的菌液濃度，其濃 度約為2X108個/mL。對於活菌懸液和死菌懸液，各取10份菌懸液裝入1. 5mL滅菌的塑料 離心管中，每份0. 5mL。
[0027] 2、PMA處理 PMA儲備液：將lmg的PMA溶解於20%的二甲亞碸（DMS0)中，配製成10mM的PMA溶液， 於-20°C避光保存。
[0028] 對於10份活細胞懸液樣品和10份死細胞懸液樣品，分別加入適量的PMA儲備液， 使PMA的終濃度分別為0剛、10剛、30剛、50剛、100剛，PMA與菌液充分混勻後在室溫條件下 避光反應5min,之後將樣品置於冰水上(避免過熱),在距離樣品20cm處利用500W的滷素燈 曝光5. 0min和8.Omin,曝光期間每隔30s進行充分混勻。曝光交聯後將離心管在lOOOOrpm 離心5min,棄上清收集菌體，加入lmL無菌生理鹽水重懸菌體，然後再進行lOOOOrpm離心 5min，棄上清以除去未交聯的PMA，加入500uL無菌生理鹽水重懸。若要保存，則將樣品用 500uL無水乙醇重懸，保存於-20°C冰箱，並於3天內進行測定。
[0029] 3、稀釋菌懸液 將各PMA處理條件下的菌懸液用無菌生理鹽水稀釋20倍使其大致濃度為1X107個/mL〇
[0030] 4、FCM上機檢測 取500uL稀釋後的細菌懸液按照BD公司AccuriC6流式細胞儀標準操作規程進行測 定，設定檢測細胞的數目為10000個，採用488nm的雷射激發，中等流速模式。
[0031] 5、FCM結果處理 死菌組： 測定結束後，首先對無PMA處理的死細菌細胞組即空白對照組，在FSCvs.SSC的細 胞二維散點圖上圈定細胞群集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量的比例約 為80%;對圈定區域內的細菌細胞群做單獨分析：在FITCvs.SSC散點圖上，用十字界標設 門，界定的FITC螢光閾值使得95%以上的死細菌細胞都包含在該螢光閾值線左側區域，結 果如圖1和圖3所示。從圖中可以看出，界定的FITC螢光閾值使得95%以上的活細菌細胞 都包含在該螢光閾值線左側區域，分別達到了 97. 2% (5min組）和96. 9% (8min組)。保存 死細菌空白對照組的分析方法，套用到其它PMA處理條件下的死細菌樣品，以確定的螢光 閾值線為基準各條件下細菌分布比例見表1。死菌是通過加熱和超聲方式製備的，從圖中 可以看出形態差異較大，因此本實施例設定的螢光閾值線只能保證97%左右的細胞在其左 偵牝該比例也仍大於預定的比例即95%。
[0032] 活菌組： 對無PMA處理的活細菌細胞組即空白對照組，在FSCvs.SSC的細胞二維散點圖上圈 定細胞群集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量的比例約為80% ;對圈定區 域內的細菌細胞群做單獨分析：在FITCvs.SSC散點圖上，用十字界標設門，結果如圖2和 圖4所示。從圖中可以看出，界定的FITC螢光閾值使得95%以上的活細菌細胞都包含在該 螢光閾值線左側區域，分別達到了 99. 9% (5min組）和99. 6% (8min組)。保存活細菌空白 對照組的分析方法，套用到其它PMA處理條件下的活細菌樣品，以確定的螢光閾值線為基 準各條件下細菌分布比例見表1。從圖中可以看出，活菌形態相對穩定，因此本實施例設定 的螢光閾值線保證了 99. 5%以上的細胞在其左側。
[0033] 6、FCM結果分析 對表1的數據進行分析。對於死菌，隨著PMA濃度的增加，越過螢光閾值線的死菌越來 越多，5min組的最大比例達到了 91. 8%，8min組的優於5min組的達到97. 5% (大於95%);因 此從死菌結合修飾情況考量，應該選擇8min組。對於活菌，隨著PMA濃度的增加，越過螢光 閾值線的活菌有小幅度的上升，然而5min組和8min組在100uM的PMA濃度下比例突然增 加均超過了 1%，最終都大於2%。因此從活菌受影響的角度考量，PMA濃度應該小於100uM。 對於8min組的死菌，排除掉100uM後由於30uM和50uM的PMA作用時被結合的死菌比例分 別達到了 96. 1%和97. 5%均超過了 95%，且兩者差別不大；由於PMA必須從美國Biotium進 口價格較為昂貴且汙染環境，因此從節約PMA使用的角度來看，最終的PMA處理條件應該是 30uM處理 8min。
[0034] 表1死細菌組和活細菌組的FCM數據（％)

【權利要求】
1. 一種活細菌定量檢測技術PMA-qPCR的條件優化方法，其特徵是所述方法的步驟如 下： (1) 按照常規做法製備細菌懸液和進行PMA處理； (2) 對（1)中得到的不同PMA濃度和曝光時間處理後的純菌樣品，用無菌生理鹽水將其 都稀釋到1〇6_1〇7個/mL範圍內； (3) 取500uL (2)中稀釋的細菌懸液按照流式細胞儀標準操作規程進行測定，設定檢測 細胞的數目不少於10000個，採用488nm的雷射激發； (4) 測定結束後，首先對無PMA處理的死細菌細胞組即死細菌空白對照組，在FSC vs. SSC的細胞二維散點圖上圈定細胞群集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量 的比例應不少於80% ; (5) 對（4)中圈定區域內的細菌細胞群做單獨分析，橫坐標設定為488nm激發光的檢測 信號記為FITC，在FITC vs. SSC散點圖上，設十字門，尋找某一 FITC螢光閾值，使得95%以 上的死細菌細胞都包含在該螢光閾值線左側區域；保存（4)和（5)對死細菌空白對照組的 分析方法，套用到其它PMA處理條件下的死細菌樣品； (6) 對比不同PMA處理條件下死細菌的流式細胞分析結果，在某一 PMA濃度和曝光時間 下，有95%以上的細胞位於（5)中螢光閾值線的右側區域，並且隨著PMA濃度和曝光時間的 增加，該比例增加的幅度不會超過2% ;則此時的PMA濃度和曝光時間為最優PMA處理條件 的下限； (7) 再對無PMA處理的活細菌細胞組即活細菌空白對照組，在FSC vs. SSC的細胞二維 散點圖上圈定細胞群集中的區域，圈定區域內細胞的數量佔分析細胞數量的比例應不少於 80% ； (8) 對（7)中圈定區域內的細菌細胞群做單獨分析，橫坐標設定為488nm激發光的檢測 信號記為FITC，在FITC vs. SSC散點圖上，設十字門，尋找某一 FITC螢光閾值，使得95%以 上的活細菌細胞都包含在該螢光閾值線左側區域；保存（7)和（8)對活細菌空白對照組的 分析方法，套用到其它PMA處理條件下的活細菌樣品； (9 )對比不同PMA處理條件下活細菌的流式細胞分析結果，在某一 PMA濃度和曝光時間 下，仍有95%以上的細胞位於（8)中螢光閾值線的左側區域，並且隨著PMA濃度和曝光時間 的增加，該比例增加的幅度不會超過2% ;則此時的PMA濃度和曝光時間為最優PMA處理條 件的上限； (10)最佳的PMA處理條件則在最高和最低的PMA濃度和曝光時間之間的實際處理條件 中擇優選定。
【文檔編號】C12Q1/06GK104328199SQ201410644421
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月14日 優先權日:2014年11月14日
【發明者】黃志清, 陳智超, 陳強, 陳豔, 黎巧連 申請人:福建醫科大學