產丁醇基因工程菌的構建、菌株及其應用的製作方法
2023-05-30 17:01:26
專利名稱：產丁醇基因工程菌的構建、菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，涉及產丁醇基因工程菌的構建、菌株及其應用，具體是指產丁醇基因工程菌構建及其構建得到的一株菌株，還涉及利用該菌株發酵生產丁醇的方法。
背景技術：
丁醇是一種重要的有機溶劑和精細化工原料，也是一種潔淨的可再生能源，目前丁醇在美國的市場已達到每年1300萬噸。由於丁醇的化學合成法的原料是以石油為基礎的丙烯，隨著石油價格的迅猛增長，石油化工生產丁醇成本也隨之增長，因此生物發酵法生產丁醇受到廣泛關注。目前生物發酵法(ABE發酵法)生產丁醇主要通過丙酮丁醇梭菌屬發酵產生， 包括 Clostridium acetobutylicum, C. beijerinckii, C. pasteurianum, C.saccharoperbutylacetonicum, C. tetanomorphum, C. saccharoacetobutyIicum等。隨著生物技術、代謝工程、基因工程技術的飛速發展，採用分子生物學手段，構建遺傳穩定的基因工程菌生產丁醇成為研究的熱點，除了對產丁醇梭菌進行遺傳改造之外，還在其他微生物系統中重構丁醇代謝途徑，如大腸桿菌等。現有技術中，利用基因工程技術對大腸桿菌的代謝途徑進行加工改造，構建的大腸桿菌工程菌已能夠產生丙酮、丁醇。Bermejo等人構建了一個包含基因Γ adhe , etf他絮Uhil )的質粒pACT，並轉入大腸桿菌，首次構建了產丙酮的大腸桿菌工程菌，發酵後能夠產生2. 32 g/ L的丙酮；Inui等將來源於丙酮丁醇梭菌ATCC 824中合成丁醇途徑的關鍵基因thil、hbd、crt、bcd~etfB~etfA > adti^L,分別編碼硫解酶、3-羥基丁醯-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁醯-CoA脫氫酶和醛/醇脫氫酶在大腸桿菌中表達，酶的活性有所改變，基因工程菌發酵後產生I. 18 g/ L 丁醇；Nielsen等IE. coli中構建了丙酮丁醇梭菌的丁醇代謝路徑，直接表達多順反子能夠得到34 mg/L丁醇，分別表達單獨順反基因，丁醇產量能達到200 mg/L，若同時表達酵母甲酸銨脫氫酶基因，及過表達大腸桿菌的3-磷酸脫氫酶，丁醇產量可提高到580 mg/L ；Shen等人在大腸桿菌中構建了經過修飾的丙酮丁醇梭菌代謝途徑，得到了 Ter (醯基CoA轉移酶)催化的不可逆轉反應產生了 NADH和乙醯輔酶A驅動力，並使用氣提手段使重組菌株厭氧發酵能夠產生30 g/ L的丁醇。上述現有技術表明克隆丁醇合成中編碼關鍵酶的基因，進一步在大腸桿菌中進行表達，構建的大腸桿菌工程菌能夠產生丁醇。
發明內容
本發明的技術目的在於提供了一種新的產丁醇基因工程菌的構建方法和菌株，使得該構建方法是一種構建含有克氏梭菌丁醇合成途徑中關鍵基因catl、sucD'Mibd、cat2、abfD和丙酮丁醇梭菌ATCC 824中的基因bcd-etfB-etfA、adh^的從丁二酸到丁醇的代謝途徑方法，且本發明的菌株能夠為產丙酮丁醇大腸桿菌的基因工程研究奠定基礎。為實現本發明的技術目的，本發明採用以下技術方案。
一、本發明所述的產丁醇基因工程菌的構建方法。本發明以缺乏乳酸脫氫酶基因(7 ^)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7們活性的菌株為出發菌，重組表達基因 catl、sucD'Ahbd、cat2^ abfd、bcd~etfB~etfA> adti^L,獲得產丁醇基因工程菌，重組菌株的代謝途徑如圖I所示。具體步驟如下
O以克氏梭菌基因組DNA為模板，分別純化擴增出cat I、sucD、Ahbd、cat2、abfd基M，插入到表達質粒pTrc99a相應的酶切位點之間、連接獲得中間重組質粒pTrcCKL_5 ；
2)以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，純化擴增出基因後，插入到表達質粒pGEM-T Easy相應的酶切位點之間、連接獲得中間重組質粒T-A ；
3)以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，純化擴增出沒基因後，插入到中間重組質粒T-A相應的酶切位點之間、連接獲得中間重組質粒T-A-B ；
4)以中間重組質粒T-A-B為模板，純化擴增出的trc-acim-bcd-etfB-etfA基因後，插入中間質粒pTrc99CKL-5相應的酶切位點之間、連接獲得最終重組質粒pTrc99e ；
5)將構建重組質粒pTrC99e導入缺乏乳酸脫氫酶基因(7 /Μ)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/73)活性的出發菌的感受態，獲得的陽性轉化子即為產丁醇基因工程菌。二、採用本發明所述的構建方法得到的一株產丁醇基因工程菌菌株，其分類命名為大腸桿菌co7i) LP_99e，其保藏號編號為CCTCC NO M 2011403。三、本發明所述產丁醇基因工程菌的應用，包括菌種活化、種子培養、發酵培養產丁醇三步驟。(I)菌種活化劃線保藏的產丁醇基因工程菌的菌液到含有氯黴素和氨苄青黴素的平板，挑取平板上長出的單菌落到LB培養基的試管；
(2)種子培養按照體積比1%的接種量接入種子培養基中，有氧培養菌體OD6tltl至
O.8-1. O 時用 O. 3mM 的 IPTG 誘導至 OD600=3 ；
(3)發酵培養產丁醇按接種量體積比10%轉接至發酵培養基中厭氧發酵；其中，發酵培養基為LB,葡萄糖15 g/L,卡那黴素30 μ g/mL,氨節青黴素50 μ g/mL,氯黴素25 μ g/mL,0. 3mM IPTG。本發明的有益效果在於
採用基因工程手段將克氏梭菌丁醇合成途徑中關鍵基因cat I、sucDAhbd、cat2、abfD和丙酮丁醇梭菌中的基因bcd-etfB-etfA、ad成在大腸桿菌中進行重組表達，使重組大腸桿菌能夠產丁醇及其生產丁醇的方法未見公開，此應用推動了基因工程菌產丁醇的發展。目前利用大腸桿菌工程菌生產丁醇的產量雖然不高，但這為產丙酮丁醇大腸桿菌的基因工程研究奠定了良好的基礎。在大腸桿菌中構建新的丁醇生產系統，作為一種新型生產丁醇的途徑，必將成為今後研究高產丁醇的發展方向之一。
圖I構建的產丁醇基因工程菌中丁醇代謝途徑圖。圖2中間重組質粒pTrcCKL-5構建圖譜。圖3中間重組質粒T-A構建圖譜。圖4中間重組質粒T-A-B構建圖譜。
圖5重組質粒重組質粒pTrc99e的構建圖譜。圖6中間重組質粒pTrcCKL-5的&oR V單酶切鑑定圖。圖7重組質粒pTrc99e的Sma\單酶切鑑定圖。圖8重組質粒pTrc99e的Kpnl單酶切鑑定圖。本發明的產丁醇基因工程菌菌株，其分類命名為大腸桿菌(fccAericAia coli)LP-99e ;其保藏機構全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國.武漢.武漢大學；保藏日期為2011年11月21日，保藏號編號為CCTCC NO M 2011403。
具體實施例方式下面的實施例對本發明作詳細說明，但對本發明沒有限制。本發明的生物材料的來源的說明
I、質粒來源
(I) pTrc99a :購自 Introvegen 公司；
(2 ) pGEM-T Easy:購自 Promega 公司。2、基因組模板來源
(1)克氏梭菌基因組DNA C. kluyveri DSM 555 購自 DSMZ ；
(2)丙酮丁醇梭菌基因組DNA C. acetobutylicum ATCC 824 購買自 ATCC。3、出發菌株'E. colik￥ Ul的感受態菌株的來源有兩處
(1)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申請人首先通過查閱到該生物材料的上述文獻出處，並聯繫了發表人系美國芝加哥大學的David P. Clark教授，並郵件請求其贈與該生物材料，並免費獲得了該生物材料；且申請人保證從本申請日起二十年內向公眾發放該生物材料；
(2)該生物材料還在中國專利(申請號96198547.X，申請日1996. 10. 31，授權曰2003年I月I日，授權公告號CN1097632C)的專利文獻中公開並獲得授權。4、引物的設計及合成自行設計並外包金斯瑞生物技術公司合成。實施例I
本實施例說明構建包含表達基因cat I、sucD、^hbd、cat2、abfd的中間質粒pTrcCKL_5。其過程包括
I、設計合成帶有AfcoI酶切位點的上遊引物和帶有式 I酶切位點的下遊引物， Primerl 上遊引物5』 -ACGT CCATGGATGAGTAAAGGGATAAAG-3』 ；
Primer2 下遊引物5』 -ACGTGGTACCATAAAGTGTAACTAAAAATCA-3』。2、以克氏梭菌基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段，反應條件為95°C，
10min ；(95°C 30 s，50°C 30 s，72°C 8min，35 個循環)；72°C，10 min。純化擴增出的trc—ca tl-sucD-Ahbd-ca t2~abfd 基因後，表達質粒 pTrc99a 分別用 Nco I 和 Kpn I 雙酶切、連接獲得重組質粒pTrcCKL-5。使用V單酶切鑑定重組質粒pTrcCKL_5，得到四條帶大小分別是5805bp、和4163bp、881 bp和514 bp，結果見圖6，酶切結果表明，重組質粒pTrcCKL-5構建成功。 特別說明針對實施例I所述的cat I、sucD.、4hbd、cat 2 ^ abfd這5個基因片段,本發明採用了同一引物，可以分別克隆該5個基因片段後，分別插入到表達質粒pTrc99a相應的酶切位點之間，獲得重組質粒pTrcCKL-5 ;也可以一次性克隆出該5個基因片段，一次性插入到表達質粒pTrc99a相應的酶切位點之間，獲得重組質粒pTrcCKL-5。實施例2
本實施例說明構建包含表達基因bcd-etfB-etfA、adhe的中間重組質粒T_A_B。其過程包括
I、包含基因adhe的中間質粒T-A的構建，
(I)合成帶有I酶切位點的上遊引物和不帶酶切位點的下遊引物
Primer3上遊引物
5』 -ATCGCCCGGGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACACCATGGATGAAAGTTACAAATCAAAA-3，；
Primer4下遊引物
5』 -AGCTTTAAAATGATTTTATATAGAT-3』。(2)以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段，反應條件為95°C, 10 min ； (95°C 30 s，48°C 30 s，72°C 3min，35 個循環)；72°C，10 min。純化擴增出的trc-H基因後,表達質粒pGEM-T Easy與trc-H片段連接獲得中間重組質粒T-A。2、包含基因adhe、bcd_etfB_etfA的中間質粒T-A-B的構建，
(I)合成帶有feci酶切位點的上遊引物和帶有feci和Sim I酶切位點酶切位點的下遊引物
Primer5 上遊引物5』 -ATCGGAGCTTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAAGATCTATGGAT TTTAATTTAACAAG-3』 ；
Primer6下遊引物
5，-AGCTGAGCTCCCCGGGTTAATTATTAGCAGCTTTAA-3，。(2)以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段，反應條件為95°C, 10 min ； (95°C 30 s，48°C 30 s，72°C 3min，30 個循環)；72°C，10 min。純化擴增出的trc-bcd-etfB-etfA基因後，中間質粒T-A用SacI酶切、連接獲得新的中間重組質粒T-A-B。實施例3
本實施例說明構建重組表達基因ca 7、sucD、Ahbd^ ca t2、abfd、bcd~e tfB~e tfA、acim的最終重組質粒pTrc99e，即在中間重組質粒pTrcCKL-5基礎上連接基因ai*E、bcd-etfB-etfA,得到最終重組質粒pTrc99e。I、構建重組表達基因 cat I、sucD、^hbd、cat2、abfd.、bcd~e tfB~e tfA > adti^L 的最終重組質粒pTrc99e,其過程包括
以中間重組質粒T-A-B為模板，PCR擴增目的基因片段(以前述Primer3和Primer6為上下遊引物)，反應條件為95°C，10 min ； (95°C 30 s，48°C 30 s，72°C 6min，35 個循環)；72°C，10 min。純化擴增出的 trc-adhl-bcd-etfB-etfA 基因後，將中間質粒 pTrc99CKL_5用Smal酶切、連接獲得最終重組質粒pTrc99e。使用Smal和治ml分別單酶切鑑定重組質粒pTrc99e，5k3l切得到兩條大小分別是11313bp和5800bp的條帶，結果見圖7 -,Kpnl酶切得到三條大小分別是13914bp、1878bp和1358bp的條帶，結果見圖8，酶切結果表明，重組質粒pTrc99e構建成功。
2、將質粒pTrc99e導入出發菌株疋coliAFPlll的感受態(即缺乏乳酸脫氫酶基因(A/M)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/73)活性的菌株)，獲得的陽性轉化子即為本發明的新構建菌株 coli LP_99e。需要特別說明的是，本發明實施例1-3所述的七個基因片段(其中bcd-etfB-etfA視為一個基因片段)是在基因組上相連的大概長度在8000多bp的長片段，因此實施例3得到的重組質粒pTrC99e可視為一個總的長基因片段。
實施例4
本實施例說明過量表達新構建的大腸桿菌LP-99e與出發菌株疋co7iAFPlll兩者發酵過程中產丁醇能力的對比。(I)菌種活化劃線_80°C凍存管保藏的大腸桿菌LP_99e的菌液到含有氯黴素和氨苄青黴素的平板，挑取平板上長出的單菌落到5mL LB培養基的試管。其中，所述的含有氯黴素和氨苄青黴素的平板的配方為LB+Amp(氨苄青黴素50 μ g/mL) +Chl (氯黴素 25 μ g/mL) +15% 瓊脂。(2)種子培養按照體積比1%的接種量接入種子培養基中，有氧培養菌體OD6tltl至O. 8-1. O左右時用O. 3mM的IPTG誘導至OD600=3左右。所述的種子培養基的配方為酵母粉3 g/L，蛋白腖5 g/L，可溶性澱粉10 g/L，乙酸銨 2 g/L, NaCl 2 g/L，MgSO4 3 g/L，KH2PO4 I g/L, K2HPO4 I g/L，FeSO4 · 7H20 0.1 g/L,固體加瓊脂20 g/L，pH6.0。(3)發酵培養產丁醇採用厭氧血清瓶發酵，按接種量體積比10%轉接至發酵培養基中厭氧發酵48 h。厭氧血清瓶用發酵培養基為LB+葡萄糖(15g/L) +Kan (卡那黴素30 μ g/mL) +Amp (氨苄青黴素 50 μ g/mL) +Chl (氯黴素 25 μ g/mL) +0. 3mM IPTG。厭氧血清瓶培養後各種參數的測定結果見表I。
權利要求
1.一種產丁醇基因工程菌的構建方法，其特徵在於以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株為出發菌株，重組表達基因caU、sucDMd, cat2、abfd、 bcd-e tfB-e tfA、，獲得產丁醇基因工程菌。
2.根據權利要求I所述的產丁醇基因工程菌的構建方法，其特徵在於具體步驟如下1)以克氏梭菌基因組DNA為模板，分別純化擴增出catI、sucD、Ahbd、cat2、abfd基M， 插入到表達質粒pTrc99a相應的酶切位點之間、連接獲得中間重組質粒pTrcCKL_5 ；2)以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，純化擴增出基因後，插入到表達質粒 pGEM-T Easy相應的酶切位點之間、連接獲得中間重組質粒T-A ；3)以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，純化擴增出基因後，插入到中間重組質粒T-A相應的酶切位點之間、連接獲得中間重組質粒T-A-B ；4)以中間重組質粒T-A-B為模板，純化擴增出的trc-acim-bcd-etfB-etfA基因後，插入中間質粒pTrc99CKL-5相應的酶切位點之間、連接獲得最終重組質粒pTrc99e ；5)將構建重組質粒pTrC99e導入缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的出發菌的感受態，獲得的陽性轉化子即為產丁醇基因工程菌。
3.採用權利要求I所述的構建方法得到的一株產丁醇基因工程菌菌株，其分類命名為大腸桿菌co7i) LP_99e，其保藏號編號為CCTCC NO M 2011403。
4.權利要求I所述產丁醇基因工程菌的應用，其特徵在於包括菌種活化、種子培養、 發酵培養產丁醇三步驟，(1)菌種活化劃線保藏的產丁醇基因工程菌的菌液到含有氯黴素和氨苄青黴素的平板，挑取平板上長出的單菌落到LB培養基的試管；(2)種子培養按照體積比1%的接種量接入種子培養基中，有氧培養菌體OD6tltl至0.8-1. 0 時用 0. 3mM 的 IPTG 誘導至 OD600=3 ；(3)發酵培養產丁醇按接種量體積比10%轉接至發酵培養基中厭氧發酵；其中，發酵培養基為LB,葡萄糖15 g/L,卡那黴素30 V- g/mL,氨節青黴素50 u g/mL,氯黴素25 u g/ mL,0. 3mM IPTG。
全文摘要
本發明屬於生物工程技術領域，涉及產丁醇基因工程菌的構建、菌株及其應用。其構建過程主要通過分子生物學手段將克氏梭菌丁醇合成途徑中關鍵基因cat1、sucD、4hbd、cat2、abfD和丙酮丁醇梭菌中的基因bcd-etfB-etfA、adhE在大腸桿菌中進行重組表達，構建出從丁二酸到丁醇的代謝通路。利用已構建的重組菌株EscherichiacoliLP-99e進行發酵使其能夠生產丁醇。
文檔編號C12R1/19GK102618569SQ20121006792
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者姜岷, 張秋妍, 歐陽平凱, 郭亭, 陳佳楠, 韋萍 申請人:南京工業大學