氨基脲衍生物半抗原、抗原和抗體的製備方法
2023-06-16 16:17:51
專利名稱：：氨基脲衍生物半抗原、抗原和抗體的製備方法
技術領域：
：本發明屬於免疫化學
技術領域：
，具體涉及一種氨基脲衍生物的半抗原、抗原和抗體的製備方法，以及製備得到的半抗原、抗原和抗體及抗體的應用。
背景技術：
：呋喃西林作為一種硝基呋喃類藥物，曾用於治療和預防由埃希氏菌和沙門氏菌引起的哺乳動物消化道疾病。由於呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)具有致癌作用，歐盟已於1995年禁止在食用動物中使用硝基呋喃類藥物，我國也於2002年頒布了禁止使用該類獸藥的禁令。目前，呋喃西林是國際動物源性食品貿易的必檢項目，成為發達國家限制第三國出口的技術貿易壁壘。呋喃西林對光敏感，代謝快速，在動物體內主要以代謝物SEM形式存在較長時間。因此，呋喃西林殘留的分析方法主要以其代謝SEM為標誌物進行檢測。目前，國內外報導的檢測方法主要是通過對SEM進行鄰硝基苯甲醛的衍生前處理後，使用液-質聯用(LC-MS)、高效液相-質譜聯用法(HPLC-MS)等儀器測定其衍生產物NPSEM。儀器法是一種精確，穩定的確證方法，但具有成本高，樣品通量低，前處理煩瑣，操作複雜等缺點，不易實現現場快速篩查。酶聯免疫分析技術(ELISA)具有操作步驟簡單、樣品通量高、成本低、易於實現自動化控制和現場快速篩査等優點，為呋喃西林大批量樣品的快速篩査，提供了新方法。建立ELISA方法首先需要製備針對目標藥物的特異性抗體。多數藥物、毒素、環境汙染物分子質量小於1000u，屬於僅有反應原性而無免疫原性的半抗原。目前製備小分子半抗原抗體的常規方法為選擇具有毒理學意義的代謝產物或原形藥物作為待測物，設計合成保留待測物分子結構特徵並帶有活性基團的半抗原，通過共價鍵使半抗原與大分子蛋白質載體偶聯，製備人工免疫原，經動物免疫程序製備針對半抗原的特異性抗體。半抗原合成是免疫化學分析中最為困難的關鍵步驟。近年來，國內外科研人員在小分子半抗原的設計與合成做了大量工作。Goodrow等認為在半抗原的設計中須遵循以下原則①免疫原中的半抗原應在分子結構立體化學和電子分布上與待測物分子儘可能相似；②半抗原結構中的連接臂應不易於誘導產生"臂抗體"，最好使用一定長度的碳鏈；③半抗原分子應具有便於與蛋白載體偶聯的活性基團，且活性基團的存在對待測物分子的電子分布應沒有影響；④半抗原與蛋白偶聯後仍應保留待測物分子的基本結構。由於小分子農獸藥無免疫原性，通常需與大分子載體蛋白偶聯製備完全抗原，藉助載體蛋白的T細胞表位獲得免疫原性，以便刺激機體產生抗體。製備完全抗原時常用的載體有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚賴氨酸(PLL)等。製備的人工抗原經動物免疫，抗血清的純化等程序得到可用於ELISA檢測的抗體。目前尚未有氨基脲衍生物半抗原、抗原和其特異性抗體的技術報導。——
發明內容本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種氨基脲衍生物半抗原，同時提供由所述半抗原偶連載體蛋白製備的人工抗原，以及免疫實驗動物後使機體產生特異的針對氨基脲衍生物的抗體。本發明的另一個目的是提供所述半抗原、抗原和特異性抗體的製備方法。本發明的目的通過以下技術方案來予以實現提供一種氨基脲衍生物半抗原的製備方法，是將氨基脲與過量的帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下於甲醇中進行氨醛縮合反應，反應產生的沉澱經洗滌、乾燥得到所述半抗原。氨醛縮合反應時間為16個小時左右。所述帶羧基的苯甲醛衍生物優選間羧基苯甲醛或2-(4-甲醯基苯氧基)乙酸。帶羧基的苯甲醛衍生物採用間羧基苯甲醛製備得到的氨基脲衍生物半抗原具有式(I)所示結構formulaseeoriginaldocumentpage7帶羧基的苯甲醛衍生物採用2-(4-甲醯基苯氧基)乙酸製備得到的氨基脲衍生物半抗原具有式(II)所示結構formulaseeoriginaldocumentpage8(II)本發明提供了一種氨基脲衍生物抗原的製備方法，包括以下步驟(1)將氨基脲衍生物半抗原與縮合劑N，N'-二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(NHS)反應形成活潑酯；(2)將活潑酯滴加入蛋白溶液中反應；(3)步驟(2)反應得到的偶聯有氨基脲衍生物半抗原的蛋白經透析純化得到目標抗原。步驟(1)所述反應時間過夜；步驟(2)所述蛋白溶液的濃度為5mg/mL，反應時間為12小時；步驟(3)所述的透析純化時間為3天。選用式(I)所示半抗原製備得到的抗原具有式(ni)所示結構:formulaseeoriginaldocumentpage8(m)選用式(II)所示半抗原製備得到的抗原具有式(IV)所示結構:formulaseeoriginaldocumentpage9(IV)本發明同時提供了一種氨基脲衍生物抗體的製備方法，包括以下(a)將氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑免疫實驗動物；(b)免疫後抽取血液，分離血清；(c)血清經辛酸硫酸銨純化得到抗體。步驟(a)所述氨基脲衍生物抗原濃度為lmg/mL，氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑按l:l比例免疫實驗動物。步驟(b)所述免疫次數為4次。本發明還提供了所述抗體的應用，具體是應用於呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)的ELISA方法免疫化學分析中。本發明是通過設計最適的半抗原製備相應的人工抗原，從而獲得對目標分析物具有特異性識別的抗體，用於快速分析肉源性食品中氨基脲的殘留量，從而達到監控呋喃西林非法使用情況的目的。本發明的有益效果是所述半抗原和氨基脲衍生物結構相似，突出了此獸藥分子特異性抗原決定簇，並可通過活潑酯法偶聯載體蛋白製備抗原，使用所述抗原免疫實驗動物可獲得效價高，特異性好的針對氨基脲衍生物的抗體，所述抗體可用於動物源性食品中氨基脲殘留量的快速檢測，檢測下限可達0.09ng/mL。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步詳細說明本發明。實施例1氨基脲衍生物半抗原MCPSEM的製備方法在50ml圓底燒瓶中加入間羧基苯甲醛1.15g，緩慢加入甲醇直至對間羧基苯甲醛完全溶解，攪拌中加入0.3g氨基脲，室溫攪拌過夜；反應結束，過濾，水洗兩遍，甲醇洗兩遍，乾燥，得0.62g白色粉末，其結構如式(I)所示。半抗原MCPSEM的APCI-MS分子離子峰為207，HNMR(600MHz,^rDMSO,TMS):310.35(s,1H);8.14(s,1H);8.03(d，/=7.8Hz,1H);7.93(s，1H);7.90(d,J二7.8Hz，1H);7.52(t,/=7.2Hz，lH，)。以上波譜數據均能正確歸屬，與MCPSEM結構一致，說明半抗原MCPSEM合成成功。1STY^pCOOH(I)實施例2氨基脲衍生物半抗原CEPSEM的製備方法圓底燒瓶中加入2-(4-甲醯基苯氧基)乙酸1.06g，緩慢加入甲醇直至對2-(4-甲醯基苯氧基)乙酸完全溶解，攪拌中加入0.4g氨基脲，室溫攪拌過夜，反應結束，過濾，水洗兩遍，甲醇洗兩遍，乾燥，得0.90g白色粉末，其結構式如式(II)所示。CEPSEM波譜數據:APCI-MSm/z:237[M+H]+;1H匿,MHz，d6-DMS0，TMS):S10.09(s,1H);7.78(s，1H);7.64(d，J=9.0Hz，2H);6.91(d,J=9.0Hz，2H);4.71(s，2H)。以上波譜數據均能正確歸屬，與CEPSEM結構一致，說明半抗原CEPSEM合成成功。COOH(II)實施例3免疫原CEPSEM-BSA的製備方法取半抗原CEPSEM0.lmmol溶於2mlDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg。4。C下磁力攪拌反應過夜，離心後上清夜為A液；稱取BSA140mg溶於10ml濃度為0.lmol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMFlml，攪拌溶解製備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4°C下反應12h，離心後，取上清夜，4'C下用生理鹽水透析3d,每天更換3次透析液。得到的全抗原以lmg/ml的濃度分裝於0.5ml離心管中，凍存於-2(TC冰箱中，供免疫用。製備的氨基脲衍生物免疫原具有式(V)所示結構formulaseeoriginaldocumentpage11(V)免疫原鑑定對載體蛋白BSA，半抗原CEPSEM和免疫原CEPSEM-BSA進行紫外掃描測定(200400nm)，發現免疫原CEPSEM-BSA與BSA和CEPSEM相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗原CEPSEM與BSA偶聯成功。三硝基苯黃酸法(TNBS)測得半抗原IV與BSA的偶聯比為16:1實施例4包被原CEPSEM-OVA的製備方法取半抗原CEPSEM0.lmmol溶於2mlDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg。4"下磁力攪拌反應過夜，離心後上清夜為A液；稱取OVA140mg溶於10ml濃度為0.lmol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMFlml，攪拌溶解製備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4"C下反應12h，離心後，取上清夜，4T:下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液，得到的全抗原以lmg/ml的濃度分裝於0.5ml離心管中，凍存於-2(TC冰箱中，供呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)的ELISA方法免疫化學分析中包被酶標板用。製備的包被原CEPSEM-OVA結構如式(VI)所示(VI)包被原鑑定對載體蛋白OVA，半抗原CEPSEM和包被原CEPSEM-OVA進行紫外掃描測定(200400nm)，發包被原CEPSEM-OVA與載體蛋白OVA及CEPSEM相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗原CEPSEM與載體蛋白OVA偶聯成功。TNBS法測得半抗原CEPSEM與載體蛋白OVA的偶聯比為13:1。實施例5多克隆抗體的製備方法及抗體效價測定多克隆抗體的製備將免疫原慢慢解凍，然後加入等量的佐劑(第1次免疫用弗氏完全佐劑，以後加強免疫均用弗氏不完全佐劑)。完全乳化後，採用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注射方式免疫6隻體重為2.53kg的健康紐西蘭大白兔。第4次加強免疫後1周耳緣靜脈採血，並利用間接ELISA測定血清效價。當效價不再上升時，採用耳緣靜脈免疫兔子。1周後心臟採血，室溫靜置0.5lh，於4。C冰箱過夜後吸取上層析出的血清。抗血清採用硫酸銨沉澱法純化得到多克隆抗體，透析後冷凍乾燥成粉末，於-2(TC下保存備用。抗體效價的檢測間接競爭ELISA測定抗體陽性滴度以2.1倍於陰性血清的測定值為準，測得抗體的陽性滴度為1:640000實施例6抗體親和性及特異性試驗將不同濃度的氨基脲的鄰硝基苯甲醛的衍生物NPSEM與抗體一起進行間接競爭ELISA反應，測定其抑制率，以確定抗體對NPSEM的親和性。其IC5。為0.12ng/mL，檢測限為0.09ng/mL。將NPSEM、鄰硝基苯甲醛、苯甲醛、硝基苯、NPAOZ、NPAMOZ和NPAHD配成不同濃度溶液，測定其交叉反應率，結果發現與同類藥物無交叉反應，見表1。以上實驗結果說明由所設計半抗原製備的免疫原免疫產生的抗體具有靈敏度高，特異性好等優點。表1交叉反應試驗結果tableseeoriginaldocumentpage14權利要求1、一種氨基脲衍生物半抗原的製備方法，其特徵在於將氨基脲與過量的帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下於甲醇中進行氨醛縮合反應，反應產生的沉澱經洗滌、乾燥得到半抗原。2、一種權利要求1所述製備方法製備得到的氨基脲衍生物半抗原，其特徵在於具有式(I)所示結構formulaseeoriginaldocumentpage23、一種權利要求1所述製備方法製備得到的氨基脲衍生物半抗原，其特徵在於具有式(II)所示結構formulaseeoriginaldocumentpage24、一種氨基脲衍生物抗原的製備方法，其特徵在於包括以下步(1)將權利要求1所述氨基脲衍生物半抗原與縮合劑N，N'-二環己基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀醯亞胺反應形成活潑酯；(2)將活潑酯滴加入蛋白溶液中反應；(3)步驟(2)反應得到的偶聯有氨基脲衍生物半抗原的蛋白經透析純化得到目標抗原。5、一種權利要求4所述製備方法製備得到的氨基脲衍生物抗原，其特徵在於所述具有式(III)所示結構6、一種權利要求4所述製備方法製備得到的氨基脲衍生物抗原，其特徵在於具有式(IV)所示結構7、一種氨基脲衍生物抗體的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(a)將氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑免疫實驗動物；(b)免疫後抽取血液，分離血清；(c)血清經辛酸硫酸銨純化得到抗體。8、根據權利要求7所述氨基脲衍生物抗體的製備方法，其特徵在於步驟(a)所述氨基脲衍生物抗原濃度為lmg/mL，氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑按l:l比例免疫實驗動物。9、一種氨基脲衍生物抗體的應用，其特徵在於應用於呋喃西林及其代謝物氨基脲的ELISA方法免疫化學分析中。全文摘要本發明公開了氨基脲衍生物半抗原、抗原和抗體的製備方法，氨基脲與帶羧基的苯甲醛氨醛縮合後得到氨基脲衍生物半抗原，所述半抗原和氨基脲衍生物結構相似，突出了此獸藥分子特異性抗原決定簇，並可通過活潑酯法偶聯載體蛋白製備抗原；使用該抗原免疫實驗動物可獲得效價高、特異性好的針對氨基脲衍生物的抗體。所述抗體可用於動物源性食品中氨基脲殘留量的快速檢測，檢測下限可達0.09ng/mL。文檔編號C07K16/06GK101407480SQ200810219299公開日2009年4月15日申請日期2008年11月21日優先權日2008年11月21日發明者孫遠明,張世偉,楊金易,沈玉棟,弘王,肖治理,蔡肇婷,雷紅濤申請人:華南農業大學