一種顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒及其使用方法

2023-06-24 11:05:41

專利名稱：：一種顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒及其使用方法
技術領域：
：本發明涉及一種顯示細胞增殖活性的試劑盒及其使用方法，具體地涉及一種顯示脫落細胞如宮頸脫落細胞、食管刷片細胞等抹片上細胞酸性磷酸酶的方法及試劑盒。
背景技術：
：從上世紀中葉開始，巴氏抹片和染色技術被逐步推廣成為一種子宮頸癌的篩選方法。在獲得推廣的國家中可以發現，應用這種方法後大大減少了子宮頸癌的死亡率和發病率。在美國每年有超過5000萬例行抹片篩查，其中有350萬(7%)檢出有陽性/異常。然而，每年仍然有4500人死亡和13000例新的子宮頸癌病例1。研究表明，20%的新癌症病例在美國用巴氏染色從未檢出過陽性，在疾病發作前有3到5年時間巴氏染色結果為陰性。儘管巴氏染色法是最成功、最有效的癌症篩查法，但是它的缺陷導致了很高的假陰性率。儘管最近對巴氏技術進行了一定的改善，如引進液基細胞自動化塗片技術，人乳頭狀瘤病毒檢測，以及更多的如免疫細胞化學方法，但此問題仍然存在。是否有替代巴氏染色法的技術呢？在1959年至1980年，一些在醫學文獻中提到了在子宮頸癌細胞內有醋氯酸酯酶、B-葡萄糖醛酸酶、酸性磷酸酶的活性，並且用了患有宮頸癌和子宮癌婦女的陰道分泌物及冰凍切片組織化學來證明。不幸的是，此結果後來沒有任何進展，直到1997年Markovics提出一個想法，在檢測宮頸不典型增生的子宮頸抹片檢查中這些酶是否可以發揮更加重要的作用，亦即能否減少假陰性的判讀率。1998年，Markovics發表了關於宮頸脫落上皮酸性磷酸酶檢測的結果和進展，並研究出了一個新的CAP-PAP染色法。該方法能將巴氏染色結果中的異常子宮頸細胞內的酸性磷酸酶明顯著色，可作為天然的子宮頸鱗狀細胞異型增生的生物標記物。2003年，Markovic發表了1000例宮頸細胞染色的結果，測試了CAP-PAP的靈敏度為81%，特異性為97%，與傳統巴氏染色相比較顯著地提高了陽性檢出率(p<0.05)。由此得出結論是CAP染色的能增加巴氏染色的敏感性，使細胞檢驗員篩查標本時能顯著提高檢陽性/異常標本檢出率禾口減少假陰性率(Markovic0，MarkovicN，etal.Cervicalacidphosphatase:Anewbiomarkerofcervicaldysplasia.ArchOncol2003;11:243-247)然而，該操作方法在應用上有以下幾個不足之處1、酶孵育液配製過程繁雜，表現在(1)偶氮鹽要臨時用亞硝酸鈉配製，需要在含有的46ml和2.5ml醋酸的燒瓶內預溫反應3分鐘，既費時又費力。(2)、每次配製各種試劑需要加入10滴試劑，這樣在實際使用時容易發生錯誤。2、孵育時間較長，需要45分鐘。3、需巴氏染色復染，增加了操作步驟且影響到酶反應產物的觀察。4、染色全程時間過長，全程需要60分鐘以上。5、應用範圍窄，僅用於宮頸細胞。5、試劑盒材料及包裝成本較高。
發明內容本發明的目的在於提供一種顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色方法，本發明的方法改良了CAP-PAP染色法的配方和操作技術，使之能更方便和廉價地運用於液基細胞沉降法製片染色中。本發明提供的技術方案如下本發明提供的一種顯示細胞增殖活性的試劑盒，包括兩種類型，其中試劑盒I，包括(1)、試劑A-酶底物l，含固醬紫0.25-1%;(2)、試劑B-酶底物2含AS-TR磷酸酯0.5_2%;(3)、試劑C:0.050.20M醋酸緩衝液，PH5.05.5(4)、試劑D-酶固定液含檸檬酸0.5g1.0g，蒸餾水25.035.0ml，甲醇5.015.0ml，丙酮50.070.Oml，氯化鎂O.05-0.lg;(5)、磷酸鹽緩衝液:0.0050.02M，PH8.0PH8.5;(6)、Mayer蘇木素。試劑盒II，包括(1)、試劑A-酶試紙試紙含有酸性磷酸酶底物AS-TR磷酸酯和顯色劑固醬紫成分；(2)、試劑B-醋酸鹽緩衝液；含1050%PVP的0.050.20mol/L、醋酸鹽溶液，PH5.05.5;(3)、試劑C-酶固定液含檸檬酸0.51.0g，蒸餾水25.035.Oml，甲醇5.015.Oml，丙酮50.070.Oml，氯化鎂O.05-0.lg;(4)、試劑D-緩衝液;0.0050.02M，PH8.0PH8.5;(5)、Mayer蘇木素。試劑盒的製作方法I型(1)、試劑A-酶底物1:固醬紫GBC按O.25_1%重量體積比溶解於10%50%聚乙烯吡咯烷酮溶液中，暗處冰浴下進行。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶2ml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。(2)、試劑B-酶底物2:AS-TR磷酸酯按0.5_2%重量體積比溶解於純二甲基甲醯胺。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶lml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。(3)、試劑C:0.050.2MPH5.05.5醋酸緩衝液:甲液含3H20的醋酸鈉24g，蒸餾水加至200.ml;乙液冰醋酸l.2ml，蒸餾水加至200.Oml;以乙液滴定甲液至1^=5.05.5。，用6ml滴瓶分裝。(4)、試劑D-酶固定液，含檸檬酸0.5gl.Og，蒸餾水2535.Oml，甲醇515.0ml，丙酮5070.Oml，氯化鎂O.05-0.lg，以100.Og/L氫氧化鈉調整PH=5.05.5;用50ml滴瓶分裝。(5)、磷酸鹽緩衝液:經典方法配製，O.0050.02M，PH8.0PH8.5;用200ml塑料瓶分裝。(6)、Mayer蘇木素將蘇木柴0.lg放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜。用50ml滴瓶分裝。II型酶試紙(試劑A)製作固醬紫GBC按2_4%重量體積比溶解於10%50%聚乙烯吡咯烷酮中；AS-BI磷酸酯按2_4%重量體積比溶解於二甲基甲醯胺；中速定性濾紙切成所需形狀，然後用含0.3%EDTA二鈉的1%甲基纖維素浸潤溼透後晾乾；取GBC和AS-BI各25微升滴於濾紙兩端，晾乾，或放置於冷凍乾燥機中乾燥；之後真空包裝。0.050.2匪PH5.05.5醋酸緩衝液:甲液含3H20的醋酸鈉24g，蒸餾水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸餾水加至200.Oml;以乙液滴定甲液至PH二5.05.5，再按體積比加入1050%PVP。用6ml滴瓶分裝。其餘組分的配製方法與I型類似。—種顯示細胞增殖活性的方法，包括以下步驟取試劑盒I中試劑Al滴、試劑Bl滴滴入到試劑C滴瓶中即成孵育液，輕輕搖晃備用，或取試劑盒II中的試劑A試紙條一條放入到試劑B滴瓶中，放置10分鐘後輕輕搖晃備用即成孵育液。(1)、細胞抹片按沉降法製片，細胞沉降後加入固定液500微升，一分鐘後傾去液體。(2)、加入蒸餾水500微升水洗2535秒，傾去液體。(3)、將染色孵育液直接滴入載有細胞的玻片孔內，一次滴入58滴。然後將染色板放入37°C的水浴箱內，30分鐘。(4)、傾去染色液，加入500微升緩衝液，2535秒，洗2遍。(5)、加入蘇木素染液500微升，2-6分鐘後傾去染液。(6)、加入緩衝液500微升2535秒，2遍。(7)、自然風吹乾，阿拉伯樹膠封固；或快速通過95%、100%酒精脫水風乾後用中性樹膠封固。本發明試劑盒可檢測的細胞為脫落細胞，包括宮頸脫落細胞、食管刷片細胞等脫落細胞。染色結果1、HPV感染細胞、低度病變、高度病變、癌細胞呈數量不等的紅色顆粒沉著，成熟正常鱗狀細胞(中、表層細胞)陰性。2、宮頸柱狀細胞、化生細胞、部分底層細胞、組織細胞呈紅色顆粒沉著。這些細胞可作為染色成功的質控標準。3、在萎縮性反應中，多數底層細胞和化生細胞呈陰性。白色念珠菌呈鮮豔的紅色。本發明與傳統巴氏抹片法相比，具有更好的精確度，即更高的敏感性和相同的特異性。與CAP-PAP法相比，區別如下CAP-PAP法在宮頸直接抹片和間接抹片(液基)，顯示不典型增生細胞中的酸性磷酸酶供顯微鏡觀察，其用途在於1、研究這些標記的生物學意義，2、供臨床應用，對照顯示了這種方法在宮頸普查中比傳統巴氏染色有更好的精確度。而本發明在脫落細胞標本中(直接抹片和液基製片中)顯示增生活躍的細胞含有豐富的酸性磷酸酶，其用途在於1、指引顯微鏡觀察者把注意力集中在這些增生活躍的細胞上，並從中甄別"有問題"的細胞(如不典型增生的細胞)；2、供食宮頸癌篩查和食管刷片作食管癌篩查，也可作為其它細胞製片研究和幫助發現異常細胞。此外，本發明與CAP-PAP法相比，其創造性在於(1)配方和酸性磷酸酶標準染色相比在於調整了配方、HI值，使之可更清晰地顯示各種脫落細胞的酸性磷酸酶顆粒。(2)試劑型式濃縮的酶底物及試紙型式節省了偶氮過程時間，使試劑臨時配製更為簡單和方便操作。(3)試劑C:含有PVP的醋酸緩衝液避免了染色前對試劑的過濾，從而節省了時間，避免了染料顆粒非特異性沉著。(4)酶固定液(試劑D):含有可恢復酶活力的微量激動劑(氯化鎂O.05_0.1%)，使之可用於在不良條件固定的細胞得以恢復酸性磷酸酶活性，達到理想的顯示效果。(5)改進了細胞片製備方法，本發明的沉降法，與傳統抹片方法相比，減少了細胞層厚度，可改進染色效果和讀片效果。本項發明和美國CAP-PAP的比較見表1表1本項發明和美國CAP-PAP的比較tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8圖1為本發明實施例1染色結果圖之一，示CAP陽性顆粒大小分布不等，靠近核膜(40X)。圖2為本發明實施例1染色結果圖之二，示CAP陽性顆粒沿核膜排列(40X)。圖3為本發明實施例1染色結果圖之三，示一群柱狀細胞，陽性顆粒大小和分布均勻(10X)。圖4為本發明實施例1染色結果圖之四，示高度病變細胞，顯示粗大顆粒，且分布不均勻(100X)。圖5為本發明實施例1染色結果圖之五，示組織細胞，顯示鮮豔均勻分布的紅色顆粒(40X)。具體實施例方式—、試劑檸檬酸醋酸醋酸鈉氯化鎂甲醇二甲基甲醯胺AR聚乙烯吡咯烷酮(PVP)4K偶氮固醬紫(fastgarnetGBCsalt)美國sigma萘酚AS-TR磷酸酯(n即htholeAS-TRphosphate)德國產磷酸緩衝液0.01M2，購買或自配。邁爾(Mayer)蘇木素液二、設備與器械2.1設備真空包裝機(包裝茶葉機即可)、實驗室冷凍乾燥機FD-1C(陝西太康科教儀器有限公司)、乾燥箱、水浴箱、普通冰箱、磁力攪拌器、電子天平(毫克級，精確到小數點4位)、定量移液瓶。2.2器械移液槍(10微升-100微升)、移液槍(10-1000微升)。試劑級塑料滴瓶2ml、5ml、15ml、50ml。試劑瓶50ml、100ml、300ml。搪瓷盤等。三、試劑配製細胞增殖活性耙向細胞染色試劑盒II型3.l稱量GBC固醬紫、AS-TR磷酸酯。應在暗光下進行，採用電子天平，毫克級。根8據批量確定稱量。注意稱量室溼度應小於70%。3.2溶液配製3.2.150%PVP，用磁力攪拌機攪拌，充分溶解後靜置至無氣泡為止。3.2.20.lmol/L醋酸緩衝液(試劑B):甲液醋酸鈉(含3H20)2.72g，蒸餾水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸餾水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至1^=5.2。再按體積比加入50%PVP。分裝於6ml滴瓶。3.2.3酶固定液(試劑C)，檸檬酸O.63g，蒸餾水30.0ml，甲醇IO.Oml，丙酮60.Oml，酶激活劑適量(氯化鎂0.07g)，以100.0g/L氫氧化鈉調整PH=5.4。分裝於50ml滴瓶。3.2.3邁爾蘇木素液將蘇木素O.lg放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應用。分裝於50ml滴瓶。3.2.4磷酸鹽緩衝液0.01M2，按經典配方自配。分裝於200ml塑料瓶。3.3酶試紙(試劑A)製作(暗室進行)3.3.1固醬紫GBC按O.5%重量體積比溶解於50%聚乙烯吡咯烷酮中(見3.2.1)，暗處冰浴下進行。AS-TR磷酸酯按2%重量體積比溶解於純二甲基甲醯胺。3.3.2中速定性濾紙60X60，濾紙用不鏽鋼裁刀切成1.5釐米X5釐米，然後用含0.3%EDTA二鈉的1%甲基纖維素浸潤溼透後晾乾。3.3.3在紅光下取GBC和AS-BI各25微升滴於濾紙兩端。3.3.4將濾紙中央部用夾子夾緊放鐵線晾乾，或放置於冷凍乾燥機中乾燥。3.3.5真空包裝鍍鋁紙袋3釐米X6釐米，真空包裝機包裝，每袋一條。3.3.6保存2-8。C試劑盒II型(10test，20抹片/test)組成:1、試劑A:酶試紙，5條/包，1包2、試劑B:6ml醋酸鹽緩衝液/滴瓶，6瓶3、試劑C:50ml酶固定液/滴瓶，1瓶4、試劑D:磷酸鹽緩衝液200ml(K18.2)，1瓶5、Mayer蘇木素50ml/滴瓶，1瓶II型靶向型染色孵育液配製(染色前準備)取試劑A試紙條一條放入入到試劑B滴瓶中，放置10分鐘後輕輕搖晃備用即成孵育液。該液體為一次性使用，配置後應在6小時內用完。剩餘液體應廢棄，不可留用。細胞增殖活性耙向細胞染色試劑盒(I型)一、試劑盒(5test，20抹片/test)組成:1、試劑A:酶底物1，2ml/滴瓶，共1瓶2、試劑B:酶底物21ml/滴瓶共1瓶3、試劑C:6ml醋酸鹽緩衝液/滴瓶，5瓶4、試劑D:酶固定液50ml/滴瓶，l瓶5、磷酸鹽緩衝液200ml(K18.2)，1瓶6、Mayer蘇木素50ml/滴瓶，1瓶其中試劑A(酶底物1):固醬紫GBC按0.5X重量體積比溶解於50X聚乙烯吡咯烷酮中，暗處冰浴下進行。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶2ml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。試劑B(酶底物2):AS-TR磷酸酯按1.0%重量體積比溶解於純二甲基甲醯胺。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶lml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。試劑C、試劑D、磷酸緩衝液及Mayer蘇木素配製方法與II型同，不再詳述。I型靶向型染色孵育液配製(染色前準備)取試劑A1滴、試劑B1滴滴入到試劑C滴瓶中即成孵育液，輕輕搖晃備用。該液體為一次性使用，配置後應在6小時內用完。剩餘液體應廢棄，不可留用。試劑盒I或試劑盒II在使用時配備說明書及《靶向染色液讀片指導》及配圖，以指導使用者使用。實施例1:子宮頸癌篩查試驗設計1、實驗組宮頸脫落細胞塗片材料來自每日門診婦科病例和體檢部零散婦科體檢人群。採用福建泰普生物科學有限公司保存液和取樣刷按標準在宮頸移行區採樣，並按本發明方法進行染色製片(後面將詳細介紹)。2、對照組用同一份標本製備另外一張塗片(即一份標本製備同時兩張細胞塗片，製片時儘可能把細胞均分)，採用常規巴氏染色。3、讀片及登記採用雙盲法讀片，實驗組由課題組醫師觀察，診斷採用TBS術語，所不同的是，細胞染色陽性並有細胞核異常(包括提示HPV)的病例冠以"0八+/異常細胞"，細胞染色陰性且無細胞核異常的登記為陰性；對照組由專職從事宮頸細胞篩查6年資歷的細胞助理醫師觀察。兩組讀片後對照結果，凡診斷結果不一的病例重新複查塗片。全部病例經3個以上醫師達成一致結果為最後結果。以最後結果為"金標準"，以兩組第一次診斷結果為參數，進行各項統計學處理。4、讀片時間比較記錄兩組讀片總時間，計算平均時間。實驗組的染色方法具體如下取試劑盒I中A液1滴、B液1滴入C液中，輕輕晃動混勻成孵育液備用；或取試劑盒II中試劑A試紙條一條放入入到試劑B滴瓶中，放置10分鐘後輕輕搖晃備用即成孵育液。染色過程為(1)、細胞抹片按沉降法製片，細胞沉降10分鐘後加入試劑盒配備的固定液500微升，一分鐘後傾去液體；(2)、加入蒸餾水500微升水洗30秒，傾去液體；(3)、將染色孵育液直接滴入載有細胞的玻片孔內，一次滴入6滴，然後將染色板放入37°C的水浴箱內，35分鐘；(4)、傾去染色液，加入500微升緩衝液，洗2遍；(5)、加入蘇木素染液500微升，4分鐘後傾去染液；(6)、加入緩衝液500微升30秒，兩次；(7)、自然風吹乾，阿拉伯樹膠封固；或快速通過95%、100%酒精脫水風乾後用中性樹膠封固。前述的沉降法制宮頸細胞塗片過程為已採樣的細胞保存液瓶，振蕩30秒，分別加入4毫升梯度離心液。取標本瓶中的液體8毫升加入上述離心管中，先以1080轉/分，離心2分鐘。用吸管吸棄上面8毫升液體，再以2000轉/分，離心10分鐘，取出離心管迅速倒掉上清液。離心管中加入500-800微升緩衝液在振蕩器上振蕩25秒，使離心管底部聚集的細胞加復懸浮狀態。吸取離心管中混勻的細胞懸液300微升移至固定好的染色槽中，槽下為塗有細胞貼附劑的載玻片，靜止自然沉澱IO分鐘，傾去玻片上多餘液體，即製成宮頸細胞薄層塗片。結果166例宮頸塗片試驗與對照組篩查結果見表。顯微鏡下，紅色顆粒狀陽性細胞一目了然。在實驗組37例陽性標本中，多數在大的鱗狀細胞(中表層細胞)或外底層細胞的胞漿裡見到數量不等的陽性顆粒。這些顆粒的大小和分布沒有明顯的規律，它們或緊密靠近胞核(圖1)，或沿著胞膜排列(圖2);紅色顆粒大小自0.1-1微米不等；陽性顆粒的密度稀疏不定，有時很微弱，需要仔細辨別；有時反應很強，可掩蓋整個細胞。對於良性的柱狀細胞和化生細胞，陽性顆粒大小和分布比較均勻一致(圖3);而在高度病變的小細胞，陽性顆粒的分布和大小表現得不一致(圖4)。組織細胞通常表現鮮紅色均勻一致的強陽性反應，很容易和其它細胞區別開來(圖5)。實驗組發現一例組織細胞數量極多，細胞體積很大，相應地在對照組的巴氏染色中誤認為退變的鱗狀細胞。如表2所示，實驗組陽性檢出率為22.29%，對照組為10.24%，實驗組顯著高於對照組。經3人複查兩組，最後統一診斷意見，明確166例中陽性檢出病例共34例，陽性檢出率為20.48%。實驗組除一例未檢出陽性外，其餘均符合複查的陽性結果。而巴氏組共有9例假陰性，主要類型細胞是HPV感染細胞和不典型細胞。它們或是因為數量少或是因在巴氏染色中胞漿染色過深、挖空細胞表現不明顯而漏檢。實驗組7個"不確定"的病例，在對應巴氏組中亦未檢出陽性結果，這些病例暫時定為炎性修復性細胞。這樣，統計結果(見表3、表4)顯示本發明敏感度(97.06%)顯著高於傳統巴氏染色(47.06%)，而特異性(96.97%)和巴氏染色(99.24%)相近，巴氏染色假陰性率高達12.08%(18/149)。166片總讀片時間實驗組323分鐘(1.95分/片)，對照組為845分鐘(5.09分/片)。篩查每張塗片的時間實驗組比對照組減少3分鐘。表2:166例實驗組與對照組的篩查結果tableseeoriginaldocumentpage12表3166實驗組檢出結果與複查後診斷結果對照tableseeoriginaldocumentpage12敏感度為97.06%，特異性96.97%;陽性預測值89.19%;陰性預測值99.22%。表4166巴氏組檢出結果與複查後診斷結果對照tableseeoriginaldocumentpage12令敏感度為47.06%，特異性99.24%;陽性預測值94.12%;陰性預測值87.92%。儘管截至目前為止，宮頸脫落細胞的檢查仍舊是依賴細胞的形態學的變化，然而，要在上萬個細胞中搜尋為數不多，甚至只有個位數的細胞確非易事。本發明染色液的理念是提供一種導向，即避開大量無關的細胞，節省時間和精力，將細胞醫師的注意力導向到增殖活躍的細胞群體上，然後再仔細觀察它們的細胞形態表現。本結果顯示，靶向染色液能標記子宮頸成熟鱗狀細胞中的異常細胞，由於正常成熟鱗狀細胞呈陰性反應，因此呈紅色顆粒狀的陽性細胞在低倍鏡下即可容易地觀察到，即便是一個細胞或弱陽性反應亦可看到。在常規巴氏染色中，個別存在的不典型鱗狀細胞很容易從細胞學者的眼中逃逸，而本發明靶向染色液能清楚地顯示那些少量散在甚至是個別存在的不典型鱗狀細胞。此外，靶向染色有利於HPV感染細胞的診斷，如本發明所示，實驗組提示HPV檢出例數顯著高於對照組(見表2)，經複查後在常規巴氏染色組均找到散在的挖空細胞，我們分析，巴氏染色可因胞漿的過染影響挖空細胞的觀察。雖然良性的柱狀細胞和化生細胞可以陽性，但它們的顆粒大小和分布一致，且形態學容易識別。這些細胞的存在反而為判斷標本的滿意度及試劑本身的質量控制提供了方便。本發明結果顯示，本發明靶向染色法能減少篩選時間。這是由於在適應了新的染色後，鮮豔的紅色顆粒總是在第一時間吸引了鏡檢者的注意，並且陽性的細胞數量總是遠少於總的細胞量，由於我們不必要關注的細胞少了，就必然減少了篩查所需時間。總之，靶向染色增加了檢測異常細胞的靈敏度，與TBS診斷標準相結合又可保持和巴氏染色方法相近的特異性。實施例2回顧性統計資料從廈門市第二醫院病理科宮頸細胞學篩查資料電腦系統中調取2009年9月1日-11.26日採用本發明染色液後用TBS診斷術語的診斷結果，並與2008年同時期採用巴氏染色的診斷統計結果進行比較，其結果(見表5)顯示，耙向染色對非典型鱗狀細胞、非典型腺細胞、上皮內低度病變、上皮內高度病變以及提示HPV檢出率(26.8%)顯著高於傳統的巴氏染色(11.81%)。表52009年耙向染色與2008年巴氏染色同比檢出率tableseeoriginaldocumentpage13實施例3、食管刷取脫落細胞對廈門市第二醫院內窺鏡室送檢的食管刷片細胞抹片39例進行性靶向染色(染色方法同實施例l)，並與常規巴氏染色進行比較，結果(表6.)顯示實驗組陽性檢出率高於巴氏組。表639例食管刷片靶向染色和傳統巴氏染色結果比較tableseeoriginaldocumentpage14實施例4溶液配製3.2.110%PVP，用磁力攪拌機攪拌，充分溶解後靜置至無氣泡為止。3.2.20.05mol/L醋酸緩衝液(試劑B):甲液醋酸鈉(含3H20)2.OOg，蒸餾水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸餾水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至1^=5.0。再按體積比加入10%PVP。分裝於6ml滴瓶。3.2.3酶固定液(試劑C)，檸檬酸0.50g，蒸餾水25.Oml，甲醇5.Oml，丙酮50.Oml，酶激活劑適量(氯化鎂0.05g)，以100.Og/L氫氧化鈉調整ra=5.0。分裝於50ml滴瓶。3.2.3邁爾蘇木素液將蘇木素O.lg放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應用。分裝於50ml滴瓶。3.2.4磷酸鹽緩衝液0.005MO，按經典配方自配。分裝於200ml塑料瓶。3.3酶試紙(試劑A)製作(暗室進行)3.3.1固醬紫GBC按0.25X重量體積比溶解於10%聚乙烯吡咯烷酮中(見3.2.l)，暗處冰浴下進行。AS-TR磷酸酯按3X重量體積比溶解於純二甲基甲醯胺。3.3.2中速定性濾紙60X60，濾紙用不鏽鋼裁刀切成1.5釐米X5釐米，然後用含0.3%EDTA二鈉的1%甲基纖維素浸潤溼透後晾乾。3.3.3在紅光下取GBC和AS-BI各25微升滴於濾紙兩端。3.3.4將濾紙中央部用夾子夾緊放鐵線晾乾，或放置於冷凍乾燥機中乾燥。3.3.5真空包裝鍍鋁紙袋3釐米X6釐米，真空包裝機包裝，每袋一條。3.3.6保存2-8。C試劑盒II型(10test，20抹片/test)組成:1、試劑A:酶試紙，5條/包，1包2、試劑B:6ml醋酸鹽緩衝液/滴瓶，6瓶3、試劑C:50ml酶固定液/滴瓶，1瓶4、試劑D:磷酸鹽緩衝液200ml(K18.2)，1瓶5、Mayer蘇木素50ml/滴瓶，1瓶II型靶向型染色孵育液配製(染色前準備)取試劑A試紙條一條放入入到試劑B滴瓶中，放置10分鐘後輕輕搖晃備用即成孵育液。該液體為一次性使用，配置後應在6小時內用完。剩餘液體應廢棄，不可留用。細胞增殖活性耙向染色試劑盒(I型)一、試劑盒(5test，20抹片/test)組成:1、試劑A:酶底物1，2ml/滴瓶，共1瓶2、試劑B:酶底物21ml/滴瓶共1瓶3、試劑C:6ml醋酸鹽緩衝液/滴瓶，5瓶4、試劑D:酶固定液50ml/滴瓶，l瓶5、磷酸鹽緩衝液200ml(K18.2)，1瓶6、Mayer蘇木素50ml/滴瓶，1瓶試劑A(成分及配製方法)固醬紫GBC按0.25X重量體積比溶解於10%聚乙烯吡咯烷酮中，暗處冰浴下進行。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶2ml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。試劑B(成分及配製方法)AS-TR磷酸酯按0.5%重量體積比溶解於二甲基甲醯胺。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶lml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。試劑C、試劑D、磷酸緩衝液及Mayer蘇木素配製方法與II型同，不再詳述。I型靶向型染色孵育液配製(染色前準備)取試劑Al滴、試劑Bl滴滴入到試劑C滴瓶中即成孵育液，輕輕搖晃備用。該液體為一次性使用，配置後應在6小時內用完。剩餘液體應廢棄，不可留用。本實施例試劑盒I和II的使用方法同前述相同。實施例5溶液配製3.2.130%PVP，用磁力攪拌機攪拌，充分溶解後靜置至無氣泡為止。3.2.20.2mol/L醋酸緩衝液(試劑B):甲液醋酸鈉(含3H20)4.OOg，蒸餾水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸餾水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至1^=5.5。再按體積比加入25%PVP。分裝於6ml滴瓶。3.2.3酶固定液(試劑C)，擰檬酸l.0g，蒸餾水35.Oml，甲醇15.0ml，丙酮70.Oml，酶激活劑適量(氯化鎂0.10g)，以100.Og/L氫氧化鈉調整ra=5.5。分裝於50ml滴瓶。3.2.3邁爾蘇木素液將蘇木素O.lg放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應用。分裝於50ml滴瓶。3.2.4磷酸鹽緩衝液0.02M5，按經典配方自配。分裝於200ml塑料瓶。3.3.2中速定性濾紙60X60，濾紙用不鏽鋼裁刀切成1.5釐米X5釐米，然後用含0.3%EDTA二鈉的1%甲基纖維素浸潤溼透後晾乾。3.3.3在紅光下取GBC和AS-BI各25微升滴於濾紙兩端。3.3.4將濾紙中央部用夾子夾緊放鐵線晾乾，或放置於冷凍乾燥機中乾燥。3.3.5真空包裝鍍鋁紙袋3釐米X6釐米，真空包裝機包裝，每袋一條。3.3.6保存2-8°C試劑盒II型(lOtest，20抹片/test)組成:1、試劑A:酶試紙，5條/包，1包2、試劑B:6ml醋酸鹽緩衝液/滴瓶，6瓶3、試劑C:50ml酶固定液/滴瓶，1瓶4、試劑D:磷酸鹽緩衝液200ml(K18.2)，1瓶5、Mayer蘇木素50ml/滴瓶，1瓶II型靶向型染色孵育液配製(染色前準備)取試劑A試紙條一條放入入到試劑B滴瓶中，放置IO分鐘後輕輕搖晃備用即成孵育液。該液體為一次性使用，配置後應在6小時內用完。剩餘液體應廢棄，不可留用。細胞增殖活性耙向染色試劑盒(I型)一、試劑盒(5test，20抹片/test)組成:1、試劑A:酶底物1，2ml/滴瓶，共1瓶2、試劑B:酶底物21ml/滴瓶共1瓶3、試劑C:6ml醋酸鹽緩衝液/滴瓶，5瓶4、試劑D:酶固定液50ml/滴瓶，l瓶5、磷酸鹽緩衝液200ml(K18.2)，1瓶6、Mayer蘇木素50ml/滴瓶，1瓶試劑A(成分及配製方法)固醬紫GBC按1.0%重量體積比溶解於30%聚乙烯吡咯烷酮中，暗處冰浴下進行。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶2ml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。試劑B(成分及配製方法)AS-TR磷酸酯按2.0%重量體積比溶解於二甲基甲醯胺。用2ml黑色塑料滴瓶分裝，每瓶lml。擰緊瓶蓋，鍍鋁紙真空包裝。試劑C、試劑D、磷酸緩衝液及Mayer蘇木素配製方法與II型同，不再詳述。I型靶向型染色孵育液配製(染色前準備)取試劑Al滴、試劑Bl滴滴入到試劑C滴瓶中即成孵育液，輕輕搖晃備用。該液體為一次性使用，配置後應在6小時內用完。剩餘液體應廢棄，不可留用。本實施例試劑盒I和II的使用方法同前述相同。上述僅為本發明的具體實施例，但本發明的設計構思並不局限於此，凡利用此構思對本發明進行非實質性的改動，均應屬於侵犯本發明保護範圍的行為。權利要求一種顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒I，包括(1)、試劑A-酶底物1含固醬紫0.25-1％；(2)、試劑B-酶底物2含AS-TR磷酸酯0.5-2％；(3)、試劑C0.05～0.2M醋酸緩衝液，PH5.0～5.5；(4)、試劑D-酶固定液含檸檬酸0.5g～1.0g，蒸餾水25～35.0ml，甲醇5～15.0ml，丙酮50～70.0ml，氯化鎂0.05-0.10g；(5)、磷酸鹽緩衝液0.005～0.02M，PH8.0～PH8.5；(6)、Mayer蘇木素。2.如權利要求1所述的顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒I，其配製方法為(1)、試劑A酶底物1:固醬紫按O.25-1%重量體積比溶解於10%50%聚乙烯吡咯烷酮溶液中，暗處冰浴下進行；(2)、試劑B酶底物2:AS-TR磷酸酯按0.52%重量體積比溶解於純二甲基甲醯胺；(3)、試劑C:0.050.2MPH5.05.5醋酸緩衝液甲液含3H20的醋酸鈉24g，蒸餾水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸餾水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至ffl=5.05.5;(4)、試劑D-酶固定液，擰檬酸O.5g1.0g，蒸餾水2535.Oml，甲醇515.Oml，丙酮5070.Oml，氯化鎂0.05-0.10g，以100.Og/L氫氧化鈉調整PH=5.05.5;(5)、磷酸鹽緩衝液按經典方法配製；(6)、Mayer蘇木素將蘇木柴O.lg放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜。3.如權利要求1所述的顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒I，其使用方法為染色前配製酶孵育液取試劑Al滴、試劑Bl滴，滴入到試劑C滴瓶中即成孵育液，輕輕搖晃備用；染色過程(1)、細胞抹片按沉降法製片，細胞沉降10分鐘後加入試劑D固定液500微升，一分鐘後傾去液體；(2)、加入蒸餾水500微升水洗2535秒，傾去液體；(3)、將試劑染色孵育液直接滴入載有細胞的玻片孔內，一次滴入58滴；然後將染色板放入37°C的水浴箱內，3040分鐘；(4)、傾去染色液，加入500微升緩衝液，洗2遍；(5)、加入蘇木素染液500微升，2535秒後傾去染液；(6)、加入緩衝液500微升2-6分鐘，傾去液體，2遍；(7)、自然風吹乾，阿拉伯樹膠封固；或快速通過95%、100%酒精脫水風乾後用中性樹膠封固。4.如權利要求3所述的靶向細胞染色試劑盒I的使用方法，其特徵在於所述細胞為宮頸脫落細胞、食管刷片細胞。5.—種顯示上皮細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒II，包括(1)、試劑A-酶試紙試紙含有酸性磷酸酶底物AS-TR磷酸酯和顯色劑固醬紫成分；(2)、試劑B-醋酸鹽緩衝液；0.050.2mol/L醋酸鹽溶液，含10%50%PVP;(3)、試劑C-酶固定液含檸檬酸0.51.0g，蒸餾水25.035.0ml，甲醇5.015.0ml，丙酮50.070.Oml，氯化鎂O.05-0.lg;(4)、試劑D-緩衝液；磷酸鹽緩衝液，0.0050.02M，PH8.0PH8.5;(5)、Mayer蘇木素。6.如權利要求5所述的顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒II，其配製方法為(1)、試劑A-酶試紙；固醬紫GBC按2-4%重量體積比溶解於10%50%聚乙烯吡咯烷酮溶液中；AS-TR磷酸酯按2_4%重量體積比溶解於純二甲基甲醯胺；中速定性濾紙切成所需形狀，然後用含0.3%EDTA二鈉的1%甲基纖維素浸潤溼透後晾乾；取GBC和AS-BI各25微升滴於濾紙兩端，晾乾，或放置於冷凍乾燥機中乾燥；之後真空包裝；(2)、試劑B-醋酸鹽緩衝液醋酸鈉(含3H20)24g，蒸餾水加至200.ml成甲液；冰醋酸1.2ml，蒸餾水加至200.0ml成乙液；以乙液滴定甲液至ffl=5.05.5;再按體積比加入1050%PVP。(3)、試劑C-酶固定液；檸檬酸O.51.0g，蒸餾水25.035.0ml，甲醇5.015.0ml，丙酮50.070.0ml，氯化鎂0.05-0.lg，以100.0g/L氫氧化鈉調整PH=5.4;(4)、試劑D-緩衝液；按經典方法配製成0.0050.02M，PH8.0PH8.5磷酸鹽緩衝液；(5)、Mayer蘇木素將蘇木柴O.lg放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜。7.如權利要求5所述的一種顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒II，其使用方法為染色前配製酶孵育液(試劑C):取試劑A試紙條一條放入到試劑B滴瓶中，放置10分鐘後輕輕搖晃備用即成孵育液；(1)、細胞抹片按沉降法製片，細胞沉降10分鐘後加入試劑D液500微升，一分鐘後傾去液體；(2)、加入蒸餾水500微升水洗2535秒，傾去液體；(3)、將試劑C染色孵育液直接滴入載有細胞的玻片孔內，一次滴入58滴，然後將染色板放入3540°C的水浴箱內，3040分鐘；(4)、傾去染色液，加入500微升緩衝液，洗2遍；(5)、加入蘇木素染液500微升，2-6分鐘後傾去染液；(6)、加入緩衝液500微升2535秒，傾去液體，2遍;(7)、自然風吹乾，阿拉伯樹膠封固；或快速通過95%、100%酒精脫水風乾後用中性樹膠封固。8.如權利要求7所述的靶向細胞染色試劑盒I1的使用方法，其特徵在於所述細胞為宮頸脫落細胞、食管刷片細胞。9.如權利要求1或5所述的靶向細胞染色試劑盒，其特徵在於還包括說明書及《耙向染色液讀片指導》及配圖。全文摘要本發明公開了一種顯示細胞增殖活性的靶向細胞染色試劑盒及其使用方法。本發明試劑盒分為I型和II型，分別包括酶底物、試紙、酶固定液、磷酸鹽緩衝液、Mayer蘇木素等。染色方法是製片、固定、染色等。本發明方法可顯示脫落細胞如宮頸脫落細胞、食管刷片細胞等抹片上細胞內酸性磷酸酶，並以此靶向尋找異常增生細胞。該方法與傳統巴氏抹片法相比，檢測癌和癌前病變的靈敏度更高，特異性相近，因而本發明可作為宮頸癌、食管癌、肺癌等惡性腫瘤的細胞學篩查之用。文檔編號C12Q1/42GK101781675SQ20101030081公開日2010年7月21日申請日期2010年1月27日優先權日2010年1月27日發明者謝佐福申請人:福建泰普生物科學有限公司