一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法

2023-05-30 12:07:56 1

專利名稱：一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法
技術領域：
本發明涉及一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法，具體是以植物組織培養為手段，用雪蓮成熟種子內的子葉為外植體，在培養基上進行培養，快速獲得雪蓮叢生芽的方法。
背景技術：
雪蓮(Saussurea involucrate Kar.et Kit)為菊科風毛菊屬植物。國內僅大面積分布以新疆，是我國中藥、民族藥中的珍稀名貴藥材。
在自然條件下，新疆雪蓮一般生長在天山海拔2000米以上的高山冰磧石、流石、灘石隙、高山草甸上，生態環境極為嚴酷。由於近些年來的極度採挖，天山一帶的野生雪蓮頻臨滅絕。在《中國珍稀頻危保護植物名錄》中被列為國家3級漸危物種而受到保護。
由於雪連種子成熟時，高山地區已是大雪季節，不易採集到成熟的種子，造成了引種栽培上的困難。因此，通過植物組織培養，獲得雪蓮再生苗的方法就成為引種和保護雪蓮的首選方法之一。
現有技術表明，對雪蓮的組織培養均以雪蓮的鮮嫩葉片為外植體，誘導愈傷組織，分化出芽，並誘導生根。或以雪蓮無菌苗為外植體誘導出愈傷組織，叢生芽試管苗。這兩種方法中，採自野外的嫩葉滅菌消毒相對困難，對外植體的損傷大，易汙染，誘導愈傷的成功率較低。以無菌苗為外植體是目前雪蓮組織培養中較為通用的方法，但要先培育無菌苗，再對無菌苗的葉片進行誘導培養，生產周期相對較長。水母雪蓮為新疆雪蓮的同屬植物，國內有文獻報導對水母雪蓮的組織培養作了深入的工作，取得了許多很好的成果。但水母雪蓮為雪兔子亞屬植物，未見以水母雪蓮成熟種子為外植體進行組織培養的報導。中國專利CN01124108X公開了細胞培養生成新疆雪蓮總黃酮的方法，該方法是採用氣升式生物反應器培養新疆雪蓮細胞提取總黃酮的。

發明內容
本發明目的在於，提供一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法，該方法包括在MS或BS培養基上進行子葉培養，誘導形成愈傷組織；在MS或BS培養基上進行愈傷組織的轉代培養誘導形成叢生芽。以新疆雪蓮成熟種子為材料，由於雪蓮種子有外殼及內膜的保護，有利於較為嚴格的滅菌消毒條件，愈傷誘導過程中汙染率較低，避免了由於消毒損傷所造成的外植體褐變現象。採用雪蓮成熟種子直接誘導出芽，速度快，一般經一個月的培養即可完成從外植體移植至叢生芽的誘導過程，叢生芽得率相對較高，成熟種子誘導愈傷發生得率在95％以上，愈傷誘導叢生芽的率近80％。
本發明所述的一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法，該方法包括在MS或BS培養基上進行子葉培養，誘導形成愈傷組織；在MS或BS培養基上進行愈傷組織的轉代培養誘導形成叢生芽；具體操作按下列步驟進行a、選取成熟的雪蓮種子，剝去種子外殼，撕去種子內膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪於愈傷誘導培養基上誘導愈傷發生，時間13-17天；b、將誘導形成的愈傷轉至叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽發生，轉代周期為5-18天，培養溫度為20-28℃，光照強度為2200-2700/ux，光照時間為12-15小時/天；c、愈傷誘導培養基和叢生芽誘導培養基的pH值為5.5-6。
愈傷誘導培養基為MS或BS培養基，同時附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L；2.4-D0.0-1.0mg/L。
叢生芽誘導培養基為MS或BS培養基，同時附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L。
雪蓮種子的滅菌消毒條件為75％乙醇浸泡25-35秒，用滅菌水衝洗數次，用2‰的優氯淨溶液浸泡25-35分鐘，滅菌水衝洗數次，再浸泡於滅菌水中2-4小時。
具體實施例方式
實施例1a、選取採自哈密的新疆雪蓮成熟的種子10粒，在超淨工作檯上用75％乙醇浸泡35秒，無菌水衝洗數次，再用2‰的優氯淨溶液浸泡25分鐘，無菌水衝洗數次，再浸泡於無菌水中2小時；剝去種子外殼，撕去種子內膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪於愈傷誘導培養基上誘導愈傷發生，時間15天，愈傷誘導培養基為BS培養基，同時附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，子葉接種5-7天後開始膨大，10-15天形成愈傷組織；b、15天後將誘導形成的愈傷組織轉入叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽發生，叢生芽誘導培養基為BS培養基，同時附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，轉代周期培養5-7天後愈傷開始出現芽點突起，10-15天出現大量叢生芽，培養溫度為20℃，光照強度為2200/ux，光照時間為12小時/天，出芽愈傷是總愈傷的80％，從接種外植體之大量出現叢生芽需1個月時間。
實施例2a、選取採自和靜縣的新疆雪蓮成熟的種子300粒，分成3份，每份100粒，在超淨工作檯上用75％乙醇浸泡25秒，無菌水衝洗數次，再用2‰的優氯淨溶液浸泡35分鐘，無菌水衝洗數次，再浸泡於無菌水中3小時；剝取種子外殼，撕去種子內膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪於愈傷誘導培養基上誘導愈傷發生，時間13天，愈傷誘導培養基為MS培養基，同時附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.8，子葉接種5-7天後開始膨大，10-15天形成愈傷組織；b、15天後將誘導形成的愈傷轉至叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽發生，叢生芽誘導培養基為MS培養基，同時附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，轉代周期培養5-7天後愈傷開始出現芽點突起，10-17天出現大量叢生芽，其中個別愈傷形成船形，船內出現大量球狀體，橢圓形體，長柱狀體及帶有雙芽尖的子葉胚，培養溫度為25℃，光照強度為2500/ux，光照時間為14小時/天，經3份種子統計，子葉誘導愈傷發生的出愈率均超過95％，只有個別未成熟的種子所剝取的子葉未能誘導愈傷發生，此類未成熟種子的子葉為一層薄皮，即使將誘導時間延長至1個月，也不能誘導發生。只有那些從接近成熟的種子剝取的子葉，在延遲後的誘導培養中形成愈傷組織，誘導時間較成熟種子多了一至兩倍。
實施例3a、選取採自和靜縣的新疆雪蓮成熟的種子50粒，在超淨工作檯上用75％乙醇浸泡30秒，無菌水衝洗數次，再用2‰的優氯淨溶液浸泡30分鐘，無菌水衝洗數次，再浸泡於無菌水中4小時；剝取種子外殼，撕去種子內膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪於愈傷誘導培養基上誘導愈傷發生，時間15天，愈傷誘導培養基為MS培養基，同時附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為6，子葉接種5-7天後開始膨大，10-15天形成愈傷組織；b、15天後將誘導形成的愈傷轉至叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽發生，叢生芽誘導培養基為MS培養基，同時附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，轉代培養5-7天後愈傷開始出現芽點突起，10-18天出現大量叢生芽，培養溫度為28℃，光照強度為2700/ux，光照時間為15小時/天，子葉誘導愈傷發生的出愈率為95％。
權利要求
1.一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法，其特徵在於該方法包括在MS或BS培養基上進行子葉培養，誘導形成愈傷組織；在MS或BS培養基上進行愈傷組織的轉代培養誘導形成叢生芽；具體操作按下列步驟進行a、選取成熟的雪蓮種子，剝去種子外殼，撕去種子內膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪於愈傷誘導培養基上誘導愈傷發生，時間13-17天；b、將誘導形成的愈傷轉至叢生芽誘導培養基上誘導叢生芽發生，轉代周期為5-18天，培養溫度為20-28℃，光照強度為2200-2700/ux，光照時間為12-15小時/天；c、愈傷誘導培養基和叢生芽誘導培養基的pH值為5.5-6。
2.根據權利要求1所述的一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法，其特徵在於愈傷誘導培養基為MS或BS培養基，同時附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L；2.4-D0.0-1.0mg/L。
3.根據權利要求1所述的一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法，其特徵在於叢生芽誘導培養基為MS或BS培養基，同時附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L。
4.根據權利要求1所述的一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生芽的方法，其特徵在於雪蓮種子的滅菌消毒條件為75％乙醇浸泡25-35秒，用滅菌水衝洗數次，用2‰的優氯淨溶液浸泡25-35分鐘，滅菌水衝洗數次，再浸泡於滅菌水中2-4小時。
全文摘要
本發明涉及一種雪蓮組織培養中快速誘導叢生的方法，該方法包括在MS或BS培養基上進行子葉培養，誘導形成愈傷組織；在MS或BS培養基上進行愈傷組織的轉代培養誘導形成叢生芽。以新疆雪蓮成熟種子為材料，由於雪蓮種子有外殼及內膜的保護，有利於較為嚴格的滅菌消毒條件，同時愈傷誘導過程中汙染率較低，避免了由於消毒損傷所造成的外植體褐變現象。採用雪蓮成熟種子直接誘導出芽，速度快，一般經一個月的培養即可完成從外植體移植至叢生芽的誘導過程，叢生芽得率相對較高，成熟種子誘導愈傷發生得率在95％以上，愈傷誘導叢生芽的率近80％。
文檔編號A01H4/00GK1600083SQ200410090239
公開日2005年3月30日 申請日期2004年10月27日 優先權日2004年10月27日
發明者趙民安, 王曉軍, 劉敏, 趙海清, 韋彥餘, 蘇惠民 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所