富羥脯氨酸蛋白及含有這種蛋白的藥用和化妝用組合物的製作方法

2023-06-30 06:25:46 1

專利名稱：富羥脯氨酸蛋白及含有這種蛋白的藥用和化妝用組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及富羥脯氨酸糖蛋白，這種蛋白可以從植物材料中獲得，還涉及它的藥用和化妝用用途。
更確切地講，本發明涉及富羥脯氨酸糖蛋白，可以通過酸性醇萃取法從紅豆杉(Taxus spp.)、銀杏(Gingko biloba)、番茄(Lycopersicum esculentum)和胡蘿蔔(Daucus carota)細胞培養物中獲得這種蛋白，其具有以下特徵-平均分子量20,000Da，波動範圍為12,000-38,000，通過凝膠滲透和電泳測得；-可溶於酸性水溶液。
已知源於動物的某些糖蛋白，如膠原和蛋白聚糖在原樣或摻入合適的組合物中後進行表面塗敷時能產生有益作用。
膠原是一種富脯氨酸和羥脯氨酸的糖蛋白，可將其直接用於或與其它多肽基質混合後用於治療與不良的皮膚水化和彈性相關的皺紋和其它有損容貌的缺陷。不過，源於動物的膠原的應用是受限制的，因為其中存在被病毒和毒素汙染的危險。儘管源於植物的化合物不存在這種風險，但迄今為止其在化妝品中的應用卻十分有限例如，已知化妝用組合物含有諸如蘆薈之類的植物的粗提物或諸如鱷梨之類的切碎的完整植物。
已了解到，被稱為伸展蛋白的植物糖蛋白是由處於增殖期的植物細胞所產生的，而且具有類似於動物膠原的結構。EP-A-05334078中披露了平均分子量在100,000Da以上的伸展蛋白在化妝品中的應用。然而，迄今所公開的用於提取伸展蛋白的方法都包括用鹽水溶液萃取各種來源的植物材料，接著用諸如三氯乙酸之類的強酸純化，這些方法不能獲得用於化妝品的合適產物，由於存在可溶性、穩定性、再現性及其化學-物理特徵一致性的問題。
業已發現，通過下述方法可以獲得結構上類似於上述伸展蛋白、但分子量較低、在酸性水溶液中可溶性較高的富羥脯氨酸糖蛋白，該方法包括體外培養選擇的植物的細胞，並用酸性醇溶液萃取上述生長於合適培養基中的細胞。
通過本發明方法所獲得的糖蛋白，其水化、成膜、調色和結瘢特性優於膠原的相應特性。因此，本發明的糖蛋白可用於化妝用組合物或皮膚病用組合物中，用於治療幹皮病、牛皮癬、鱗癬、皮屑、角化病、皺紋、痤瘡、溼疹、炎性皮膚病、皮膚老化以及所有其它曾建議採用動物膠原的用途中。
本發明糖蛋白的水溶液保持穩定，不會發生能導致不可溶的產物形成的任何糖蛋白聚合作用。另外，這種溶液的粘度特別高，而且不取決於其濃度；令人吃驚的是，其0.1％的濃度即具有與1％膠原或5％植物白蛋白溶液相同的成膜和水化力。
待萃取的植物材料獲自紅豆杉、銀杏、番茄和胡蘿蔔細胞的發酵培養物。優選採用獲自紅豆杉、銀杏和番茄的細胞。細胞培養技術是常見的，包括用來自諸如葉、皮、根、莖或種子之類的植物各部分的愈傷培養物進行懸浮培養，該方法如Dobbs和Roberts所述(Experiments inPlant Tissne Culture，2nd ed.，Cambridge University Press，New York，1985)。
上述植物愈傷組織在滅菌並選擇性地添加抗細菌劑後，通常被用作合適的液體培養基的接種物，如在上述Dobbs和Roberts的手冊中所述。特別適用於本發明的培養基是Murashige and Skoog培養基。添加諸如脯氨酸、還原劑、乙烯或諸如Ethephon或L-氨基環丙烷羧酸之類的能釋放乙烯的化合物之類的添加劑適合於提高目的糖蛋白的產量。
優選以萘乙酸作為植物生長素，以6-(γ，γ-二甲氨基)嘌呤為細胞激動素，以維生素和3％的糖為碳源。可根據所選擇的材料添加適量維生素C，以防止最終的產物褐變。
發酵時間在3-12天之間，優選在5-6天之間。一旦發現結束就對培養基進行離心，並在存在稀釋的無機酸、優選為氫氯酸或硫酸的條件下，用醇，優選為乙醇萃取細胞材料。該方法能使某些可能破壞本發明糖蛋白穩定性的酶失活，特別是使多酚氧化酶和酪氨酸氧化酶失活，這些酶能使糖蛋白聚合，從而形成不可溶的產物。
在有無機酸的條件下進行醇萃取，可以徹底提取出鹼性糖蛋白，而且已證實其對這種用途具有高度選擇性。除乙醇之外，還可採用諸如甲醇或異丙醇之類的可水溶混的醇。對所得到的水醇提取物進行中和，然後濃縮並加熱至70-100℃溫度，優選為80℃左右，接近完全沉澱變性蛋白。通過濃縮澄清懸浮液，並對該液體進行分級超濾，以除去高和低分子量物質。超濾是用截斷分子量為10,000-40,000 Da的聚磺酸膜，如CentriconR或RomiconR進行，其纖維可以是空心的或是捲曲的。對所得到的過濾產物進行電透析，以除去不需要的物質，如鹽和低分子量糖。經過濾和透析後得到的溶液，可直接用於化妝品或藥品中，或將其濃縮至較小體積，然後凍幹或霧化。
通過高壓液相層析(HPLC)進行凝膠滲透，對本發明的產物進行分析鑑定，所述HPLC由一個Waters泵裝置組成，並具有一個Ultrahydrogel Linear WatersR柱組30cm×0.5cm和Waters UV吸收檢測器，484型。將含有0.067M磷酸二氫鉀、0.1M NaCl和6×10-4MNaN3的水溶液用作洗脫劑。將待分析的糖蛋白樣品溶於同一洗脫溶液(3mg/10ml)中，測定目的物和被選作分子量在細胞色素C(12，400Da)和葡聚糖藍(2,000,000 Da)之間的參照物的標的量；可通過在12.5％聚丙烯醯胺凝膠和4％積層凝膠上電泳分別或同時測定所述產物或其中間產物。將待分析的樣品溶於含有SDS和0.1％巰基乙醇的緩衝液中，使沉澱量為100～300mg。在20mA的穩定電流下進行遷移4小時。用5種標準分子量(7kD、14kD、24kD、54kD和66kD)繪製計量曲線。由該計量曲線計算出兩條主帶的分子量為22.5kD和25kD，而兩條較弱帶的分子量為31kD和34kD。用本文所披露的方法可從來源於不同植物的各種細胞外植體中獲得分子量相當和胺基酸組成相當的產物混合物。下面以舉例方式給出自銀杏細胞中提取的糖蛋白的胺基酸分析結果。胺基酸 峰面積 ％Asp 4.399Glu 4.328Hyp 17.505Ser 7.065Gly 6.056Hys 1.782Arg 2.471Thr 4.739Pro 10.036Ala 8.2Tyr 2.388Val 6.162Met 1.154Ile 2.479Leu 5.525Phe 1.862Lys 14.254上述數據相當於糖蛋白混合物中胺基酸總量的百分比。該混合物中的糖為阿拉伯糖和半乳糖。各種產物中胺基酸與糖之比的平均值為2∶1。
如上所述，本發明的產品既可應用於藥品領域又可應用於化妝品領域。對於藥品領域來說，可將該產品摻入凝膠或軟膏中，或用在醫用紗布上用於燒傷或傷口的特殊治療。在這種場合通常要對所述產物進行滅菌或滅菌過濾和凍幹。
可以用傳統方法製備本發明的化妝用和皮膚病用製劑。使用形式的例子包括水成噴霧劑、洗液、溶液、乳液、凝膠、藥膏和乳油。
本發明的化妝用和皮膚病用製劑可以含有重量百分比為約0.01～約50％的富羥脯氨酸糖蛋白，優選為0.05～5％，還含有常用的賦形劑。由於本發明糖蛋白的高穩定性，可以獲得含有50％以上可溶性富羥脯氨酸糖蛋白的藥用和化妝用製劑。
可將本發明的糖蛋白直接加入藥用和化妝用製劑中或進行微膠囊化，以產生長效水化作用。這種微膠囊可以是親水的或親脂的。本發明的製劑可以含有對於預想目標有互補或有用活性的其它活性成分。
下面的實施例將對本發明作進一步說明。
例1製備用於糖蛋白生產的銀杏愈傷組織和液體培養物在0.1％Tween 80(R)溶液中洗滌銀杏嫩葉，製備這種嫩葉的外植體。將葉片切成約0.5cm大小，並用75％乙醇預滅菌1分鐘。然後用2％次氯酸鈉溶液滅菌，並在無菌水中洗滌3次。將所得外植體轉移到裝在培養皿裡的Murashige Skoog培養基中，該培養基中含有3％蔗糖並添加了Lynsmeyer Skoog維生素和諸如2，4-二氯苯氧乙酸和萘乙酸之類的激素。將上述產物在黑暗中、在23℃下培養20天。在這一時期結束時，得到易碎的愈傷組織，它易於生長並可以在同一條件下繼代培養的方式連續傳代，因為可將其用於製備液體培養基。將該愈傷組織用於接種盛有200ml Murashige Skoog培養基的Erlenmeyer燒瓶，該培養基中添加了萘乙酸和6(γ，γ-二甲氨基)嘌呤，LynsmeyerSkoog維生維和3％蔗糖作為碳源。在攪拌和連續光照條件下將所述燒瓶培養4天。然後收穫細胞的生物材料用於提取糖蛋白。
例2由銀杏細胞製備糖蛋白對按例1方法得到的培養物進行低速離心，並用1升含有1％硫酸的70％乙醇對收穫的細胞(鮮重1.5kg)進行萃取。重複萃取2次，從而定量回收鹼性糖蛋白。中和以後對提取物進行過濾，以除去混濁物，在真空中於50℃下濃縮，直到所有的乙醇都被完全除去。將該含水濃縮物在85℃下加熱30分鐘，並再次離心，以除去沉澱，將沉澱棄除。用具有40,000Da截斷極限的CentriconR對所獲得的澄清溶液進行超濾，以排除較高分子量。
再用截斷分子量為10,000Da的空心纖維膜對上述過濾產物進行超濾，以除去非糖蛋白低分子量物質。接著對濾液進行透析，並濃縮成1％的固體殘餘物。得到1.5升略為粘稠的產物，可將這種產物直接用於化妝用組合物。在電泳分析時，該產物含有6條帶，其中4條的分子量為16,000、22,000、33,000和36,000Da。
例3由蕃茄製備糖蛋白按照例1的方法用滅菌的蕃茄芽在盛有10升Murashige Skoog培養基的14升發酵罐中製備細胞材料，所述培養基中加入萘乙酸和6(γ，γ-二甲氨基)-嘌呤，Lynsmeyer Skoog維生素和3％蔗糖作為碳源。發酵在23℃下進行5天，同時以150rpm的轉速攪拌，發酵是在有0.05％的酵母提取物和大約70％溶解氧的條件下進行。在發酵結束時收集發酵液，並通過0.2μm的陶瓷膜進行微量過濾以濃縮細胞。將一定量的含0.5％氫氯酸的異丙醇加入所獲得的細胞糊狀物中，並用例2的方法進行提取。獲得含有0.5％幹殘餘物的3.5升溶液。對凍幹的溶液進行分析，分別得出10％的脯氨酸含量和31％羥脯氨酸含量。
例4化妝用組合物100g O/W乳液中含有例2或3的溶液 10.0g乙醯化羊毛脂醇PEG-10 2.0g鯨蠟基-十八烷醇 1.5g鯨蠟醇十六酸酯 2.0g硬脂酸 7.0g辛酸辛酯 7.5g鯨蠟基磷酸鉀 0.5g防腐劑 適量香料 適量純化水 適量，加至100g的總重量例5化妝用組合物100g的O/W乳液中含有例2或3的溶液 10.0g鯨蠟基十八烷基葡糖苷 5.0g西蒙得油(Jojoba oil) 10.0g二甲聚矽氧烷 0.5g十四烷酸異丙酯 8.0g抗氧化劑 適量防腐劑 適量香料 適量純化水 適量，加至總重量為100g
權利要求
1.富羥脯氨酸糖蛋白，可以用酸性醇萃取法從紅豆杉、銀杏、蕃茄和胡蘿蔔細胞培養物中獲得，其具有以下特徵-平均分子量為20,000Da，波動範圍為12,000～38,000，通過凝膠滲透和電泳測得；-高的水溶性。
2.一種用於製備權利要求1的糖蛋白的方法，該方法包括a)在一種液體培養基中培養紅豆杉、銀杏、蕃茄和胡蘿蔔細胞3-12天；b)在有稀無機酸的條件下用水可溶混的醇提取細胞材料；c)中和、濃縮並在70～100℃的溫度下加熱所述提取物；d)離心、分級超濾並透析。
3.含有權利要求1的糖蛋白作為活性成分的化妝用和藥用製劑，具有水化、成膜、調色和結瘢特性。
4.如權利要求3的製劑，其為水成噴霧劑、洗液、溶液、乳液、凝膠、軟膏、乳油和醫用紗布形式。
全文摘要
本發明涉及富羥脯氨酸糖蛋白,可以通過酸性醇萃取法從紅豆杉、銀杏、蕃茄和胡蘿蔔細胞培養物中獲得這種糖蛋白,其具有以下特徵:平均分子量為20,000Da,波動範圍為12,000～38,000,是通過凝膠滲透和電脈測得;高的水溶性。
文檔編號A61K8/96GK1171822SQ95197140
公開日1998年1月28日 申請日期1995年12月21日 優先權日1994年12月28日
發明者E·伯姆巴德裡, C·普佐恩 申請人:因迪納有限公司