一種編碼肽基脯氨醯順反異構酶的基因的製作方法

2023-06-16 00:53:11

專利名稱：一種編碼肽基脯氨醯順反異構酶的基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物病原細菌的新的致病相關基因，該基因編碼的蛋白質為肽基脯氨醯順反異構酶，該酶催化外泌蛋白的空間摺疊，可用於防治植物病害的藥物靶標。
背景技術：
植物病害一直是農作物減產、品質降低的主要因子之一。隨著病原菌對藥物抗性的增強，農藥用量在不斷增加，這不僅加劇了環境汙染、藥物殘留，也大大提高了農業成本，因此，亟待研發新的防病治病策略和新型的無公害藥物。弄清植物病原菌侵染寄主的遺傳機制是開發新型藥物和防病策略的關鍵。
目前，已發現的與植物病原細菌致病相關的基因主要包括以下幾個類型過敏性與致病性基因(hrp)(He SY.1998.Type III protein secretionsystems in plant and animal pathogenic bacteria.Annu.Rev.Phytopathol.36363-392)；無毒基因(avr)(Bonas U et al.1999.Gene-for-gene interactionsbacterial avirulence proteins specifyplant disease resistance.Curr.Opinion in Microbiology 294-98)；致病性因子調節基因(rpf)(Barber CE et al.1997.A novel regulatorysystem required for pathogenicity of Xanthomonas campestris ismediated by a small diffusible signal molecule.Mol.Microbiol24555-566)；胞外酶類基因；胞外多糖合成基因(Tang JL et al.1991.Genetic and molecular analysis of a cluster of rpf genes involvedin positive regulation of synthesis of extracellular enzymes andpolysaccharide in Xanthomonas campestris pathovar campestris.MolGen Genet 226409-417.；Dow M et al.2000a.Xylella genomics andbacterial pathogenicity to plants.Yeast 17263-271.)，脂多糖合成基因(Dow M et al.2000b.The induction and modulation of plantdefense resistanses by bacterial lipopolysaccharides.Annu RevPhytopathol 38241-261.)等。
獲得基因組上單基因位點突變的突變體是研究基因生物學功能的關鍵。在基因組範圍內收集基因失活突變體能夠為在基因組水平上研究生物學過程、生命現象提供關鍵的資源。野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomons campestris pv.campestris，簡稱Xcc)是一種革蘭氏陰性細菌，能在全球範圍內引起十字花科植物黑腐病，導致農產品的產量和品質嚴重下降(Hayward AC.1993.The hosts of Xanthomonas.InSwingsG，Civerolo EL，editors.Xanthomonas.LondonChapman and Hall，pp.1-119.)。本發明的目的是通過建立野油菜黃單胞菌的突變體庫和大規模篩庫，鑑定與致病相關的新基因，提供可能的防治植物病害的藥物靶標。

發明內容
本發明的目的是提供一種與黃單胞菌致病相關的新基因XC2964(SEQID NO1)或其同源類似物，其中所述同源類似物具有與SED ID NO1的核苷酸序列80％以上同源性的DNA序列。該基因編碼肽基脯氨醯順反異構酶(SEQ ID NO2)，其由232個胺基酸組成，屬於FKBP-型肽基脯氨醯順反異構酶(FKBP-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerases)。攜帶該基因的質粒pXC2964已在中國普通微生物菌種保藏管理中心保存(北京市中關村北一條13號2714信箱)，保存編號為CGMCC No.1055(JM109/pXC2964)，保存日期為2003年11月26日，保藏的微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)JM109/pXC2964。
SEQ ID NO3的DNA是野油菜黃單胞菌8004菌株的DNA，由1099個鹼基組成。含完整的肽基脯氨醯順反異構酶基因，自5』端的第201-896位核苷酸為該基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，自5』端的第201-203位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5』端的第897-899位核苷酸為終止密碼子TAA。自5』端的第150-180位核苷酸為啟動子區；自5』端的第186-191位核苷酸為SD序列。
本發明主要涉及XC2964基因所編碼的肽基脯氨醯順反異構酶在防治植物病害中的應用。


圖1為XC2964基因的克隆酶切電泳圖譜。
1λ/HindIII標準DNA(片段大小從大到小依次為23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)；2載體pGEM3Zf(+)；3XC2964基因片段；4、5基因克隆2964/EcoR I；6100bp標準DNA(片段大小從大到小依次為3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)。
圖2為XC2964基因缺失突變體的PCR驗證凝膠圖。
1100bp標準DNA(片段大小從大到小依次為3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；2XC2964基因克隆JM109/pXC2964；3、4XC2964基因缺失突變體；5、6XC2964基因克隆8004/pXC2964；7野生型8004。
圖3為XC2964基因缺失突變體的胞外蛋白酶表型檢測。
A和B野生型8004菌株；C和DXC2964基因缺失突變體圖4為XC2964基因缺失突變體的致病性試驗結果。
A為黃單胞菌野生型菌株；B為XC2964基因的轉座子插入突變體；C為XC2964基因的缺失突變體，D為水(空白對照)。
具體實施例方式
在本發明的實施例中所用到的材料包括
大腸桿菌(Escherichia coli)株系JM109購自Promega公司；載體pGEM-3Zf(+)購自Promega公司；限制性內切酶、修飾酶等試劑購自Promega、Stratagene、QIAGEN公司。
寄主植物為蘿蔔(種名為Raphanus sati vus L.var.radiculusPers.)從四川省種子公司購買。
野油菜黃單胞菌野生型菌株Xcc 8004(Tang JL et al.1990.Cloningof genes involved in negative regulation of production ofextracellular enzymes and polysaccharide of Xanthomonas campestrispathovar campestris.Mol Gen Genet.222157-160.)；柯斯質粒pLAFR1和pLAFR3(Liu YN et al.1990.A multipurpose broad host range cloningvector and its use to characterise an extracellular protease geneof Xanthomonas campestris pathovar campestris.Mol GenGenet.220433-440.)；柯斯質粒pPH1JI(Hirsch PR et al.1984.Aphysical map of pPH1JI and pJB4JI.Plasmid.12139-141.)；轉座子Tn5gusA5(Zha D et al.1998.Cloning of DNA sequences involved inexopolysaccharide synthesis of Xanthomonas campestris pv.campestris.Wei Sheng Wu Xue Bao.38251-255.)。
NYGB培養基每升中含蛋白腖5克、酵母粉5克、甘油20克，pH7.0。
Xcc8004菌株全基因組序列XC2964基因擴增引物由上海生物工程公司根據下面序列合成。
上遊引物XC2964-F GAATTC GGCGTGGTCTGCGATCAG(SEQ ID NO4)下遊引物XC2964-R GGATCC ATTTCATCCAGGCTCCGC(SEQ ID NO5)斜體為附加酶切位點序列(EcoR I、BamHI)、框線為保護鹼基。
實施例1.野油菜黃單胞菌突變體庫的構建和XC2964基因的鑑定以大腸桿菌和Xcc之間的穿梭質粒pLAFR1為載體將Tn5gusA5引入Xcc野生型菌株8004，然後通過引入不相容質粒pPH1JI驅趕pLAFR1，通過抗生素(卡那黴素)抗性標記篩選Xcc∷Tn5gusA5插入突變體，結合Xcc 8004全基因組序列和TAIL-PCR(Thermal Asymetric Interlaced-PCR)技術(Liu YG et al.1995 Efficient isolation and mapping of Arabidopsisthaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlacedPCR.Plant.J.8457-63.)，確定Tn5gusA5在基因組上的插入位置(具體方法首先，通過TAIL-PCR擴增Tn5gusA5插入處下遊的DNA序列，然後對該序列進行測序，再將測序序列與Xcc8004全基因組序列比對，得到插入位置信息)。通過考察突變體的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的變化，篩選出致病性降低的突變體420個，涉及51個基因，其中5個屬於新的致病相關基因，本發明涉及其中一個基因--XC2964基因。
將XC2964基因的序列，在Genbank中進行BLASTP(生物信息學的一種序列比對工具，由美國國家生物信息中心開發，在網際網路上免費使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，結果顯示XC2964基因產物肽基脯氨醯順反異構酶，屬於FKBP-型肽基脯氨醯順反異構酶(FKBP-typepeptidyl-prolyl cis-trans isomerases)，該類酶參與外泌蛋白的空間摺疊，與蛋白質活性密切相關。
實施例2.XC2964基因(肽基脯氨醯順反異構酶基因)的克隆及序列測定根據XC2964的基因序列，設計引物(見XC2964-F和XC2964-R)，以野油菜黃單胞菌總DNA為模板，用PCR法擴增該基因全長序列(擴增條件95℃(1min)；35循環94℃(30s)，55℃(30s)，72℃(1min)])，並將其克隆至克隆載體pGEM3Zf(+)的EcoR I與BamHI位點之間，獲得了含該基因的重組質粒pXC2964。該質粒用EcoRI+BamHI酶切，除了一個3.1kb的載體條帶外，還有一個1.1kb的插入片段(見圖1)。用雙脫氧核苷酸法在ABI 377 DNA自動測序儀(購於美國PE公司)上測定DNA核苷酸序列。
實施例3.XC2964基因缺失突變體的構建和驗證以pGEM-3Zf(+)為載體，用PCR方法擴增得到的卡那黴素抗性基因(Kan基因，該基因為分子生物學方法中常用的基因)克隆到載體上。設計PCR引物(見說明)，對XC2964的旁側序列進行擴增[擴增條件95℃(1min)；30循環94℃(5s)，53℃(1min)，72℃(2min)]，得左、右旁側序列分別命名為2964L和2964R。分別將2964L和2964R克隆到載體上Kan基因的兩側(酶切位點見說明1)，構建帶有Kan基因和XC2964旁側序列的重組質粒pGK2964。將pGK2964中的插入片段克隆到具有廣泛寄主範圍的柯斯質粒pLAFR3上，構建質粒pLGK2964，通過三親本接合將pLGK2964導入野生型8004菌株進行同源雙交換，再通過兩親本接合和抗生素篩選接合子。所得接合子用PCR方法進行鑑定，因XC2964缺失突變體與野生型黃單胞菌8004菌株具有不同的擴增帶型而得以驗證(見圖2)。
說明1根據XC2964基因左右兩側的DNA序列，設計兩對引物，對XC2964左右兩側DNA進行擴增。設計的引物序列為(1)XC2964基因左側引物2964LF5』-ACAGTTGAATTCGTCGATCACCGCTACCACCG-3』(SEQID NO6)保護鹼基EcoR.I位點2964LR5』-ACAGTTGGTACCGTGGCTGATGCAGTTCGAGAT-3』(SEQ ID NO7)保護鹼基Kpn I位點(2)XC2964基因左側引物2964RF5』-ACAGTTTCTAGAGCCAGCGCATTGCCCGTCAG-3』(SEQ ID NO8)保護鹼基XbaI位點2964RR5』-ACAGTTGTCGACGATTGACCAGGCCCAGTTGC-3』(SEQ IDNO9)保護鹼基SalI位點在引物設計時，2964LF，2964LR，2964RF，2964RR分別引入了EcoRI，KpnI，XbaI，SalI酶切位點，並在每個引物的5』端都加上了6個保護鹼基ACAGTT。
說明2實施例2.中說述的基因缺失突變方法，也稱基因敲除，是分子生物學常用方法，基因敲除方法和驗證方法均在網頁http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast deletionproject/PCR strategy.html有詳細說明。(Baudin A et al.1993.Asimple and efficient method for direct gene deletion inSaccharomyces cerevisiae.Nucleic Acids Research.213329-3330.Winzeler E et al.1999.Functional Characterization of theSaccharomyces cerevisiae Genome by Gene Deletion and ParallelAnalysis.Science.285901-906.)。
實施例4.XC2964基因突變體的胞外蛋白酶活性檢測在NYGA培養基(每升中含蛋白腖5克、酵母粉5克、甘油20克，瓊脂15克，pH7.0)平板上加入終濃度為1％的脫脂牛乳，然後用牙籤點接野生型黃單胞菌、突變菌株於平板表面，28培養48小時，能產生胞外蛋白酶的菌株在周圍形成一水解脫脂牛乳的透明圈。結果表明，XC2964基因突變體水解蛋白質底物的能力下降，胞外蛋白酶活性明顯降低(見圖3)。證明XC2964基因與外泌蛋白酶的活性有關。
實施例5.XC2964基因突變體的致病性檢測實驗所用寄主植物為蘿蔔苗(種名為Raphanus sativus L.var.radiculus Pers.)，所用的接種方法為剪葉法。XC2964基因缺失突變體和野生型菌株在28下進行液體培養，15-18個小時。用稀釋到OD600＝0.2，用滅過菌的剪刀在菌液浸泡5秒鐘後，在健康葉片距葉尖1-2cm垂直葉脈的方向剪到中軸處，停留5秒鐘，被接種的植物在25-30培養一周後觀察結果，正對照選用野油菜黃單胞菌野生型8004菌株，負對照用清水。致病試驗表明，XC2964基因的Tn5gusA5插入突變體和缺失突變體的致病性顯著降低(見圖4)。證實XC2964基因與野油菜黃單胞菌的致病性有關。
參考文獻1.Barber CE et al.1997.A novel regulatory system required forpathogenicity of Xanthomonas campestris is mediated by a smalldiffusible signal molecule.Mol.Microbiol 24555-5662.Bonas U et al.1999.Gene-for-gene interact ionsbacterialavirulence proteins specify plant disease resistance.Curr.Opinion in Microbiology 294~983.Dow M et al.2000a.Xylella genomics and bacterial pathogenicityto plants.Yeast 17263~271.
4.Dow M et al.2000b.The induction and modulation of plant defenseresistanses by bacterial lipopolysaccharides.Annu RevPhytopathol 38241-261.
5.Hayward AC.1993.The hosts of Xanthomonas.InSwings G，CiveroloEL，editors.Xanthomonas.LondonChapman and Hall，pp.1-119.
6.He SY.1998.Type III protein secretion systems in plant andanimal pathogenic bacteria.Annu.Rev.Phytopathol.36363~3927.Hirsch PR et al.1984.A physical map of pPH1JI and pJB4JI.Plasmid.12139-141.
8.Liu YG et al.1995 Efficient isolation and mapping of Arabidopsisthaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlacedPCR.Plant J.8457-63.
9.Liu YN et al.1990.A multipurpose broad host range cloning vectorand its use to characterise an extracel lular protease gene ofXanthomonas campestris pathovar campestris.Mol GenGenet.220433-440.
10.Tang JL et al.1991.Genetic and molecular analysis of a clusterof rpf genes involved in positive regulation of synthesis ofextracellular enzymes and polysaccharide in Xanthomonascampestris pathovar campestris.Mol Gen Genet 226409-417.
11.Zha D et al.1998.Cloning of DNA sequences involved inexopolysaccharide synthesis of Xanthomonas campestris pv.campestris.Wei Sheng Wu Xue Bao.38251-255.
SEQUENCE LISTING110廣西大學120一種編碼肽基脯氨醯順反異構酶的基因130I0307501609170PatentIn version 3.12101211699212DNA213野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomons campestris pv.campestris)4001atgaagttgc gttcgatcgc ggtcgctgtg gcggccctgg ccctgacggg caatgcgctg 60gcccaggaca caacgtccga gaagggcaag ctgagctact actttggtta tgactacggc120aacaaccttg ccgagctcac cggacgtggt gaacagctgg atatcaactc ggtggtgaag180ggtctgcagg acgcctatgc caagaagcag ccggccatca ctgccgacca gctgaagccg240gccgtggaag cgttccagaa gcgtgagcag ggccgtgccc agcaggctaa ggccgagtac300gacaaggccg ctgccgccaa caagaccaag agcgatgcgt tcctggccaa gaacaagagc360accgctggcg tgcagacgct gccgagcggc gtgcagtacc gcgtgatcga agccggcaag420ggcgccaagc cgacccaggc cagcaccgtg caacttgaag tcgccggtcc gttccccttc480ggcgaccgcg agaaggcacg tcctgcgcag cagatcccgg ccatcaaggt cagcgaagtc540gagatgcagg ccatgcgcga tacgctgctg cagatgccgg ccggctccaa gtgggaagtg600accctgccgc cggaaaaggc ctatggtgcc gacccgcgta ccccgttccc gccgaacgtg660gctgtgcagt tcgagatcaa gctggtcagc gtcaagtaa 6992102211232212PRT213野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomons campestris pv.campestris)4002
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220
221promoter222(150)..(180)223
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acagtttcta gagccagcgc attgcccgtc ag 32210921132212DNA213人工序列4009acagttgtcg acgattgacc aggcccagtt gc 3權利要求
1.一種編碼肽基脯氨醯順反異構酶的基因，其特徵在於具有SEQ ID NO1的核苷酸序列或其同源序列。
2.權利要求1的基因，其中所述同源序列與SEQ ID NO1的核苷酸序列具有80％以上的同源性。
3.一種權利要求1的基因所編碼的蛋白質，其特徵在於具有SEQ ID NO2的胺基酸序列。
4.一種重組質粒，其特徵在於包含權利要求1所述的基因。
5.權利要求4所述的重組質粒，其是pXC2964，保藏號為CGMCC No.1055。
6.權利要求1所述的基因在植物病害防治中的應用。
全文摘要
本發明提供一種與黃單胞菌致病相關的新基因XC2964，其特徵在於具有SEQ ID NO1的核苷酸序列或其同源序列，其中所述同源序列與SED ID NO1的核苷酸序列具有80％以上同源性。該基因編碼肽基脯氨醯順反異構酶(SEQ ID NO2)，其由232個胺基酸組成。本發明主要涉及XC2964基因在植物病害防治中的應用。
文檔編號C12N15/63GK1624138SQ200310116880
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月1日 優先權日2003年12月1日
發明者唐紀良, 何勇強, 唐東階, 馮家勳, 陳保善, 韋梅良, 姜伯樂, 徐榮旗 申請人:廣西大學