用於治療視網膜疾病的試劑盒的製作方法

2023-06-16 09:54:06 2

用於治療視網膜疾病的試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了用於治療視網膜疾病的試劑盒。本發明所提供的用於治療視網膜疾病試劑盒及藥物，其特徵在於：有效成分為可過表達RNA結合蛋白Lin28B的腺病毒。採用本發明所提供的試劑盒治療視網膜疾病時，不需要多次注射，經視網膜下腔注射可以最大化地激活視網膜內源性幹細胞，並促進內源性幹細胞分化為視網膜神經元。
【專利說明】用於治療視網膜疾病的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學分子生物學領域，尤其涉及用於治療視網膜疾病的試劑盒。
【背景技術】
[0002]任何影響視網膜正常功能所造成的眼部疾病被稱為視網膜疾病，如視網膜色素變性(RP)、其它遺傳性視網膜變性、糖尿病視網膜病(DR)、視網膜血管閉塞、視網膜脫離、視網膜撕裂、年齡相關性黃斑變性(AMD)等。這些疾病都可以影響視覺信息的處理，並明顯影響到病人的視功能，嚴重的則可以導致視盲。其中，溼性和乾性年齡相關性黃斑變性是造成發達國家老年人視盲的首要原因，是由視網膜色素上皮細胞(RPE)功能失調引起。此外，RP代表的遺傳性視網膜變性，以光感受器細胞和RPE的破壞為主要病變特點、視盲為結局。與中樞神經系統疾病類似，由視網膜或視神經變性疾病引起的視盲，尚無有效治療手段。然而，近年來伴隨幹細胞研究的興起，幹細胞移植使視網膜再生及功能重建已成為研究熱點。這一策略代表了全新的治療選擇，為盲人重見光明帶來了希望，具有廣泛的應用前景。幹細胞移植治療分別包括了外源性幹細胞移植治療與內源性幹細胞激活治療兩種策略。
[0003]但是，在我們前期分別利用視網膜色素上皮細胞(RPE)、視網膜前體幹細胞(RPC)的移植研究中，我們首先發現外源性的幹細胞在進入新的微環境(niche)中缺乏維持其自我更新的能力，從而在數量上難以達到修復病損視網膜的目的；其次，外源性幹細胞的來源、免疫排斥、遷移分化及與宿主細胞整合的不確定性等一直是外源性幹細胞治療中難以解決的問題。這些因素都極大地制約了外源性幹細胞移植的臨床治療應用。
[0004]激活內源性幹細 胞並使之定向分化是視網膜疾病治療的發展方向。1985年，學者Sarthy發現哺乳動物視網膜損傷後MUller細胞重新進入細胞周期，並且體外也能存活。2003年，Fischer&Reh用NMDA (N-甲基-D-天冬氨酸受體)特異性損傷視網膜內核層細胞，隨後內核層有大量細胞增殖，這些增殖的細胞表達MUller細胞特異性標記物穀氨醯胺合成酶(glutamine synthetase, GS)及視網膜祖細胞標記,如bHLH轉錄因子CASH-1,同源轉錄因子PAX6和CHX10，表明這些具有祖細胞特性的細胞源於MUller細胞，意即在哺乳動物視網膜的MUller細胞中確實包含了一定數量的幹細胞。但是在哺乳動物視網膜中，Milller細胞在正常情況下無法重新進入細胞周期開始逆分化，只有在一些急性損傷的情況下，如:應用NMDA造成小鼠視網膜神經節細胞和無長突細胞死亡、應用MNU造成大鼠視網膜光感受器細胞死亡或是應用雷射造成小鼠視網膜急性損傷後，少數視網膜MUller細胞可重新進入細胞周期並逆分化為視網膜前體細胞。此外，我們也對慢性視網膜色素變性(RCS大鼠)病變過程中MUller細胞的逆分化進行了詳盡的研究並發現:儘管內源性幹細胞可以被激活、逆分化，但是這個過程是一個瞬時即逝的，同樣，病變、缺損部位很快被膠質瘢痕所填補。理論上，幹/祖細胞可以源源不斷的增生，並且在正確信號的刺激下，幹/祖細胞可以分化為各種類型的細胞；然而，實際上這種自發的再生根本不足以修復受損視網膜的結構與功能，而是以膠質瘢痕為結局。
[0005]因此，如果希望將內源性幹/祖細胞活化的特性應用於臨床，必須增強內源性幹細胞的活化。研究者發現，多種生長因子或細胞因子，如胰島素(insulin)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)，膠質源性生長因子(⑶NF)，或腦源性神經營養因子(BDNF)能刺激Milller細胞重新進入分裂周期和去分化，其中部分細胞分化為無長突細胞，表達無長突細胞特異性標誌物鈣視網膜蛋白(Calretinin)，NeuN, Proxl和GAD67-GFP等。在我們的前期實驗中，我們將BDNF注射進入視網膜下腔或將BDNF與視網膜幹細胞聯合注入視網膜下腔，結果顯示:BDNF不僅可以延長對內源性幹細胞的激活時間，而且延長了供體幹細胞在宿主的存活時間。
[0006]但是，這類方法的缺點在於:外源性營養性因子的作用是短暫的，若反覆視網膜下腔或玻璃體腔內注射，易造成眼內感染，嚴重的如視網膜感染、脫離等併發症，且挽救的光感受器是否還有功能，還是個問題。
[0007]MircoRNA是近來發現並已經成為研究熱點的一類重要的非編碼RNA，它參與了發育、壽命、細胞增殖、分化、信號通路、凋亡、新陳代謝和應激反應等多種基礎生物進程，因此在幹細胞的更新分化、體細胞性狀與數量的維持、甚至腫瘤細胞的惡性增生等生物學過程中都具有重要的調控作用。MircoRNA通過與靶位點結合，快速有效地降解靶基因mRNA或抑制靶蛋白的翻譯。為了明確有效的內源性幹細胞激活調控因子，我們利用MircoRNA晶片，分析並比較了視網膜色素變性(RCS)大鼠與其對照大鼠間的差異MircoRNA表達。基因晶片篩查結果發現，出生後15天或30天的RCS大鼠變性早期(P15，P30)其Let-7Mirc0RNA家族分子Let-7C、Let-7e和Let_7i較對照組大鼠表達增加，特別是Let_7e和Let_7i分別增加了 4和12倍。我們的原位雜交也證實了這一結果。提示:Let-7e和Let_7i的高表達可能阻礙了視網膜變性早期MUller細胞的去分化和增殖。
[0008]Let-7家族是一種重要的miRNA調控子。其基因組有多種序列。人類有13種前體序列，最終形成10種成熟序列。各研究已證實Let-7家族中各成員在不同的細胞有不同的功能。雖然其具體功能不詳，但它們能調控細胞周期進程和細胞增殖。受到調控的基因包括細胞命運決定基因、致癌基因和細胞周期調控子。Let-7基因敲除或低表達能刺激細胞周期、DNA合成和細胞分裂。斑馬魚視網膜損傷後，Let-7a和Let_7f miRNA表達降低，Milller細胞去分化為祖細胞，促進視網膜再生和修復。此外，Let-7家族是高度失調的miRNA。RNA結合蛋白Lin28是Let-7家族的上遊分子,通過結合到Let_7miRNA前體分子結構域末端，從而阻礙Let-7miRNA的轉錄並抑制其活性。Lin28有兩個同源亞型，序列和結構高度保守，對Let-7家族都能選擇性抑制。

【發明內容】

[0009]在本發明中發現，與對照大鼠相比，RCS大鼠Lin28A的表達不僅沒有降低，反而略有升高；相反，Lin28B的表達僅在RCS大鼠剛睜眼時(P15)有升高，此後明顯降低。RT-PCR證實，Lin28B表達較對照組增加，隨後明顯降低。這提示:在哺乳動物視網膜內Lin28B (而不是Lin28A)對Let-7家族的Let7e和Let7i具有負性調控作用。
[0010]根據以上發現，本發明提供一種用於治療視網膜疾病的試劑盒，其特徵在於:包括可過表達RNA結合蛋白Lin28B的腺病毒。
[0011]所述腺病毒的製備方法製備過程如下:
[0012] (I)構建穿梭質粒 pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG ；[0013](2)將穿梭質粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG與腺病毒基因組質粒pBHGlox Δ El, 3Cre共轉染HEK293細胞，包裝產生所述腺病毒。
[0014]所述試劑盒還包含用於懸浮所述腺病毒的緩衝液，所述緩衝液的配方為:30g蔗糖，8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4, IL ddH20, PH 值為 7.4。
[0015]本發明的另一目的是提供一種治療視網膜疾病的藥物，其有效成分為:可過表達RNA結合蛋白Lin28B的腺病毒。
[0016]所述腺病毒為:將穿梭質粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG與腺病毒基因組質粒pBHGlox Δ El, 3Cre共轉染HEK293細胞，包裝產生所得。
[0017]所述藥物為懸浮劑，懸浮劑為所述腺病毒懸浮於緩衝液中，所述緩衝液的配方為:30g 蔗糖，8g NaCl,0.2g KCl，1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4, IL ddH20, PH 值為 7.4。
[0018]為了避免多種生長因子或細胞因子短暫的作用以及由於反覆玻璃體腔內注射造成視網膜感染、脫離等併發症，本發明構建了 Lin28B過表達腺病毒，經視網膜下腔注射可以最大化地激活視網膜內源性幹細胞，不需要多次注射。本發明優勢是:
[0019](I)因為短暫關閉或者開放信號通路傳導是調控MUller細胞增殖去分化的一種新的重要方式。當視網膜下腔注射Adeno/Lin28B腺病毒後，可短暫地開放Lin28B所控制的信號傳導通路。
[0020](2)視網膜再生需要MUller細胞去分化後再橫向分化。與腺相關病毒AAV或慢病毒不同，腺病毒不整合到宿主基因組，不會長期持續表達，因此感染的MUller細胞短暫去分化後可以隨即轉分 化為視網膜神經元，而不是維持在幹細胞狀態。如果MUller細胞始終處於幹細胞/祖細胞狀態，則會引起功能性Kir通道下調，膜去極化，碳酸酐酶和CRALBP下調，GS下調引起穀氨酸清除障礙，破壞膠質-神經元相互作用，以及酸鹼、離子、滲透壓平衡，導致細胞水腫，穀氨酸中毒，神經元過度興奮，最終引起神經元變性。
[0021 ] (3 )體外研究發現Lin28A和Lin28B持續過表達作用類似於原癌基因，可引起細胞惡變。而短暫的Lin28B表達可以避免細胞惡變。
[0022](4)腺病毒載體已經成為各類細胞短期基因表達的重要工具。它的優勢還包括製備容易，滴度高，在休眠和活化細胞均能高效轉染，短期基因表達水平高，而不整合到基因組引起突變。
[0023]在本發明的研究中，我們以Ad/GFP作為對照、分別以培養的MU11 er細胞(體外實驗)和RCS大鼠為模型(體內實驗)，觀察了 Lin28B對MUller細胞的作用。通過一系列體內、外實驗證實我們的假說——RNA結合蛋白Lin28B可以最大化地激活Milller細胞增生、逆分化反應並促進逆分化的MUller橫向分化為視網膜神經元。
[0024]術語界定:
[0025]Mo1:本領域中moi有多種理解，本發明中採用的術語moi理解為:感染複數，它是一個比值，含義是感染時病毒顆粒與細胞數目的比值)
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為體外MUller細胞感染Ad/Lin28B後細胞的增殖情況。
[0027]圖2為體外MUller細胞感染Ad/Lin28B後細胞自我更新能力分析結果。
[0028]圖3為體外MUller細胞感染Ad/Lin28B後的流式細胞周期分析結果。[0029]圖4為體外MUller細胞感染Ad/Lin28B後幹細胞標記的表達情況。
[0030]圖5為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後Let7e的表達情況。
[0031]其中ONL (視網膜外核層，outer nuclear layer), OPL (視網膜外網層，outerplexiform layer), INL (視網膜內核層，inner nuclear layer), IPL (視網膜內網層，innerplexiform layer)和 GCL (視網膜節細胞層，ganglion cell layer)
[0032]圖6為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後Let7i的表達情況。
[0033]圖7為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後BrdU陽性細胞數量分析結果。
[0034]圖8為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後幹細胞標記PAX6的表達情況。
[0035]圖9為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後幹細胞標記S0X2的表達情況。
[0036]圖10為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後幹細胞標記Nestin的表達情況。
[0037]圖11為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後幹細胞標記CHX10的表達情況。
[0038]圖12 為體內 MUller 細胞感染 Ad/Lin28B 後 S0X2, Nestin, CHX10, BrdU, PAX6 陽性細胞數量的定量分析結果。
[0039]圖13為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後錐杆同源框蛋白(Crx)的表達情況。
[0040]圖14為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後視蛋白(opsin)的表達情況。
[0041]圖15為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後視網膜紫質(rhodopsin)的表達情況。
[0042]圖16為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後感光細胞特異性結合蛋白(recoverin)的表達情況。
[0043]圖17為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後蛋白激酶Ca (PKCa)的表達情況。
[0044]圖18為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後鈣結合蛋白(calbindin)的表達情況。
[0045]圖19為體內MUller細胞感染Ad/Lin28B後GFAP的表達情況。
[0046]圖20為體內注射Ad/Lin28B後RCS大鼠視功能的改善情況。
[0047]其中Lin28B意為此眼視網膜下腔注射腺病毒Adeno/Lin28B, Control意為此眼視網膜下腔注射對照腺病毒Adeno/GFP。Lin28B_2w，Lin28B_4w和Lin28B_6w分別為感染Adeno/Lin28B 後的 2 周，4 周和 6 周。Control_2w,Control_4w 和 Control_6w 分別為感染對照腺病毒Adeno/GFP後的2周,4周和6周。
[0048]圖21.腺病毒穿梭載體pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG的製備流程
[0049]圖22pAV-MCMV_GFP-3FLAG 載體線性化圖譜
[0050]圖23PCR擴增目的片段凝膠電泳圖譜
[0051]DL2, 000DNA Marker:2kb, 1Kb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp
[0052]圖24pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG 的菌落陽性鑑定圖
[0053]其中:I.陰性對照(H2O )，
[0054]2.陰性對照(空載體)，
[0055]3.DL2, 000DNA Marker:2kb, 1Kb, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp4_ll 挑取的 8 個轉化子。
【具體實施方式】
[0056]實施例1、過表達RNA結合蛋白Lin28B的重組腺病毒的製備製備
[0057] 步驟(1)製備Lin28B編碼基因[0058]人Lin28B 編碼基因序列:(GenBank:DQ127228.1)
[0059]大鼠Lin28B 編碼基因序列:(NCBI Reference Sequence:ΧΜ_001069344.2)
[0060]步驟(2)製備腺病毒穿梭載體pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG
[0061]包括以下主要步驟:
[0062]以化學合成的LIN28B基因為模板PCR擴增目的基因。
[0063]表達載體酶切後進行膠回收載體片段。
[0064]目的基因與載體片段同源重組後轉化E.coli感受態細胞。
[0065]用菌落PCR鑑定轉化子，陽性克隆送測序，測序驗證無誤的為腺病毒穿梭載體pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG。克隆進行質粒抽提。
[0066]實驗流程如圖21，詳述如下:
[0067]實驗材料描述:
[0068]試劑
[0069]
【權利要求】
1.一種用於治療視網膜疾病的試劑盒，其特徵在於:包括可過表達RNA結合蛋白Lin28B的腺病毒。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，所述腺病毒由以下製備方法製備而得: (1)構建穿梭質粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG ； (2)將穿梭質粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG 與腺病毒基因組質粒 pBHGlox Δ El, 3Cre共轉染HEK293細胞，包裝產生而得。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，還包含用於懸浮所述腺病毒的緩衝液，所述緩衝液的配方為:30g 蔗糖，8g NaCl, 0.2g KCl，1.44g Na2HP04,0.24g KH2P04, IL ddH20, PH 值為.7.4。
4.一種治療視網膜疾病的藥物，其有效成分為:可過表達RNA結合蛋白Lin28B的腺病毒。
5.根據權利要求4所述的藥物，所述腺病毒為:將穿梭質粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG 與腺病毒基因組質粒 pBHG 1x Λ El, 3Cre 共轉染 HEK293 細胞，包裝產生所得。
6.根據權利要求4或5所述的藥物，所述藥物為懸浮劑，懸浮劑為所述腺病毒懸浮於緩衝液中，所述緩衝液的配方為:30g 蔗糖，8g NaCl,0.2g KCl，1.44g Na2HP04,0.24g KH2P04，IL ddH20, PH 值為 7.4。
【文檔編號】A61K9/10GK104017777SQ201410007027
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年1月7日 優先權日:2014年1月7日
【發明者】李瑤琛, 陰正勤 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院