用於改善造血功能的茯苓提取物,含它們的藥物組合物及製備方法
2023-05-30 16:46:31 2
專利名稱：用於改善造血功能的茯苓提取物,含它們的藥物組合物及製備方法
技術領域：
本發明涉及用於改善造血功能的茯苓提取物，含它們的藥物組合物及製備方法。
茯苓作為藥物使用已有很長的歷史，藥用茯苓是多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos[Schw]Wolf)的乾燥菌核中的白茯苓部分。中國醫藥著作中記載茯苓具有滲溼利水、安心寧神、易脾和胃等功效。
現已從白茯苓中分離出的一組羊毛甾烷三萜烯類化合物，它們有共同的母核和不同的取代基團。從茯苓提取物中已分出茯苓酸、豬苓酸-C、3-β-羥基羊毛甾烷-7，9(11)，24-三烯-21-羧酸、3-酮-6-乙氧基-7，11-去氫茯苓酸、乙醯茯苓酸、去氫-茯苓酸、以及3-酮-6，16-α-二羥基羊毛甾烷-7，9(11)，24(31)-三烯-21-羧酸等多種成分，見李靜，黎紅，許津中國藥學雜誌1997，32(7)401；許先棟，許津，張致平中國藥物化學雜誌1994，4(1)23；Takaaki，Tai et al.Phytochemistry1992，31(7)2548；兼松明子，名取信策Yakugaku Zasshi 1970，90(4)475；Valisollalao，J.et al Bull Soc Chim Fr。1980，II 473；Cort LA，et al J Chem Soc 1954，3713；Takaaki Tai et alPhytochemistry 1993，32(5)1239；Takaaki Tai et al Phytochemistry1991，30(8)2796。
本發明人現已發現茯苓提取物可以誘生多種集落刺激因子(CSFs)，CSFs是一組細胞調節因子，其功能是調控骨髓幹細胞的增殖與分化，因此，茯苓提取物具有促進和調節幹細胞增生和分化的能力，從而改善機體的造血功能。
本發明目的是尋找並開發茯苓的新的醫藥用途。
本發明第一方面涉及用於改善造血功能的茯苓提取物。
本發明再一方面涉及用於改善造血功能的藥物組合物，其包括茯苓提取物及藥用載體或賦形劑。
本發明還涉及茯苓提取物在製備用於改善造血功能的藥物中用途。
本發明進一步涉及製備茯苓提取物的方法，其包括i)將茯苓粉碎，然後用選自醇、酮、酯或滷代烷的有機溶劑或有機溶劑與水的混合物提取，ii)將i)提取物減壓除去溶劑，所得殘餘物用酸酸化到pH2-3，得茯苓提取物，iii)如需要，得ii)中茯苓提取物溶於醇，過濾除去不溶物，減壓除去醇，得純化的茯苓的提取物，如需要或必要，將所得純化的茯苓提取物懸浮於水中，用鹼調節茯苓提取物的水懸浮液pH至10-11，過濾除去不溶物，濾液用酸調節至3以下，得進一步純化的茯苓提取物；或將ii)中茯苓提取物懸浮於水中，用鹼調節該水懸浮液pH至10以上，過濾，往濾液中加入選自酯，滷化烷，芳香烴或醚的有機溶劑，用酸酸化有機相pH至3以下，減壓蒸乾有機相，得進一步純化的茯苓提取物。
本發明還涉及改善造血功能的方法，其包括將有效量的本發明茯苓提取物給予需改善造血功能的患者。
根據本發明，本發明中所用的茯苓是白茯苓。
根據本發明，本發明所用術語「醇」舉例講可是甲醇，乙醇或丙酮等。
根據本發明，本發明所用術語「酮」舉例講可是丙酮或丁酮等。
根據本發明，本發明所用術語「酯」舉例講可以是乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯或乙酯戊酯等。
根據本發明，本發明所用術語「滷代烷」舉例講可以是二氯甲烷或三氯甲烷等。
根據本發明，本發明所用術語「芳香烴」舉例講可以是苯或甲苯等。
根據本發明，本發明所用術語「醚」舉例講可以是乙醚等。
根據本發明，本發明所用術語「鹼」舉例講可以是鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物或碳酸鹽或的碳酸氫鹽如NaOH，KOH，K2CO3或Na2CO3等。
根據本發明，本發明所用術語「酸」舉例講可以是無機酸或有機酸如鹽酸，硫酸，磷酸，乙酸等。
根據本發明，本發明所用術語「患者」舉例講可以是哺乳動物，尤其是人。
根據本發明，本發明茯苓提取物易溶於95％乙醇。本發明茯苓提取物的乙醇溶液(100μg/ml)在200-700mm進行紫外全波長掃描，於241-243nm和235-236處顯示出特異吸收峰(見
圖1)，在252mm處有肩。在1％茯苓提取物的乙醇溶液，茯苓提取物的消光值[A](λ242nm)＝149。
更具體講，本發明的茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物，優選至少85重量％，更優選至少95重量％。
本發明因此還涉及含有作為活性成份的有效劑量的茯苓提取物以及常規藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發明藥物組合物含有0.1-90重量％的茯苓提取物。藥物組合物可根據本領域已知的方法製備。用於此目的時，如果需要，可將茯苓提取物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，製成可作為人用的適當的施用形式或劑量形式。
本發明的茯苓提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質體、透皮劑、口含片、栓劑、凍乾粉針劑等。可以是普通製劑、緩釋製劑、控釋製劑及各種微粒給藥系統。為了將單位給藥劑型製成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如澱粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、矽酸鋁等；溼潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、澱粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如乾燥澱粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻澱粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化矽、玉米澱粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步製成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元製成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或麵糊等；崩解劑，如瓊脂粉、乾燥澱粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元製成栓劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元製成膠囊，將有效成分茯苓提取物與上述的各種載體混合，並將由此得到的混合物置於硬的明明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分茯苓提取物製成微囊劑，混懸於水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或製成注射劑應用。為了將給藥單元製成注射用製劑，如溶液劑、乳劑、凍乾粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了製備等滲注射液，可以向注射用製劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規的助溶劑、緩衝劑、pH調節劑等。
此外，如需要，也可以向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發明茯苓提取物的給藥劑量取決於許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
下面的實施例及生物活性實驗用來進一步說明本發明，但這並不意味著對本發明的任何限制。
實施例1茯苓提取物的製備1kg茯苓粉，用10L 80％乙醇分三次提取，每次均在室溫下攪拌兩小時，抽濾，合併三次濾液，減壓蒸去乙醇，水溶液酸化到pH3以下，茯苓提取品即沉澱出來，過濾，收集沉澱。得5g茯苓粗提品，其中羊毛甾烷三萜烯類化合物含量80％。
將上面所得茯苓粗提品溶於95％乙醇中，過濾，除去不溶物，減壓蒸去乙醇，得到第一步純化的茯苓提取物。將第一次純化的茯苓提取物按100mg/ml的量溶於1M的NaOH中，用水稀釋10倍，過濾，除去不溶物，用6N HCl調節pH到3以下，茯苓提取物沉澱出來，抽濾，濾餅用水洗至中性。在真空乾燥箱中抽乾，研成粉末，得4g茯苓提取品，其中羊毛甾烷三萜烯類化合物含量＞85％。
生物活性本發明茯苓提取物對小鼠受γ射線照射所導致的損傷的恢復昆明小鼠，雌性，體重22-26克。茯苓提取物(以下簡稱F)以125mg/kg劑量給予小鼠，用蒸餾水配製。
實驗動物隨機分成三組正常對照組，單純照射組，上述茯苓提取物劑量組。每組10隻動物，實驗重複一次。
實驗動物Co[60]γ線全身一次性照射，劑量率為1.86-1.84倫/分，總劑量7.5Gy。照射後立即灌胃給藥，每天一次，連續六天。對照組給生理鹽水。各組動物於照射後第七天稱體重，測外周血細胞數，稱脾重，計算脾臟表面宏觀脾結節數，取股骨測定骨髓DNA含量。結果見表1。表1茯苓提取物對小鼠受γ射線照射所導致的損傷的恢復組別 白細胞 血小板 脾臟係數 CFU-S 骨髓DNA單純照射組1 1 11 1F 125mg/kg1.8 1.4 1.5 12.4 1.6註上表給藥組的數值均為單純照射組的倍數。CFU-S脾結節數茯苓提取物對狗注射環磷醯胺(CY)所導致的損傷的保護作用實驗使用北京地區家狗，雄性，年齡1-2歲，體重12-16公斤。茯苓提取物按小鼠的最好有效劑量，用體表面積換算成狗的給藥劑量，劑量為19.86mg/kg。實驗分組單純環磷醯胺組(簡稱CY)，上述茯苓提取物劑量組。8隻狗，適應性飼養2周左右，按體重隨機分組，每組四隻。給藥前稱體重，測外周血紅、白細胞，血小板，網織紅細胞兩次。狗靜脈注射環磷醯胺(5mg/kg)，每日一次，連續5天。茯苓提取物在第一次注射環磷醯胺的同時口服給藥，連續7天，每天一次。實驗動物觀察期為21天。實驗結果臨床症狀及動物存活情況給藥後單純環磷醯胺組4隻動物於7-13天均出現一次性食慾變差，而給茯苓提取物劑量組4隻動物沒有出現食慾變差現象。單純環磷醯胺組給藥後有2隻動物於5-11天體溫升高，給予茯苓提取物的動物均未出現體溫升高現象。因此臨床症狀表明茯苓提取物能減輕動物化療引起的臨床反應。
血液成分的變化單純環磷醯胺組給藥後外周血白細胞總數呈進行性減少，第11天降至最低值。此後緩慢上升，至藥後21天接近正常的70％。以19.86mg/kg劑量給予的茯苓提取物對粒細胞有非常顯著的保護作用，同時對於淋巴細胞和血小板，茯苓提取物也有保護作用。對於網織細胞，給藥組明顯高於對照組，茯苓提取物在藥後第5、7天都呈上升趨勢。結果見表2。表2茯苓提取物對狗注射環磷醯胺所導致血細胞的損傷的保護作用組別 粒細胞 淋巴細胞 血小板 網織細胞單純給CY組-61.6 -77.8-50.3 -96.2F(19.86mg/kg)-5.5 -30.0-30.0+25.0注表中數字為細胞受抑制後各種細胞下降或上升的百分數茯苓提取物對注射環磷醯胺的狗的骨髓細胞的影響實驗第9天取髂骨骨髓培養，塗片，第21天活殺動物取胸骨骨髓進行CFU-GM，CFU-E，BFU-E，CFU-MEG細胞培養，茯苓提取物對於粒單細胞結節數和巨核細胞結節數有明顯的保護作用，能提高CFU-GM和CFU-MEG的產率。結果見表3。表3茯苓提取物對注射環磷醯胺的狗的骨髓細胞的影響組別 CFU-GMCFU-MEGCFU-EBFU-E9天 21天21天 21天 21天單純給CY組1 1 1 11F(19.86mg/kg) 7.40 1.111.94 1.22 1.02(注表中數字是給茯苓提取物的動物的骨髓細胞中各種祖細胞為單純給CY動物的祖細胞的倍數。)CFU-GM粒單細胞結節數，CFU-MEG巨核細胞結節數，CFU-E紅細胞結節數，BFU-E網織紅細胞結節數。給藥後21天各組活殺狗未見體表及各臟器有明顯異常，病理檢查結果表明茯苓提取物能明顯促進血液細胞的增殖，引起造血細胞再生是多譜系的。
茯苓提取物對LPS激活的巨噬細胞產生的CSFs的影響。
CSFs的誘生實驗使用巨噬細胞作為CSFs的產生細胞，首先製備巨噬細胞單層，在細胞培養液中加入脂多糖(10μg/ml)，培養2小時，再加入不同劑量的茯苓提取物，繼續培養24小時，收集巨噬細胞的培養液，其中含巨噬細胞產生的CSFs。
另取小鼠骨髓細胞製成懸液，加入上述的巨噬細胞的各組培養液，繼續培養4小時，然後每管加入D-[3H]-半乳糖，繼續培養20小時，離心分出骨髓細胞，測定細胞中3H-半乳糖的摻入量。在骨髓細胞增殖時，半乳糖參加細胞膜的合成，因此半乳糖的摻入率可以代表細胞的增殖的多少，而細胞的增殖又決定於CSFs的量，因此，半乳糖的參入量與CSFs的量成正比。結果見圖2。
權利要求
1.用於改善造血功能的茯苓提取物。
2.用於改善造血的藥物組合物，其包括茯苓提取物的及藥用載體或賦形劑。
3.權利要求1的茯苓提取物，其中茯苓是白茯苓。
4.權利要求1的茯苓提取物，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物。
5.權利要求1的茯苓提取物，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷三烯萜類化合物。
6.權利要求2的藥物組合物，其中茯苓是白茯苓。
7.權利要求2的藥物組合物，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷烯類化合物。
8.權利要求2的藥物組合物，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷烯類化合物。
9.茯苓提取物用於製備用於改善造血功能的藥物的用途。
10.權利要求9的用途，其中茯苓是白茯苓。
11.權利要求9的用途，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物。
12.權利要求9的用途，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷三萜烯類化合物。
13.茯苓提取物的製備方法，其包括i)將茯苓粉碎，然後用選自醇、酮、酯或滷代烷的有機溶劑或有機溶劑與水的混合物提取，ii)將i)提取物減壓除去溶劑，所得殘餘物用酸酸化到pH2-3，得茯苓提取物，iii)如需要，得ii)中茯苓提取物溶於醇，過濾除去不溶物，減壓除去醇，得純化的茯苓的提取物，如需要或必要，將所得純化的茯苓提取物懸浮於水中，用鹼調節茯苓提取物的水懸浮液pH至10-11，過濾除去不溶物，濾液用酸調節至3以下，得進一步純化的茯苓提取物；或將ii)中茯苓提取物懸浮於水中，用鹼調節該水懸浮液pH至10以上，過濾，往濾液中加入選自酯，滷化烷，芳香烴或醚的有機溶劑，用酸酸化有機相pH至3以下，減壓蒸乾有機相，得進一步純化的茯苓提取物。
全文摘要
本發明涉及用於改善造血功能的茯苓提取物,含它們的藥物組合物及製備方法。
文檔編號A61P7/00GK1329900SQ0011930
公開日2002年1月9日 申請日期2000年6月27日 優先權日2000年6月27日
發明者許津, 張秀敏, 王穎立 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所