中取代度羧甲基茯苓多糖及其製備方法和其應用的製作方法

2023-06-17 06:30:21 1

專利名稱：中取代度羧甲基茯苓多糖及其製備方法和其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於抗腫瘤高分子多糖領域，尤其涉及作為生物反應調節劑的中羧甲基取代度的羧 甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran,簡稱CMP)及其製備方法和其應用。
背景技術：
茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos (Schw.) Wolf]乾燥菌核，自古為傳統中藥"四君 八珍"之一，具有"利水滲溼、健脾寧心"的功效，所含成分茯苓多糖體具有e (l—3)連 結的葡聚糖線性結構與e (l—6)連結的葡萄糖基支鏈的結構。試驗表明，茯苓在沸水中的 煎煮得率不超過1%，未經化學改性的茯苓多糖體沒有抗腫瘤活性。經過化學改性的茯苓多糖 體一羧甲基茯苓多糖(CMP)能明顯提高茯苓多糖體的水溶性，利於人體的吸收，而且CMP 能誘導人血淋巴細胞產生幹擾素-a(IFN-a)、幹擾素，(IFNi)、白細胞介素-2 (IL-2)、 白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-(i (TNF-a)與粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) 等多種細胞活性因子，具有增強免疫、抗腫瘤、抗放射、抗病毒、保肝、催眠、利尿、改善 睡眠、降血糖、降血脂、抗衰老等藥理學活性，可廣泛用於惡性腫瘤放化療的輔助治療，顯 著增強惡性腫瘤患者的免疫功能，減少和消除放化療的副反應，增強患者體質，促進患者食 欲，改善患者睡眠，提高患者的生活質量與延長壽命。CMP為一種新型的生物反應調節劑 (BRM)。
已有試驗證明CMP按13.2g/kg劑量灌胃小鼠，無急性毒性反應；CMP按0.22-1.73g/kg 劑量(所用劑量為人臨床劑量的180倍)灌胃大鼠12周，無毒副反應，連續用藥3個月安全； 毒理試驗也證明，CMP無致突變、無致畸胎的結果。
Hamuro等人(1971年)採用異丙醇與水為介質，在液固相振蕩條件下合成製取CMP,因 需大型振蕩設備，難以進行工業化生產，且需要大量的有機溶劑(如乙醚、甲醇、丙酮、醋 酸和乙醇)對 CMP 進行後處理及純化，不僅生產成本較 高，還造成環境汙染。石清東等人(1996年)以乙醇與水為介質，採用在液固相攪拌條件下 製取CMP，所得的CMP雜質含量較高，以NaCl計，含氯化物(％) 〈3.0%;以K計，含重 金屬(％) <0.002%,且較難分離去除所含的雜質，大大限制了CMP的臨床應用範圍，如該法制 得的CMP不能用於製備注射劑。
因此，製備中取代度的CMP，既提高其溶解度又能保持其重均分子量(Mw〉l(f道爾頓,成 為人們急需解決的技術問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種製備中取代度CMP的方法，包括如下步驟 1)茯苓多糖鹼提取液的製備茯茯乾燥、粉碎，用80目篩過篩，取茯苓粉，加入水，茯苓 粉與水的質量比為l: 6至1: 12範圍，總體積為Vp浸泡2h至12h,攪拌均勻，成為懸浮 液，加入摩爾濃度的氫氧化鈉溶液，其摩爾濃度(M/L)在2.0mol/L〈M/L〈3.0mol/L範圍，其 體積為Vz, V2: K在2: 3至3: 4範圍，攪拌均勻，在室溫提取lh至2h，壓濾，得茯苓多糖 鹼提取液。2)中取代度CMP的製備在適量的(1.2 3.6) mol/L中的氯乙酸溶液，緩緩加 入適當過量的摩爾濃度(M/L) 2. 0mol/L〈M/L〈3. 0mol/L的氫氧化鈉溶液，進行中和，反應完 全後，應有適量的剩餘鹼存在，冷卻，加入到1〉所得的茯苓多糖鹼提取液中，在50'C至59 'C反應8h至24h,反應生成液用3倍體積的95%的乙醇沉析，沉析物用水溶解，用H202脫色， 精濾，超濾，再精濾，濾液用3倍體積的95%的乙醇再沉析，沉析物用95%的乙醇洗滌2 3 次，離心分離得沉析物，乾燥，粉碎，即得中取代度CMP純品。
所述茯苓多糖的分子式為(C6HI05) n,可由多種方法製得，但在一定濃度與溫度條件下， 鹼化提取法得率最高。
所述用摩爾濃度(M/L)的氫氧化鈉溶液提取溼茯苓粉中的茯苓多糖，優選採用摩爾濃度 (M/L)在2. 0mol/L<M/L<3. 0mol/L範圍的氫氧化鈉溶液，在室溫提取lh至2h，壓濾，取濾 液，即得茯苓多糖鹼提取液。
所述適量的(1.2 3.6) mol/L的氯乙酸溶液,優選採用(2.8 3.6) mol/L 的氯乙酸溶液。
所述用摩爾濃度(M/L)的氫氧化鈉溶液中和(1.2 3.6) mol/L的氯乙酸溶液， 優選採用(2. 2 2. 6) mol/L的氫氧化鈉溶液。 所述用適當過量的摩爾濃度(M/L)的氫氧化鈉溶液與(L2 3.e) mol/L的氯乙酸溶液反 應，兩者用量的摩爾(M0L)數之比優選在1.05:1. 00至1. 10:1. 00範圍。
所述製備中取代度CMP的反應溫度在50'C至59'C範圍，反應時間在8h至12h範圍。反應 的溫度與時間條件優選50'C24h，更優選55'C16h;最優選59'C8h。 本發明所述製備中取代度CMP的化學反應式為
(C6H10O5 ) n+nClCH2COOH+nNaOH—(C8H1207) n+I!NaCl+nH20
在上述的化學反應中，茯苓多糖、氯乙酸、氫氧化鈉等3者的摩爾濃度(M/L)越大，反 應溫度越高，反應速度就越大，完成反應所需的時間就越短。但是，反應溫度在60'C以上， 將產生反應的副產物羥乙酸鈉，生成的CMP在此條件下(強鹼性、6(TC以上)，也將部分降 解，產生部分低分子量的CMP,產品中重均分子量(Mw) 〉1(f道爾頓的CMP的含量將降低。
在上述化學反應中，如果適當降低反應溫度與延長反應時間，可以防止大量反應副產物 羥乙酸鈉的產生，同時也防止大量CMP降解成為低分子量的CMP。
採用本發明的技術方法，所製備的中取代度CMP的羧甲基取代度(D《)可在0. 5<D 'S〈1. 0 範圍，重均分子量(M,) 〉106道爾頓。
所述用貼2脫色，即採用30%的HA溶液的體積與反應生成液的體積比在0. 5:100至1. 0: 100範圍，優選0.75: 100。脫色反應體系的pH值在8 12範圍；反應溫度在O'C至59°C 範圍，反應時間在12h至36h範圍。優選反應條件pH值在9 11，室溫反應24h。脫色反 應完成後，用6M0L/L的鹽酸溶液調pH值在5 7範圍，優選pH值6。
所述精濾，即把上述脫色後的反應生成液用液棒(孔徑〈5毫微米)粗濾，所得的粗濾液 再用微孔(孔徑〈0.5毫微米)薄膜進行精濾。
所述超濾，即採用DH-UF中空纖維超濾器對上述脫色後的反應生成液進行分子量篩選，
應用超濾膜技術，去除重均分子量(M,)《106道爾頓的CMP及其反應生成液中其他所有的
有機物與無機物，製備成為高純度重均分子量(Mw) 〉106道爾頓的CMP溶液。
所述本發明方法所製備的產品優選應用作為CMP凍乾粉針或CMP注射液的原料藥，即產 品以乾燥品計算，含(C8H1207 ) n的量可以達到95.0。/。以上.
本發明所述中取代度CMP的製備方法即採用液相不振蕩工藝，無需振蕩設備，方便實現 工業化生產。
本發明採用酸化法或酸洗法測定中取代度CMP的羧甲基取代度(D S)具體測定規程 參見Bolhuis Gerad K, Arends-Scholte Anna W,Stuut Gerrit J，et al Disintegration Efficiency of Sodium Starchglycolates Prepared from Different Native Starchs[J].Eur J.Pharm Bio Pharm,1994,40(5):317-320.
本發明採用標準曲線法測定中取代度CMP的重均分子量(Mw)範圍。


圖1已知重均分子量(Mw)的標準多糖Dexfran按Ka.v對數Log Mw作圖的重均分子 量(Mw)標準曲線。
圖2本發明製備的中取代度羧甲基茯苓多糖在SephadexG-200層析柱上的洗脫曲線，根 據測得的KaV值，求得其重均分子量(Mw) >106道爾頓。
具體實施例方式
以下將結合實施例具體說明本發明，本發明的實施例僅用於說明本發明的技術方案，
並非限定本發明的實質。 實施例1中取代度CMP的製備 中取代度CMP由如下方法製得
1) 幹茯苳7.5kg，粉碎，用80目篩過篩，取茯苓粉，投入到浸泡罐中，泵入60L水，攪 拌均勻，浸泡12h;
2) 在搪玻璃配製罐中配製40L2.5mol/L的氫氧化鈉溶液； —
3) 將2)步的鹼液緩緩泵入l)中，攪拌均勻，提取1.5h，壓濾，濾液由管道直接導入
搪玻璃反應罐中；
4) 在搪玻璃中和罐中配製50L3.2mol/L的氯乙酸溶液；
5) 在搪玻璃配製罐中配製2.5mol/L的氫氧化鈉溶液；冷卻，緩緩泵入4)步中進行中和 反應，攪拌均勻，冷卻，再泵入搪玻璃反應罐中，攪拌均勻，緩緩加熱升溫，至59'C，恆 溫反應8h;
6) 用6mol/L的鹽酸溶液調5)步所得的反應生成液的pH值5.0 7.0;
7) 將相當於6)步中3倍體積的95%的乙醇泵入醇析罐中；
8) 把6)步中反應生成液緩緩泵入7)中，再攪拌10min,靜置20 min，離心分離得沉 析物；
9) 用180L的水溶解8)步中所得的沉析物，用2.5mol/L的氫氧化鈉溶液調pH值9 11， 加入1.35L30。/。的H2O2溶液，室溫脫色反應24h,去除有色雜質，用6 mol/L的鹽酸溶液調 pH值至6.0，得CMP生成液；.
10) 用濾棒(孔徑〈5毫微米)粗濾9)步中的CMP生成液，得粗濾液，再用微孔(孔徑 <0. 5毫微米)薄膜過濾粗濾液得精濾液；
11) 把10)步中的精濾液用DH-UF中空纖維超濾器進行超濾，去除重均分子量(Mw)《 106道爾頓的CMP及精濾中所有其他的有機物與無機物，得超濾液；
12) 用微孔(孔徑<0.5毫微米)薄膜過濾ll)步中的超濾液，得中取代度CMP精濾液；
13) 用相當於12)步中所得的中取代度CMP精濾液3倍體積的95%的乙醇沉析12)步 中的中取代度CMP精濾液，離心分離得沉析物，沉析物用95%的乙醇洗滌2 3次，洗滌 後的沉析物於60'C乾燥12h， 105'C千燥2h,粉碎，即得中取代度CMP純品。其具有如下 理化性質
性狀白色粉末，無臭，略有引溼性。
分子式(C8H12。7 ) n 聚合物(n): n〉4.55X105 分子量(Mw): 〉1.0Xl(f道爾頓
IR[KBr] (cm—') :3700—3000， 2900， 1600.7, 1425.2, 1324.9,1078.0， 891.0。 UV (0.1mol/L鹽酸溶液、H20、 O.lmol/LNaOH溶液)無吸收峰。
13C-NMR[H2D] (ppm): 180. 078， 104. 870, 87. 697， 86. 667, 84. 935, 83. 145， 77. 851， 76. 490, 75.669， 73.273， 72.296， 70.345， 62.975。 . [a;TD:-1.20至-1.30 (C=l， H20) 1%水溶液的pH值5. 0-7. 0 水份百分含量(％) <8. 0%
以氯化鈉計，氯化物(％) <0. 01%;以Pb計，重金屬(％) <0. 001%,以As計，砷(％) <0. 0001%。
^MM1—中取代度羧甲基茯苓多糖重均分子量(Mw)的測定
測定條件儀器為LKB柱層析系統S印hadexG-200柱，移動相為0. 2 mol/L的NaCl溶液 (pH值7.0)緩衝溶液，流速0. 5ml/min，進樣量(W/V) lmg/ml,恆溫l(TC 。示差折射自 動檢測，記錄儀記錄峰位。
標準曲線用已知分子量的標準多糖Dexfran T2000(Mw2000000)、 TlOOO(Mw1000000)、 T500(Mw500000)、 T40(Mw40000)、 T20(Mw20000)、 TlO(MwlOOOO)、 T5(Mw5000)、製作 標準曲線，按Ka.v對數LogMw作圖，標準曲線見圖1。
本發明製備的中取代度羧甲基茯苓多糖在S印hadexG-200層析柱上的洗脫曲線參見圖 2,根據測得的Ka.v值，求得其重均分子量(Mw) 〉1.0X1S道爾頓。
根據中取代度羧甲基茯苓多糖分子式為(C8H1207) n，其重均分子量(Mw) 〉1.0X106 道爾頓，聚合度(n) 〉4.55X105，即本發明製備的中取代度羧甲基茯苓多糖的聚合度(n) >4. 55X105
實施例3酸化法測定中取代度羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D S) 精密稱取中取代度羧甲基茯苓多糖樣品0.4021g，置於150ml的燒杯中，80'C水浴加熱， 攪拌使溶解，冷卻後，用2mol/L的鹽酸溶液調pH4. 0，加入無水乙醇100ml,攪拌均勻， 靜置過夜，離心分離得醇析物，醇析物用95%的乙醇反覆洗滌，至洗滌液中不含氯離子。洗 淨的醇析物用0. 100Omol/L的NaOH標準溶液40. OOml溶解，待溶液呈透明狀後，立即用 0. 100Omol/L的標準鹽酸溶液反滴定，至酚酞指示劑的紅色剛退去，記錄反滴定所消耗 0. 100Omol/L的溶液體積為26. OOml。
按照下式計算中取代度羧甲基茯苓多糖的取代度(D*S)
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式中A為中和lg酸式中取代度羧甲基茯苓多糖樣品消耗的NaOH的m mol數；
C,為NaOH標準溶液的濃度(0. lOOOmol/L);
V腿為加入0, lOOOmol/L的Na0H標準溶液的體積數(40. 00ml);
C似為反滴定用的鹽酸標準溶液的濃度(0. 1000mol/L);
V^為反滴定所消耗0. 1000mol/L的鹽酸標準溶液的體積數(26. 00ml);
m為樣品的質量(g);
0. 162為茯冬多糖的失水葡萄糖單元的m mol質量；
0. 058為失水葡萄糖單元中一個羥基被羧甲基取代後，失水葡萄糖單元mmol質量的淨增 值。
本發明所製備的中取代度羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D'S)為0.71，計算過程如 下
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權利要求
1、一種製備中取代度CMP的方法1)茯苓多糖鹼提取液的製備茯苓乾燥、粉碎、用80目篩過篩，取茯苓粉，加入水，茯苓粉與水的質量比為16至112範圍，總體積為V1，浸泡2h，攪拌均勻，成為懸浮液，加入摩爾(M/L)濃渡的氫氧化鈉溶液，其摩爾濃度(M/L)在2.0mol/L<M/L<3.0mol/L範圍，其體積為V2，V2V1在23至34範圍，攪拌均勻，在室溫提取1h至2h，壓濾，得茯苓多糖鹼提取液。2)中取代度CMP的製備在適量的(1.2～3.6)mol/L的氯乙酸溶液中，緩緩加入適當過量的摩爾濃度(M/L)(2.0mol/L<M/L<3.0mol/L)的氫氧化鈉溶液進行中和反應，反應完全後，應有剩餘鹼存在，冷卻，加入到1)所得的茯苓多糖鹼提取液中，在50℃至59℃反應8h至24h，反應生成液用3倍體積的95％的乙醇沉析，沉析物用水溶解，用H2O2脫色，精濾，超濾，再精濾，濾液用3倍體積的95％的乙醇再沉析，沉析物用95％的乙醇洗滌2至3次，乾燥、粉碎，即得中取代度CMP。
2、根據權利要求l所述的方法，製備的中取代度CMP的溶解度[與羧甲基取代度(D S)有關]，比低 取代度(D*S<0.5)的CMP的溶解度大，但比高取代度(D*S》1.0)的CMP的溶解度小，其羧甲基取代 度(D*S) 0. 5〈D* S〈1.0範圍。
3、 根據權利要求1所述的方法，製備的中取代度CMP的重均分子量(M,) >106道爾頓。
4、 根據權利要求1所述的方法，所述在氫氧化鈉溶液與氯乙溶液中和反應時，用適當過量的摩爾濃度(M/L) (2.0mol/L〈 M/L < 3.0 mol/L)的氫氧化鈉溶液與(1.2~3.6) mol/L的氯乙酸溶液反應，兩者用量的摩爾(M0L)數之比優選在1.05:1.00至1. 10:1.00範圍。
5、 根據權利要求1所述的方法，所述反應的溫度與時間條件優選5(TC24h;更優選為55'C16h;最優選為 59'C8h。
6、 根據權利要求2與3所述的中取代度CMP的理化性質，本發明方法所製備的產品優選應用作為CMP 凍乾粉針或CMP注射液的原料藥。
全文摘要
本發明涉及中取代度羧甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran，簡稱CMP)，及其製備方法和其應用。本發明以水為介質，茯苓多糖、氯乙酸與適當過量的氫氧化鈉進行反應，反應溫度在50℃至59℃，反應時間在8h至24h。製備的中取代度CMP的羧甲基取代度(D.S)在0.5＜D.S＜1.0範圍，分子量(MW)＞106道爾頓，產品優選應用作為CMP凍乾粉針或CMP注射液的原料藥。
文檔編號C08B37/00GK101392030SQ20081013041
公開日2009年3月25日 申請日期2008年7月5日 優先權日2008年7月5日
發明者陳春霞 申請人:陳 勇