抗ox40抗體和使用其的方法

2023-06-16 06:43:41 2

專利名稱：抗ox40抗體和使用其的方法
技術領域：
本發明通常涉及0X40受體活化的調節，以及更具體地，涉及調節0X40受體以抑制產生白介素IO(IL-1O)的⑶4+1型調節性T細胞(「Trl細胞」)和表達Foxp3+的調節性T細胞(本文中有時也稱為「FoXp3+T-reg」細胞)的免疫抑制功能以及從CD4+細胞或初始細胞產生Trl細胞和IL-10生產。
_2] 相關申請的交叉引用 本申請要求2010年8月23號提交的美國專利申請序列第61/375，999號和2010年9月8日提交的美國專利申請序列第61/380，827號的優先權。這兩個申請通過引用併入本文。
_4] 關於聯邦政府資助的研究或研發的聲明本申請在美國國立衛生研究院授予的ROl A1061645-0UR01 A1062888-01和U19A1071130-01的政府支持下進行。政府在本發明中享有一定的權利。聯合研究協議參與方的名稱無。對序列表的引用本發明內容包括作為於2011 年8月23號生成的名為sequence listing, txt的根據37C.F.R.§ 1.52(e) (v)的文本文檔提交的序列表，具有13，836位元組大小，其通過引用併入本文。所附的序列描述和序列表符合如37C.F.R.§ § 1.821-1.825中所闡述的適用於專利申請中核苷酸和/或胺基酸序列公開的法則。序列表包含如符合Nucleic AcidsRes.13:3021-3030(1985)和 the Biochemical J.219 (N0.2):345-373(1984)中描述的IUPAC-1UBMB標準所定義的用於核苷酸序列字符的單字母代碼和用於胺基酸的三字母代碼。用於核苷酸和胺基酸序列信息的符號和格式符合37C.F.R.§ 1.822中闡述的法則。
背景技術：
Trl細胞在外周耐受中具有關鍵作用。Trl細胞在於炎性免疫響應期間將組織損傷限制於宿主中特別重要。Trl細胞的產生伴隨體內和體外THl和TH2免疫響應。Trl細胞在抗原驅動的T細胞免疫響應期間從初始⑶4+T細胞生成。Trl在對經由TCR、CD28和IL-2受體的信號傳導的響應中是無變應性的並且具有抑制抗原驅動的初始CD4+T細胞體內和體外增殖的能力。Trl細胞具有抑制自身免疫疾病的發展並限制對微生物病原體的免疫響應的等級的能力。儘管已經研究了導致Trl細胞的分子信號，但關於反向調節這些細胞生成的分子信號所知甚少。儘管免疫抑制藥物、細胞活素類、共刺激分子和DC已經牽涉於Trl細胞的誘導中，但反向調節Trl細胞的信號仍然是難以捉摸的。

發明內容
0X40受體的活化阻斷Trl從初始或記憶⑶4+T細胞產生以及IL-10從Trl細胞生成和Trl細胞的免疫抑制功能。0X40受體的活化還阻斷IL-10經由FoXp3+T-reg細胞產生和免疫抑制功能。像這樣，本文給出的是與0X40受體結合的激動劑抗體，由此所述激動劑調節0X40受體的活化以阻斷IL-10細胞因子分泌和/或Trl和FoXp3+T-reg細胞全部免疫抑制功能。基本上，抗體可模擬0X40配體並且觸發Trl和/或初始T調節性細胞(「nTreg」 )，也稱為 「Foxp3+T_reg」，上的 0X40 受體。如我們在共同未決專利申請美國序列第11/659，266和12/861，135號中所示，0X40L抑制由免疫抑制藥物地塞米松和維他命D3誘導的產生IL-10的Trl細胞從初始和記憶⑶4+T細胞的生成和功能。我們發現0X40L抑制產生IL-10的調節性T細胞的生成和功能。這些發現證實經由0X40L的信號傳導0X40L抑制培養中產生人類IL-10的免疫抑制T細胞的產生。0X40L的這一獨有的功能未被兩個另外的共刺激TNF家族成員，GITR-配體和4-1BB-配體，所共有。0X40L還強烈抑制由可誘導的共刺激配體和不成熟DC提供的兩種生理刺激誘導的產生IL-10的Trl細胞的產生和功能。經由單克隆抗體、小分子或者經由0X40L或與其具有至少90百分比同源性的蛋白信號傳導人類T細胞上的0X40受體調節和控制產生IL-10的免疫抑制T細胞的產生和功能。所述發現帶來多個治療應用。例如，激動型抗體、小分子或0X40L可被用於抑制產生IL-10的免疫抑制T細胞的產生和功能並因此可被用於增強免疫響應以治療癌症和傳染病或者作為癌症疫苗的佐劑。0X40或0X40L的拮抗型抗體或拮抗型小分子可備用增強產生IL-10的免疫抑制T細胞的產生和功能並因此可被用於自身免疫性疾病和移植物抗宿主疾病的療法的開發。我們的發現還為用於癌症或可選擇地自身免疫疾病和移植物抗宿主疾病的治療上文開發提供篩選活化T細胞上0X40受體(或反向阻斷0X40信號傳導)的抗體或小分子的高通量方法。本文提供結合人0X40受體的單克隆抗體和人抗體(本文有時稱為「抗0X40抗體」和/或其另外的變化形式)。這些抗體被用於治療或預防其病理涉及0X40的急性或慢性疾病或病況。在一個方面，描述了與人0X40結合併作為癌症治療或抗自身免疫疾病治療有效的分離的人抗體或其抗原結合片段。本文公開的抗0X40抗體中的任一個可被用作藥物。抗0X40抗體中的任一 個或多個可被用於治療本文描述的多種癌症或自身免疫疾病中的一種或多種。本文提供結合0X40的分離的人源化抗體。本文描述的分離的抗體與0X40結合併且可與來自下列基因編碼的0X40結合:NCBI登錄號NP_003317、Genp印t登錄號P23510或與其具有90百分比同源性的基因。本文提供的分離的抗體還與具有下列GenBank登錄號中的一個的 0X40 受體結合:AAB39944、CAE11757 或 AA105071。如本文教導的，示例性的是與0X40結合的分離的抗體，其包含:(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:1的重鏈可變區CDRl ； (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:2的重鏈可變區CDR2 ；(c)包含胺基酸序列SEQ ID N0.3的重鏈可變區⑶R3 ； (d)包含胺基酸序列SEQ ID N0.7的輕鏈可變區⑶Rl ； (e)包含胺基酸序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變區⑶R2 ;和(f)包含胺基酸序列SEQ ID N0.9的輕鏈可變區⑶R3。而且，另一個實例是與0X40結合的分離的抗體，其包含:(a)包含胺基酸序列SEQID NO:13的重鏈可變區CDRl ； (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:14的重鏈可變區CDR2 ； (c)包含胺基酸序列SEQ ID N0.15的重鏈可變區CDR3 ； (d)包含胺基酸序列SEQ ID N0.19的輕鏈可變區⑶Rl ； (e)包含胺基酸序列SEQ ID N0.20的輕鏈可變區⑶R2 ;和(f)包含胺基酸序列SEQ ID N0.21的輕鏈可變區CDR3。可選擇地，分離的抗體可具有包含胺基酸序列SEQ ID NO:1或13的重鏈可變區⑶Rl ;包含胺基酸序列SEQ ID NO:2或14的重鏈可變區⑶R2和/或包含胺基酸序列SEQID NO:3或15的重鏈可變區⑶R3，或與其具有90百分比同源性的重鏈可變區⑶R。此外，分離的抗體可具有包含胺基酸序列SEQ ID NO:7或19的輕鏈可變區⑶Rl ；包含胺基酸序列SEQ ID NO:8或20的輕鏈可變區⑶R2和/或包含胺基酸序列SEQ ID NO:9或21的輕鏈可變區CDR3或與其具有90百分比同源性的重鏈可變區。所述分離的抗體可具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10、11、22或23或者與胺基酸序列SEQ ID NO:10、11、22或23具有90百分比同源性的胺基酸序列的輕鏈可變區(「VL」)。所述分離的抗體可具有包含胺基酸序列SEQ ID NO:4、5、16和17或者與胺基酸序列SEQ IDN0:4、5、16和17具有90百分比同源性的胺基酸序列的重鏈可變區(「VH」)。像這樣，作為一個實例，分離的抗體可包含SEQ ID NO: 5的可變重鏈序列和SEQ ID N0:11的可變輕鏈序列或與其具有90百分比同源性的序列。相似地，分離的抗體可具有SEQ ID N0:17的可變重鏈序列和SEQ ID NO:23的 可變輕鏈序列或與其具有90百分比同源性的序列。所述分離的抗體可具有由核酸序列SEQ ID NO: 12或24或與核酸序列SEQ ID NO:12或24具有90百分比同一性的核酸序列編碼的可變輕鏈。所述分離的抗體可具有由核酸序列SEQ ID NO:6或18或與核酸序列SEQ ID NO:6或18具有90百分比同一性的核酸序列編碼的可變重鏈。本文還提供單克隆抗體。所述單克隆抗體可具有包含胺基酸序列SEQ ID N0:10或22或與胺基酸序列SEQ ID NO:10或22的胺基酸序列具有至少90百分比的胺基酸序列的可變輕鏈。本文還提供具有包含胺基酸序列SEQ ID NO:4或16或與胺基酸序列SEQ IDNO:4或16具有至少90百分比的胺基酸序列的可變重鏈的單克隆抗體。本文還提供編碼本文教導的抗0X40抗體中的任一種的分離的核酸。本文還提供的是宿主細胞，其每個包含編碼本文描述的抗0X40抗體中的任一種的分離的核酸。進一步提供生產抗體(例如包含編碼本文描述的抗0X40抗體中的任一種的分離的核酸的宿主細胞)的方法，其包括培養所述宿主細胞以便生產抗體和/或從所述宿主細胞回收所述抗體。


上文簡要概括的本發明的更具體的描述可通過參照在形成本說明書一部分的附圖中說明的其實施方案來完成，因此上文列舉的本發明的特徵、方面和優點以及其他將以變得清楚的方式獲得並被更詳細地理解，。然而應注意的是

本發明的某些實施方案但並不因此被認為限制本發明的範圍，因為本發明可允許其他相當的有效實施方案。圖1顯示浸潤人類濾泡性淋巴瘤(FL)組織並與腫瘤B細胞和單核細胞共定位的F0XP3+Treg。左邊:F0XP3+Treg(紅色)和⑶20+B淋巴瘤細胞(綠色)的雙重免疫染色；右邊:F0XP3+Treg (紅色)和⑶IIc+單核細胞/巨噬細胞/DC (綠色)。圖2A和2B患有FL的患者中增加數目的⑶4+F0XP3+Treg。從處於治療前的初次診斷的六個患有FL的患者獲得腫瘤細胞和PBMC。還從六個正常供體獲得PBMC用於比較。調節性T細胞佔全部⑶4+T細胞的百分比通過⑶4+⑶25+CD127ffiF0XP3+Treg的流式細胞計數分析來確定。圖2A顯示Treg的代表性FACS分析。FL PBMC和FL腫瘤細胞來源於相同的患者。圖2B顯示所有供體的Treg百分比。單劃線表示平均值。圖3顯示從FL分離IC0S+F0XP3+或IC0S_F0XP3+Treg。從未進行任何治療的脾樣本獲得單細胞懸浮液。在測定當天將細胞解凍。將富集的⑶4+CD8TD14_CD16TD56TDllc_TCR Y δΤ細胞分為⑶25<￡和⑶25*亞類。將⑶4+⑶25*F0XP3+Treg根據ICOS的表面表達進一步分選為ICOS*和ICOSffi亞類。在所有亞類中確定F0XP3的細胞內表達。
圖4顯示瘤內Treg抑制FL中浸潤⑶4+⑶25_T細胞的增殖並且所述抑制可被抗IL-10中和抗體部分阻斷。用通過重組CD40L預活化的自體腫瘤細胞在自體IC0S+F0XP3+Treg或IC0ST0XP3+Treg或抗IL-10 (10 μ g/ml)存在或不存在的情況下培養浸潤CFSE標記的⑶4+⑶25_腫瘤的T細胞。培養72小時後，通過CFSE稀釋法的流式細胞計數分析確定⑶4+⑶25_細胞的增殖。圖5A顯示根據本發明的方法的實施方案如流式細胞計數所確定的初始CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。圖5B顯示根據本發明的方法的實施方案如ELISA所確定的初始CD4+T細胞的細胞因子產生。圖5C顯示通過根據本發明的方法的實施方案的如[3H]胸腺嘧啶核苷摻入所確定的生產IL-10的Trl細胞的抑制功能。圖6A顯示根據本發明的方法的實施方案的如流式細胞計數所確定的記憶CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。圖6B顯示根據本發明的方法的實施方案的如ELISA所確定的記憶CD4+T細胞的IL-10產生。圖7A顯示根據本發明的方法的實施方案的如流式細胞計數所確定的初始CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。圖7B顯示根據本發明的方法的實施方案的如ELISA所確定的初始CD4+T細胞的IL-10產生。圖7C顯示根據本發明的方法的實施方案計數的可見T細胞的數目。圖8A顯示根據本發明的方法的實施方案的如流式細胞計數所確定的初始CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。圖8B顯示根據本發明的方法的實施方案的如ELISA所確定的初始⑶4+T細胞的IL-10產生。圖SC顯示根據本發明的方法的實施方案的如流式細胞計數所確定的記憶CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。圖8D顯示根據本發明的方法的實施方案的如ELISA所確定的記憶⑶4+T細胞的IL-10產生。圖SE顯示根據本發明的方法的實施方案的如流式細胞計數所確定的初始CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。圖8F顯示根據本發明的方法的實施方案的如ELISA所確定的初始⑶4+T細胞的IL-10產生。圖9顯示根據本發明的方法的實施方案的如ELISA所確定的調節性T細胞的IL-1O產生。圖10顯示如ELISA所確定的抗L-0X40的抗人類0X40雜交瘤上清液對比L親本細胞的篩選結果。圖11顯示根據本發明的方法的實施方案的如流式細胞計數分析所確定的人0X40特異性單克隆抗體的篩選。圖12顯示使用根據本發明的方法的實施方案的使用表達0X40的SUPM2細胞(SUPM2-0X40)確認抗h0X40單克隆抗體特異性。圖13由顯示根據本發明的方法的實施方案的可抑制從vit D3(O-1yM)/Dex (50nm)、CD32L/IC0SL 和抗 CD3/CD28 (0.2 μ g/ml)的刺激的 CD4+T 細胞生成產生 IL-10的細胞(Trl)的0X40特異性單克隆抗體。代表性的螢光活化細胞分選(FACS)數據示於A而產生IL-10的細胞佔0X40單克隆抗體處理的百分比示於B中。圖14顯示根據本發明的方法的實施方案的抑制Trl細胞生成同時刺激⑶4+T細胞增殖的h0X40特異性單克隆抗體的結果。圖15A、15B和15C詳述根據本發明的方法的實施方案的對0X40單克隆抗體抑制Trl細胞從⑶4+T細胞生成的能力的滴定。代表性的FACS數據示於圖15A而用九種0X40單克隆抗體處理後Trl細胞的百分比示於圖15B。圖16A、16B和16C顯示抑制從⑶4+T細胞生成產生IL-10的Trl細胞還抑制IC0S+CD4+⑶25*⑶127—Treg的IL-10生產和免疫抑制功能的0X40特異性單克隆抗體。將新鮮分選的 Icos+CDfCDZssCDUT-Treg(Cos+Treg)用抗 CD3 (0.2 μ g/ml)在 CD32L/IC0SL 細胞和CD32L/0X40L細胞(圖16A)或0X40單克隆抗體或對照抗體(圖16B)存在的情況下刺激5天。之後將細胞用抗⑶3/⑶28再刺激24小時並且通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定上清液的IL-10。 圖16是基於單核細胞的增殖測定，顯示抗體中的兩種阻斷ICOS+Treg功能。圖17A^P 17Β顯示根據本發明的方法的實施方案的抑制Trl細胞生成並且阻斷F0XP3+CD4+CD25sTreg功能的抗h0X40單克隆抗體的鑑定，代表性的流式細胞計數分析示於圖17A。六種單克隆抗體的數據示於圖17B。圖18證實根據本發明的方法的實施方案的不抑制Trl細胞生成但阻斷F0XP3+CD4+ra25*Treg功能的抗h0X40單克隆抗體的鑑定。圖19A和19B顯示根據本發明的方法的實施方案的阻斷淋巴瘤來源的⑶4+⑶25sTreg功能的抗h0X40激動型抗體。代表性的FACS分析示於圖19A中而所有實驗的數據示於圖19B中。圖20顯示抗h0X40單克隆抗體可結合獼猴⑶4+T細胞。如所示的，抗h0X40mAb中的六種可結合獼猴活化的CD4+T細胞並與獼猴0X40結合併活化0X40信號傳導。圖21顯示實施例1中的HU106-222批次I和II抗體中的每一種由具有約50kD分子量的重鏈和約25kD分子量的輕鏈組成。HU106-222批次I和II抗體的純度顯示高於95%。圖22顯示小鼠106-122、Ch106和Hul06_222(批次II)抗體結合L/0X40細胞的分析(實施例1)。圖23描繪Hul06 IgGl/ κ抗體的表達載體(Expression Vector)的圖示結構。從頂部的Sail位點順時針前進，質粒含有從人巨細胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子和增強子(CMV啟動子)開始的重鏈轉錄單元以起始抗體重鏈基因的轉錄。CMV啟動子之後是VH外顯子、含有包括CH1、鉸鏈區、CH2和CH3外顯子以及插入的內含子的人Y _1重鏈恆定區的基因組序列以及CH3外顯子之後的多腺苷酸化位點。重鏈基因序列之後，輕鏈轉錄單元從CMV啟動子開始，之後是VL外顯子和內含有人κ鏈恆定區外顯子(CL)以及在其前面的部分內含子的基因組序列以及CL外顯子之後的多腺苷酸化位點。輕鏈基因之後是SV40早期啟動子(SV40啟動子)，大腸桿菌(E.coli)黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(gpt)和含有SV40多腺苷酸化位點的片段(SV40 poly(A)位點)。最後，質粒含有質粒pUC19的一部分，包含細菌的複製起點(pUC ori)和β內醯胺酶基因(β內醯胺酶)。相關限制性內切酶位點示於圖中。圖24顯示Hu 106-222批次I和II抗體之間結合L/0X40細胞的對比(下文實施例I)。圖25顯示Hull9-122由具有約50kD分子量的重鏈和具有約25kD分子量的輕鏈組成。Hul 19的純度顯示高於95% (下文實施例1I)。圖26顯示本文描述的Chl 19-122和Hul 19-122抗體的FACS分析的結果(下文實施例II)。圖27顯示人源化抗人0X40 mAb克隆119-122 (Hull9)及其結合FcR的突變抗體(Hull9-AA)增強初始⑶4+T細胞增殖。與親本小鼠抗人0X40mAb (小鼠119-122)相比Hull9-122產生較好的T細胞刺激活性。然而，嵌合的抗人0X40mAb(Chll9，小鼠VH和VL但是人Y-1和κ恆定區)未能增強T細胞增殖。圖28顯示結合FcR的突變人源化抗人0X40mAb克隆106-222 (Hu222AA)和嵌合的抗人0X40mAb克隆106-222 (Ch222)增強抗⑶3刺激的初始⑶4+T細胞增殖。這些抗體與親本小鼠抗人0X40mAb (小鼠222)相比具有相似的刺激活性。然而，完整的人源化抗人0X40Ab, Hu222，與人IgGl相比未增強T細胞增殖。圖29A和B顯示人源化的和小鼠抗人0X40mAb克隆119-122阻斷⑶4+Treg抑制性功能。圖30提供數據顯示抗人0X40抗體增強⑶4+和⑶8+T細胞增殖，使用板結合抗體。圖31顯示人源化和小鼠抗人0X40抗體需要交聯以便增強T細胞增殖。圖32顯示抗人0X40抗體阻斷⑶4+F0XP3+nTreg的活性，使用板結合抗體。圖33顯示高濃度的小鼠抗人0X40抗體優先殺死F0XP3+Treg。圖34顯示小鼠抗人0X40mAb直接作用於效應子T細胞或nTreg以阻斷Treg的抑制性功能。圖35A、35B和35C顯示小鼠中用h0X40+CD8+T細胞轉移的抗h0X40mAb腫瘤處理的結果。抗人0X40mAb促進體內T細胞擴展和存活。治療性疫苗接種時間表示於圖35A。體內代表性生物發光圖片示於圖35B。抗體腫瘤處理的結果示於圖35C。 圖36 顯示 106-222、人源化 106-222 (Hul06)以及人類受體 X61012 (GenBank 登錄號)VH序列的胺基酸序列的比對被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。序列上的數字表不根據 Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition，NIH Publication N0.91-3242, U.S.Department of Health and HumanServices, 1991)的定位。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而位點編號可能不同。在圖36中，由Kabat et al.(1991)定義的CDR序列是106-222VH中下劃線的。X61012 VH中CDR殘基在圖中被省略。在GenBank資料庫中搜索與106-222VH框架同源的人VH序列並將由人X61012 cDNA(X61012VH)編碼的VH序列選作人源化接受體。106-222VH的CDR序列首先被轉移至X61012VH的相應位點。之後在106-222可變區的三維模型顯示與⑶R明顯接觸的框架位點上，小鼠106-222 VH的胺基酸殘基取代為相應的人殘基。這些取代在位點46和94進行(Hul06 VH中下劃線的)。此外，發現在相應的V區亞組中不典型的人框架殘基被最典型的殘基取代以減少可能的免疫原性。這一取代在位點105進行(Hul06 VH中雙下劃線的)。圖37 顯示 106-222、人源化 106-222 (Hu106)以及人接受體 AJ388641 (GenBank 登錄號)VL序列的胺基酸序列的比對被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。序列上的數字表示根據Kabat et al.(1991)的定位。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而位點編號可能不同。由Kabat et al.(I)定義的CDR序列是106-222VH中下劃線的。AJ388641VL中⑶R殘基在圖中被省略。 在GenBank資料庫中搜索與106-222 VL框架同源的人VL序列並將由人AJ388641 cDNA(AJ388641 VL)編碼的VL序列選作人源化接受體。106-222 VL的CDR序列被轉移至AJ388641 VL的相應位點。在人源化形式中不進行框架取代。圖38顯示兩側為SpeI和HindIII位點(下劃線的)的Hul06 VH基因的核苷酸序列與推導出的胺基酸序列一起被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VH的N端胺基酸殘基(Q)是雙劃線的。根據Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而序列表中的位點編號可能不同。內含子序列為斜體。用SpeI和HindIII消化的Hul06 VH基因片段被克隆至圖23所示的表達載體中的相應位點之間。圖39顯示兩側為NheI和EcoRI位點(下劃線的)的Hul06 VH基因的核苷酸序列與推導出的胺基酸序列一起被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VL的N端胺基酸殘基(D)是雙劃線的。根據Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。內含子序列為斜體。用NheI和EcoRI消化的Hul06VL基因片段被克隆至圖23所示的表達載體中的相應位點之間。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而序列表中位點編號可能不同。圖40 顯示 119-122、人源化 119-122 (Hul 19)和人接受體 Z14189 (GenBank 登錄號)VH序列的胺基酸序列的比對被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。序列上的數字表示根據Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH Publication N0.91-3242,U.S.Department of Health and Human Services,1991)的定位。由Kabat et al.(1991)定義的CDR序列是119-122VH中下劃線的。Z14189 VH中⑶R殘基在圖中被省略。在GenBank資料庫中搜索與119-122 VH框架同源的人VH序列並將由人Z14189 cDNA(Z14189VH)編碼的VH序列選作人源化接受體。119-122 VH的CDR序列首先被轉移至Z14189 VH的相應位點。之後在119-122可變區的三維模型顯示與⑶R明顯接觸的框架位點上，小鼠119-122 VH的胺基酸殘基取代為相應的人殘基。這些取代在位點26、27、28、30和47進行(Hull9 VH中下劃線的)。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而序列表中位點編號可能不同。
圖41 顯示 119-122、人源化 119-122 (Hull9)和人類接受體 M29469 (GenBank 登錄號)VL序列的胺基酸序列的比對被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。序列上的數字表示根據 Kabat et al.(1991)定位。由 Kabat et al.(I)定義的 CDR 序列是 119-122 VH 中下劃線的。M29469 VL中⑶R殘基在序列中被省略。在GenBank資料庫中搜索與119-122VL框架同源的人VL序列並將由人M29469 cDNA(M29469 VL)編碼的VL序列選作人源化接受體。119-122 VL的⑶R序列被轉移至M29469 VL的相應位點。在人源化形式中不進行框架取代。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而序列表中位點編號可能不同。圖42顯示兩側為SpeI和HindIII位點(下劃線的)的Hull9 VH基因的核苷酸序列與推導出的胺基酸序列一起被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VH的N端胺基酸殘基(E)是雙劃線的。根據Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。內含子序列為斜體。用SpeI和HindIII消化的Hull9 VH基因片段被克隆至圖23所示的表達載體中的相應位點之間。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而序列表中位點編號可能不同。圖43顯示兩側為NheI和EcoRI位點(下劃線的)的Hull9 VL基因的核苷酸序列與推導出的胺基酸序列一起被顯示。胺基酸序列以單字母規則顯示。信號肽序列為斜體。成熟VL的N端胺基酸殘基(E)是雙劃線的。根據Kabat et al.(1991)定義的⑶R序列是下劃線的。內含子序列為斜體。用NheI和EcoRI消化的Hull9VL基因片段被克隆至圖23所示的表達載體中的相應位點之間。本文要求的相同序列同樣提供於序列表中而序列表中位點編號可能不同。
具體實施例方式術語「抗體」包括四個多肽鏈，通過二硫鍵內部連接的兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)，組成的免疫球蛋白分子。每個重鏈由重鏈可變區(本文簡稱為HCVR或VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。輕鏈由輕鏈可變區(本文簡稱為LCVR或VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈 恆定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可進一步分為超變區(稱為互補決定區(CDR))，其間散布更保守的區(稱為構架區(FR))。各VH和VL由三個⑶R和四個FR組成，從氨基末端至羧基末端的排列順序如下:FRUDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語抗體的「抗原結合部分」(或「抗體部分」)包括保持特異性結合抗原(例如h0X40)能力的抗體片段。曾經證實抗體的抗原結合功能可由全長抗體片段完成。屬於術語抗體的「抗原結合部分」的結合片段實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結構域組成的一價片段；(ii)F(ab』)2片段，包括通過鉸鏈區的二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)VH和CHl結構域組成的Fd片段；(iv)抗體單臂VL和VH結構城組成的Fv片段；(V)VH 結構域構成的 dAb 片段(Ward et al., (1989)Nature 341:544-546);以及(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的2個結構城VL和VH由獨立的基因編碼，但是它們可利用重組方法以合成連接體連接在一起，合成連接體使它們能夠被製成其中VL和VH區成對形成一價分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird etal.(1988) Science 242:423-426 ;和 Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。這種單鏈抗體也預期包括在術語抗體的「抗原結合部分」中。也包括其他形式的單鏈抗體例如雙體。雙體是雙價、雙特異性抗體，其中VH和VL結構域表達在單一多肽鏈上，但是採用太短而不能允許同一鏈上的所述兩個結構域成對的連接體，由此迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域成對，而產生2個抗原結合位點(參見例如Holliger,P.，et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.，et al.(1994)Structure 2:1121-1123)。進而,抗體或其抗原結合部分可以成為所述抗體或其抗原結合部分與一個或多個其他蛋白或肽通過共價或非共價結合形成的更大免疫粘附分子的一部分。這樣的免疫粘附分子的實例包括利用鏈黴抗生物素蛋白核心區製成四聚scFv分子(Kipriyanov, S.M., et al.(1995) Human Antibodies and Hybridomas6:93-101)以及利用半胱氨酸殘基、標記肽和C端多組氨酸標記製成雙價生物素化scFv分子(Kipriyanov，
S.M.,et al.(1994)Mol.1mmunol.31:1047-1058)。可採用常規技術例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體，由完整抗體製備諸如Fab和F(ab』)2片段的抗體部分。而且如本文所述，可採用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。優選的抗原結合部分是完整結構域或成對的完整結構域。0X40/0X40-配體(0X40受體)/ (0X40L)是對於T細胞增殖、存活、細胞因子產生和記憶細胞生成來說很關鍵的一對共刺激分子。在體外實驗中早就證實經由CD4+T細胞上的0X40的信號傳導導致TH2發育但不導致THl發育。這些結果得到體內研究的支持，其顯示阻斷0X40/0X40L相互作用防止TH2介導的變態免疫相應的誘導和維持。然而，阻斷0X40/0X40L相互作用改善或防止THl介導的疾病。而且，施用溶解的0X40L或將0X40L轉基因至腫瘤中顯示顯著增強小鼠中的抗腫瘤免疫性。最近的研究也顯示0X40/0X40L可在促進CD8T細胞介導的免疫響應中起作用。如本文所討論的，0X40信號傳導阻斷CD4+CD25+天然存在的調節性T細胞的抑制性功能並且0X40/0X40L對在外周免疫性對比耐受性的整體調控上起到關鍵作用。術語「 Kabat編號」、「 Kabat定義」和「 Kabat標記」在本文中可互換使用。本領域公知的這些術語是指將比抗體或其抗原結合部分的重鏈可變區和輕鏈可變區的其他胺基酸殘基更易變(即超變)的胺基酸殘基編號的系統(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad, Sc1.190:382-391 和 Kabat, E.A., et a l.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and HumanServices, NIH Publication N0.91-3242)。術語「重組人抗體」包括通過重組方法製備、表達、產生或分離的人抗體,例如利用轉染入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體(在以下部分II中進一步介紹)、從重組組合人抗體文庫分離的抗體(在以下部分III中進一步介紹)、從人免疫球蛋白基因轉基因動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如(Taylor, L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或者涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法製備、表達、產生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有人種系免疫球蛋白序列來源的可變區和恆定區(參見 Kabat, E.A., et al.(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication N0.91-3242)。「分離的抗體」包括基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如基本不含特異性結合非h0X40抗原的抗體的特異性結合h0X40的分離抗體)。特異性結合h0X40的分離抗體可結合其他物種的0X40分子。此外，分離抗體可基本不含其他細胞物質和/或化學物質。術語「活性」包括各種活性，例如抗體對抗原的結合特異性/親和性例如結合0X40抗原的抗人0X40抗體和/或抗體的活化效價例如其與h0X40受體的結合活化h0X40的生物活性的抗0X40抗體或人L/0X40細胞測定中結合的受體的活化。本文使用的術語「K.」預期是指抗體從抗體/抗原複合物解離的解離速率常數。本文使用的術語「Kd」預期是指特定抗體抗原相互作用的解離常數。
術語「表面等離子體共振」包括允許例如採用BIAcore系統(Pharmacia BiosensorAB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)通過檢測生物傳感器基質中的蛋白濃度改變而分析實時生物特異性作用的光學現象。關於其進一步的介紹參見實施例5和Jonsson，U., et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26 ；Jonsson, U., et al.(1991)Biotechniques11:620-627 ；Johnsson,B., et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131 和 Johnnson, B., etal.(1991)Anal.Biochem.198:268_277。術語「載體」包括能夠轉運與其連接的另一個核酸分子的核酸分子。一種類型的載體是「質粒」，質粒是另外的DNA節段可連接入其中的環形雙鏈DNA環。另一類載體是病毒載體，其中另外的DNA節段可連接入病毒基因組中。某些載體能夠在其被引入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞時整合入宿主細胞的基因組中，由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠控制與其可操做地連接的基因的表達。這樣的載體在本文中稱為「重組表達載體」(或者簡稱為「表達載體」)。一般來說，重組DNA技術中表達載體的應用通常為質粒形式。在本說明書中，「質粒」和「載體」可交互使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明預期包括這些其他形式的表達載體，例如具有同等功能的病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)包括重組表達載體已經引入其中的細胞。應當理解的是這些術語不僅指特定對象的細胞，而且也指這種細胞的子代細胞。因為突變或環境的影響連續傳代時可能發生某些改變，所以這樣的子代細胞可能事實上與親代細胞不完全相同，但是仍然包括在本文使用的術語「宿主細胞」的範圍內。術語「單克隆抗體」(單克隆抗體)是指從基本上同源的抗體的群獲得的抗體或類似抗體的群並且不被解釋為需要通過任何特殊的方法生產抗體，包括但不限於，單克隆抗體可通過由Kohler和Milstein (Nature, 256:495-497,1975)最初描述的雜交瘤方法或通過重組DNA方法製得。術語「嵌合抗體」(或「嵌合的免疫球蛋白」)是指包含與來源於特定物種或屬於特定抗體類型或亞型的抗體中的相應序列相同或同源的重鏈和/或輕鏈而所述鏈的其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類型或亞型的抗體中的相應片段相同或同源的分子以及這些抗體的片段，條件是它們表現出所期望的生物學活性(Cabilly et al.(1984)，infra ；Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81:6851)。術語「人源化抗體」是指包含來自非人(例如，小鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。人源化抗體可包括不會顯著改變其結合和/或生物學活性的保守胺基酸取代或來自相同或不同物種的非天然殘基。這些抗體是包含來源於非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對於絕大部分來說，人源化抗體是人類免疫球蛋白(接受抗體)，其中來自接受者的互補決定區(CDR)的殘基被來自具有所期望的性質的非人類物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、駱駝、牛、山羊或兔的CDR的殘基代替。而且人源化抗體可包含在接受抗體或引進的CDR中都不存在的殘基或框架序列。可進行這些修飾以進一步將抗體表現精細化和最大化。因此，通常人源化抗體將包含至少一個以及在一個方面兩個可變結構域的全部或基本上全部，其中超變環的全部或基本上全部相應於非人免疫球蛋白的那些而FR區的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恆定區(Fe)的至少一部分，通常為人免疫球蛋白的一部分。(參見例如Cabilly et al.，U.S.Pat.N0.4, 816, 567 ；Cabilly et al., European Patent N0.0, 125, 023B1 ；Boss et al.,U.S.Pat.N0.4, 816, 397 ；Boss et al., European Patent N0.0, 120, 694B1 ；Neuberger,M.S.et al., WO 86/01533 ；Neuberger, M.S.et al., European Patent N0.0, 194, 276 BI ；Winter, U.S.Pat.N0.5, 225, 539 ；ffinter, European Patent N0.0, 239, 400 BI ；Padlan,E.A.et al.,European Patent Application N0.0, 519, 596 Al ；Queen et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol 86:10029-10033)。本文所描述和要求的抗體中的每一個可以是指，單數或複數形式，如:「抗0X40抗體；」 「抗h0X40抗體；」 「抗h0X40單克隆抗體；」 「抗人0X40抗體；」 「抗人0X40mAb ； 」 「抗h0X40 mAb」 「h0X40特異性單克隆抗體；」 「抗0X40L抗體；」 「抗h0X40L抗體;」 「抗人0X40L抗體；」 「人0X40特異性抗體；」 「人0X40特異性單克隆抗體；」 「人0X40特異性抗體；」 「抗人0X40特異性抗體；」 「抗人0X40特異性單克隆抗體；」 「h_0X40特異性抗體；」 「h-0X40特異性單克隆抗體；」 「h0X40agonistic抗體；」 「h0X40拮抗劑「和/或其其他相似變體。如通過引用併入本文的美國專利申請第11/659,266號題目為「Methods toTreat Disease States by Influencing the singalling of OX—40-Receptors and HighThroughput Screening Methods and Identifying Substrates Thereof，，中所公開的，其公開了 0X40L的功能是反向調節 由免疫抑制劑Dex和vit D3、IC0SL或不成熟的DC所誘導的Trl細胞的生成。這一發現證明0X40L增強免疫性並且打破免疫耐受性的一般機制。使用免疫組織學分析(圖1)、細胞內染色(圖2)和細胞分選(圖3)，我們已經顯示產生IC0S+IL-10和產生COS-TGF- β -的Treg浸潤人FL組織。這些FL來源的F0XP3+Treg可強烈抑制響應於0040_配體預活化的自體淋巴瘤細胞的浸潤F0XP3_CD4+CD25_腫瘤的T細胞的增殖(圖4)。ICOS+Treg的抑制活性可被中和抗IL-10抗體部分阻斷，證實FL中產生ICOS+IL-1O的Treg的作用。在圖2的實驗中，腫瘤細胞和PBMC從具有治療前的初始診斷的7個患者獲得。也從7個健康供體獲得PBMC用於比較。調節性T細胞佔整個⑶4+T細胞的百分比通過⑶4+CD25+⑶127ffiF0XP3+Treg的流式細胞計數分析來確定。圖2A提供Treg的代表性FACS分析而圖2B顯示所有供體的Treg的百分比。還發現的是0X40L抑制Dex和vit D3誘導的Trl細胞從⑶4+T細胞的生成。已知的是免疫抑制性藥物Dex和vit D3的組合持續誘導初始CD4+T細胞分化為Trl細胞。為了證實0X40L是否可抑制Trl細胞的生成和功能，將初始⑶4+T細胞與抗⑶3以及抗⑶28單克隆抗體在0X40L轉染的L細胞存在或不存在的情況下在四種不同培養條件下培養7天，所述培養條件包括:Trl (Dex 和 vit D3) ； (2) THl (IL-12) ； (3) TH2 (IL-4)或(4)中性的(僅培養基)(圖5A)。通過細胞內細胞因子染色和ELISA分析經由已預處理的T細胞的IL-1O產生。在圖5A的實驗中，通過細胞計數進行了初始CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。將初始⑶4+T細胞與抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體在IL-2存在的情況下在親本L細胞或0X40L-L細胞上與所顯示的重組細胞因子或試劑一起培養7天。在每個點印跡概況中指示各個產生細胞因子的T細胞的百分比。所述結果顯示0X40L抑制不同極化信號誘導的Trl細胞從初始CD4+T細胞生成。如圖5A中所示，在中性或THl或TH2條件下培養的初始⑶4+T細胞生成2%至4%的Trl細胞。在採用Dex加上vit D3的培養中生成超過15%的Trl細胞。在所有培養條件下，加入0X40L完全阻斷Tr I細胞的生成，而促進產生TNF- α的T細胞的生成。這些數據通過ELISA數據(圖5Β)證實。在圖5Β的實驗中，通過ELISA測量用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之後上清液中經由初始⑶4+細胞的細胞因子生產。將初始CD4+T細胞與抗CD3和抗CD28單克隆抗體在IL-2存在的情況下在親本L細胞或0X40L-L細胞上與所指示的重組細胞因子或試劑一起培養7天。將數據顯示為平均值土四個獨立實驗的平均值(SEM)的標準誤差。結果顯示0X40L抑制不同極化信號誘導的Trl細胞從初始⑶4+T細胞生成。

用Trl條件(Dex加上vit D3)預處理的初始⑶4+T細胞是無變應性的並且具有抑制初始CD4+T細胞響應於抗CD3和抗CD28單克隆抗體的增殖的能力(圖5C)。在圖5C的實驗中，通過[3H]胸腺嘧啶核苷摻入測量T細胞中的抑制性功能。所指示的T細胞群的混合物通過抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激。誤差條代表三個孔的SEM。已經發現用相同的Trl條件預處理的初始CD4+T細胞在0X40L存在的情況下強烈增殖並且未能抑制響應於抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體的初始⑶4+T細胞的增殖。數據顯示0X40L阻斷功能性Trl細胞從Dex和vit D3誘導的初始⑶4+T細胞生成。發現Trl細胞可從記憶⑶4+CD45RATD45R0+T細胞生成而0X40L可抑制Trl細胞從記憶⑶4+T細胞生成。將記憶⑶4+CD45RATD45R0+T細胞與抗⑶3加上抗⑶28單克隆抗體在轉染0X40L的L細胞Trl條件(Dex加上vit D3)存在或不存在的條件下培養7天。在圖6A的實驗中，通過細胞計數進行了 CD4+記憶T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。將記憶⑶4+⑶45R0+⑶25_記憶T細胞與抗⑶3、抗⑶28單克隆抗體和IL-2 —起在親本L細胞或0X40L-L細胞上在Dex加上vit D3存在或不存在的情況下培養7天。在每個點印跡概況中指示各個產生細胞因子的T細胞的百分比。所述結果顯示0X40L抑制Dex加上vitD3條件下Trl細胞從記憶⑶4+T細胞生成。圖6A顯示大量的Trl細胞(> 20% )在採用Dex加上vit D3的培養中從⑶4+記憶T細胞生成。加入0X40L完全阻斷Trl細胞的生成並且促進產生TNF- α的細胞從記憶⑶4+Τ細胞生成。通過IL-10ELISA分析(圖6Β)證實了 Dex加上vit D3促進從記憶CD4+T細胞產生IL-10的能力並且這一能力可被0X40L抑制。在圖6B的實驗中，通過ELISA在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之後測量上清液中經由記憶⑶4+T細胞的IL-10產生。將數據顯示為平均值土四個獨立實驗SEM。結果顯示0X40L在採用Dex加上vit D3的條件下抑制Trl細胞從記憶⑶4+T細胞生成。還發現0X40L抑制Trl細胞的生成而其他的TNF家族成員(GITR1和4-1BBL)並沒有。在TNF超家族中，0X40L、糖皮質激素誘導的TNF受體-配體(GITRl)和4-1BB-配體(4-1BBL)具有對T細胞的共刺激功能。為了證實0X40L在Trl細胞的抑制中是否是唯一的，將初始⑶4+T細胞用抗⑶3加上抗⑶28單克隆抗體以及Dex加上vit D3與親本L細胞或用0X40L、GITR1或4-1BBL轉染的L細胞一起培養7天。儘管0X40L、GITR1和4-1BBL都促進產生TNF- α的細胞的生成，但僅0X40L抑制Trl細胞的生成(圖7Α和7Β)。在圖7Α的實驗中，通過細胞計數進行了初始CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。將初始⑶4+Τ細胞與抗⑶3、抗⑶28單克隆抗體和IL-2 —起在親本L細胞、0X40L-L細胞、GITRl-L細胞或4-1BBL-L細胞上在Dex加上vit D3存在的情況下培養7天。在每個點印跡概況中指示各個產生細胞因子的T細胞的百分比。所述結果顯示0X40L抑制Trl細胞生成而GITRl和4-1BBL都不抑制。在圖7Β的實驗中，通過ELISA在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之後測量上清液中初始⑶4+細胞的IL-10。將數據顯示為平均值土四個獨立實驗的SEM。所述結果顯示0X40L抑制Trl細胞生成而GITRl和4-1BBL都不抑制。0X40L、GITRl和4-1BBL都促進整體T細胞數目的擴張(圖7C)。在圖7C的實驗中，將可見T細胞的數目計數。將數據顯示為平均值土四個獨立實驗的SEM。如本領域技術人員所理解的，圖7A、7B和7C的結果顯示0X40L抑制Trl細胞生成而GITRl和4-1BBL都不抑制。這些數據表明在已知共刺激T細胞的TNF超家族的三個成員中，0X40L在抑制Trl細胞生成上具有新的並且獨特的功能。還發現0X40L抑制ICOSL或不成熟DC誘導的Trl細胞生成。ICOS和CD28代表T細胞上表達的⑶28家族的兩個正向共刺激受體。通過激動型抗體或ICOSL的經由ICOS的信號傳導已經顯示促進⑶4+T細胞產生IL-10。為了研究0X40L是否可抑制ICOS誘導經由⑶4+T細胞的IL-10生產的能力，將初始和記憶⑶4+T細胞與抗⑶3 —起在ICOSL轉染的L細胞或ICOSL轉染的L細胞存在的情況下在0X40L存在的情況下培養7天。

在圖8A的實驗中，通過細胞計數進行了初始CD4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。將初始⑶4+T細胞在用抗⑶3單克隆抗體預包被的親本L細胞、ICOSL-L細胞和L細胞的混合物或ICOSL-L細胞和0X40L-L細胞的混合物上培養7天。在每個點印跡概況中指示各個產生細胞因子的T細胞的百分比。所述結果顯示0X40L抑制ICOSL誘導的Trl細胞從初始⑶4+T細胞的生成。在圖8B的實驗中，通過ELISA測量在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之後上清液中初始⑶4+細胞的IL-10產生。將初始⑶4+T細胞在用抗⑶3單克隆抗體預包被的親本L細胞、ICOSL-L細胞和L細胞的混合物或ICOSL-L細胞和0X40L-L細胞的混合物上培養7天。將數據顯示為平均值土三個獨立實驗的SEM。所述結果顯示0X40L抑制ICOSL誘導的Trl細胞從初始⑶4+T細胞的生成。在圖8C的實驗中，通過細胞計數進行了記憶⑶4+T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。將記憶⑶4+T細胞在用抗⑶3單克隆抗體預包被的親本L細胞、ICOSL-L細胞和L細胞的混合物或ICOSL-L細胞和0X40L-L細胞的混合物上培養7天。在每個點印跡概況中指示各個產生細胞因子的T細胞的百分比。所述結果顯示0X40L抑制ICOSL誘導的Trl細胞從記憶⑶4+T細胞的生成。在圖8D的實驗中，通過ELISA測量在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之後上清液中記憶⑶4+細胞的IL-1O產生。將記憶⑶4+T細胞在用抗⑶3單克隆抗體預包被的親本L細胞、ICOSL-L細胞和L細胞的混合物或ICOSL-L細胞和0X40L-L細胞的混合物上培養7天。將數據顯示為平均值土三個獨立實驗的SEM。所述結果顯示0X40L抑制ICOSL誘導的Trl細胞從記憶⑶4+T細胞的生成。圖8A、8B、8C和8D的實驗結果顯示ICOSL顯著促進Trl細胞從初始和記憶CD4+T細胞的生成。加入0X40L完全抑制Trl細胞從初始和記憶⑶4+T細胞的生成而強烈促進生產TNF-α的細胞的生成。已知的是不成熟的DC或用IFN- α或IL-10處理的DC可誘導初始⑶4+Τ細胞分化為Trl細胞。已經研究0X40L是否可以抑制DC誘導的Trl細胞的生成。如圖8Ε中所示，不成熟的DC或用IFN-α或IL-10處理的DC都誘導來自初始⑶4+Τ細胞的超過10%的Trl細胞的生成。通過比較，由⑶40L活化的DC誘導強烈的THl響應，伴隨著約3% Trl細胞的生成。在DC-T細胞培養物中加入重組的0X40L完全抑制由不成熟的DC或用IFN-α或IL-10處理的DC誘導的Trl細胞的生成。此外，0X40L同樣抑制由⑶40L活化的成熟DC誘導的其餘數目的Trl細胞的生成。在圖8Ε的實驗中，通過細胞計數進行了 CD4+初始T細胞的細胞因子產生的細胞內分析。將初始CD4+T細胞在可溶重組0X40L存在或不存在的條件下與不成熟的DC或用IFN- α、IL-10和⑶40L培養的DC —起培養7天。在每個點印跡概況中指示各個產生細胞因子的T細胞的百分比。所述結果顯示0X40L抑制DC誘導的Trl細胞從⑶4+Τ細胞的生成。通過ELISA數據(圖8F)證實0X40L抑制DC誘導的Trl細胞生成的能力。在圖8F的實驗中，通過ELISA在用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體再刺激24h之後測量上清液中經由初始⑶4+細胞的IL-10生產。將初始⑶4+T細胞在可溶重組0X40L存在或不存在的條件下與不成熟的DC或用IFN-α、IL-10和⑶40L培養的DC —起培養7天。將數據顯示為平均值土三個獨立實驗的SEM。所述結果顯示0X40L抑制DC誘導的Trl細胞從⑶4+Τ細胞的生成。因此，這些數據證明0X40L可抑制ICOSL和DC提供的更多生理信號誘導的Trl細胞生成。 之前已經表明調節性T細胞在B細胞非霍奇金淋巴瘤的區域內高度表達並且該B細胞參與將調節性T細胞募集至淋巴瘤的區域中。研究了影響0X40受體的信號傳導(例如通過0X40L)是否能夠提供抗B細胞淋巴瘤的治療。冷藏保存的來自B細胞淋巴瘤患者的樣品被用於評估0X40L停止Trl細胞的能力。所用的樣品是從未受到任何治療的脾樣品獲得的濾泡性淋巴瘤。將細胞解凍，400Χ IO6冷凍細胞產生127Χ IO6活細胞和33.9Χ IO6死細胞(79%活力)。通過FACS染色確定足夠數目的⑶25+細胞。在圖9的實驗中，通過ELISA確定產生IC0S+IL-10的Treg的IL-10分泌。將Treg細胞在兩種不同條件下培養。在條件I中，將⑶25+/IC0S+細胞與抗⑶3 —起在IL-2(900y Ι/ml)存在的條件下在親本L細胞或0X40L-L細胞上與抗ICOS抗體一起培養3-6天。在條件2中，將⑶25+/IC0S+細胞與抗CD3在ICOS-L-L細胞或0X40L-L和ICOS-L-L細胞的混合物上的IL-2 (900 μ I/ml)存在的條件下培養3-6天。通過ELISA測量上清液中的細胞因子生產。所述結果顯示0X40L顯著抑制Treg細胞的IL-10產生。如本領域技術人員應當理解的，0X40L具有抑制由免疫抑制性藥物Dex加上vitD3、IC0SL，或DC誘導的Trl細胞的生成和功能的能力的發現使得0X40L在不同形式的CD4-或CD8介導的免疫響應中促進免疫性並打破耐受性的新機制更受矚目。0X40L在IL-12誘導的THl或IL-4誘導的TH2響應期間抑制Trl細胞生成的能力表明0X40L可控制THl或TH2介導的免疫響應的等級。而且0X40L抑制Trl細胞生成的能力似乎是0X40L的獨有特性，因為其他兩個TNF家族成員GITRl和4-1BBL不具有這一功能特性。而且，0X40L抑制經由Treg細胞的IL-1O產生的能力將0X40L鑑定為對B細胞淋巴瘤和其他癌症的有力治療。已經鑑定促進Trl細胞生成的許多分子，包括IL-10、IFN-α、ICOSL和免疫抑制化合物例如Dex加上vit D3。0X40L代表不僅從初始⑶4+Τ細胞還有從記憶⑶4+Τ細胞和調節性T細胞生成Trl細胞的有力抑制劑。0X40/0X40L的這一新特性可解釋最近的顯示0X40信號傳導允許無變應性的自體反應T細胞獲得效應子細胞功能的報導。靶向0X40/0X40L因此為人類變應性和自身免疫疾病的提供了治療並且也為人傳染性疾病和癌症提供了對治療的開發，所述癌症包括但不限於黑色素瘤，腦癌，骨癌，白血病，淋巴瘤，上皮細胞來源的瘤樣病變(上皮癌)例如基底細胞癌，腺癌，胃腸道癌例如唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌和胃癌，結腸癌，肝癌，膀胱癌，胰腺癌，卵巢癌，子宮頸癌，肺癌，乳腺癌和皮膚癌例如鱗狀細胞和基底細胞癌，前列腺癌，腎細胞癌和其它已知的癌症。可通過本文描述的抗體和方法預防或治療的疾病或病況包括癌症的預防或治療，所述癌症例如皮膚性T-細胞白血病、頭部和頸部腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、高級別膠質瘤、腦轉移瘤、黑色素瘤、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、白血病、骨髓增生異常症候群(前白血病病況)和多發性骨髓瘤。通常，任何癌症的轉移都可用本文描述的化合物和方法預防或治療。抗體也可被用於預防或治療增生性血管生成病況，包括毛細血管擴張症、靜脈血管瘤、成血管細胞瘤。其他病症、疾病或病況包括病毒疾病，其中的一些傳統上被認為是「不可治療的」。抗體例如也可被用於將單個病原體的株分類。研究人員可使用本文描述的抗體鑑定並追蹤有機體中特定的細胞或分子。通常術語「癌症」和「癌的」是指或描述通常由不受調控的細胞生長所表徵的哺乳動物中的生理學病況。更具體地，可使用本文描述的抗體中的任一種或多種或其變體治療或預防的癌症包括但不限於癌(carcinoma)，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病。這些癌症的更具體的實例包括但不限於鱗狀細胞癌，肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)，腹膜的癌，肝細胞癌，胃(gastric)癌或胃(stomach)癌(包括胃腸道癌和胃腸道間質癌)，胰腺癌，膠質母細胞瘤，子宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝瘤，乳腺癌，結腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌或腎臟癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)和各種類型的頭部和頸部腫瘤，黑色素瘤，淺表擴散性黑色素瘤，惡性雀斑樣痣黑色素瘤，肢端雀斑樣痣黑色素瘤，結節性黑色素瘤以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴細胞(SL)NHL ;中等級/濾泡性NHL ;中等級瀰漫性NHL ;高等級免疫母細胞性NHL ;高等級淋巴母細胞性NHL ;高等級小無裂細胞NHL ;大腫塊NHL ;套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤和巨球蛋白血症)，慢性淋巴細胞白血病(CLL)急性成淋巴細胞白血病(ALL)，多毛細胞白血病，慢性粒細胞白血病和移植後淋巴組織增生症(PTLD)以及與瘢痣病有關的異常血管增生，水腫(例如與腦腫瘤相關)和梅格斯症候群。 本文提供治療或預防免疫病症的方法。這些方法包括向需要這些治療的受治療者施用有效量的所述抗體。在一些實施方案中，所述免疫病症是米那一病症或自身免疫病症。所述病症是哮喘，特應性皮炎，過敏性鼻炎，炎性腸病，多發性硬化症，GVHD和/或系統性紅斑狼瘡。在一些實施方案中，所述病症是與病毒、子君或其他感染劑有關的疾病。
而且，本文描述的抗體和方法可被用於預防或治療炎性疾病和病況例如骨關節炎、類風溼關節炎、克羅恩病、潰瘍性結腸炎和自身免疫疾病例如狼瘡和混合自身免疫疾病。例如，本文描述的抗體可被用於治療各種自身免疫疾病和炎性疾病，其包括向需要其的受治療者施用治療上有效的量的所述抗體的步驟，其中所述自身免疫疾病和炎性疾病是下列疾病中的任一種或多種:胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、糖尿病、多發性硬化、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、急性播散性腦脊髓炎、關節炎、類風溼關節炎、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、重症肌無力症、甲狀腺炎、橋本病、原發性粘液水腫、甲狀腺功能亢進、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、艾迪生病、過早絕經、男性不育症、青少年糖尿病、肺出血腎炎症候群、尋常型天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、晶狀體源性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、特發性白細胞減少、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎Hb_、隱源性肝硬化、潰瘍性結腸炎、乾燥症候群、硬皮病、韋格內氏肉芽腫、多/皮肌炎、盤狀LE、系統性紅斑狼瘡、克隆氏病、牛皮癬、強直性脊柱炎、抗磷脂抗體症候群、再生障礙性貧血、自身免疫性肝炎、腹腔疾病、格雷夫斯病、格-巴二氏症候群(GBS)、特發性血小板減少性紫癜、眼球陣攣肌陣攣症候群(OMS)、視神經炎、ORd』 s thyroiditis、天皰瘡、多關節炎、原發性膽汁性肝硬化、賴特症候群、多發性大動脈炎、顳動脈炎、溫抗體型自身免疫性溶血性貧血、韋格納肉芽腫、普禿、白塞病、查加斯病、慢性疲勞症候群、家族性自主神經機能異常、子宮內膜異位症、化膿性汗腺炎、間質性膀胱炎、神經性肌強直、結節病、硬皮病、潰瘍性結腸炎、白癜風、外陰痛、炎症性皮膚病、過敏性接觸性皮炎、幽門螺桿菌(H.pylory)胃炎、慢性鼻腔炎性疾病、動脈粥樣硬化和移植物抗宿主病。更特別地，「自身免疫疾病」如本文所用的是產生自並直接抗個體自身組織或器官的疾病或病症或其共分離或表現或從其產生的病況。自身免疫疾病可以指由具有對正常身體組織和抗原起反應的抗體的B細胞的產生導致或加重的病況。同樣，自身免疫疾病是可引起對來自自身抗原(例如核抗原)的表位特異性的自身抗體分泌的疾病。可由本文描述的抗體中的任一種或多種治療和/或預防的自身免疫疾病或病症包括但不限於關節炎(類風溼關節炎例如急性關節炎、慢性風溼性關節炎、痛風或痛風性關節炎、急性痛風性關節炎、急性免疫性關節炎、慢性炎性關節炎、退行性關節炎、II型膠原誘導的關節炎、感染性關節炎、萊姆關節炎、增生性關節炎、銀屑病關節炎、斯提耳病、椎關節炎和幼年發作類風溼關節炎、骨性關節炎、arthritis chronica progrediente、變形性關節炎、Polyarthritis chronica primaria、反應性關節炎和強直性脊柱炎)，炎性過度增生性皮膚病，銀屑病例如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰型銀屑病和指甲銀屑病，特應性包括特應性疾病例如花粉熱和喬布症候群，皮炎包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝脫性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎、錢幣狀皮炎、脂溢性皮炎、非特異性皮炎、原發刺激性接觸性皮炎和特應性皮炎，X連鎖高IgM血症，過敏性眼內炎性疾病，蕁麻疹例如慢性變應性蕁麻疹和慢性特發性蕁麻疹包括慢性自身免疫性蕁麻疹，肌炎，多發性肌炎/皮肌炎，幼年型皮肌炎，中毒性表皮壞死松解症，硬皮病(包括系統性硬皮病)，硬化症例如系統性硬化症、多發性硬化症(MS)(諸如脊髓-視覺MS，原發性進行性MS (PPMS)和硬化和復發緩解型MS (RRMS))、進行性系統性硬化症、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化症、共濟失調硬化症，視神經脊髓炎(NMO)，炎性腸病(IBD)(例如克羅恩病，自身免疫介導的胃腸道疾病，大腸炎諸如潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、潰瘍性結腸炎(colitisulcerosa)、微小性結腸炎、膠原性結腸炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎和透壁性結腸炎以及和自身免疫性炎症性腸道疾病)，腸道炎症，壞疽性膿皮病，結節性紅斑，原發性硬化性膽管炎，呼吸窘迫症候群包括成人或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)，腦膜炎，葡萄膜全部或部分炎症，虹膜炎，脈絡膜炎，自身免疫性血液疾病，類風溼性脊柱炎，類風溼性滑膜炎，遺傳性血管性水腫,腦神經損傷例如腦膜炎、妊娠皰疹、妊娠性類天皰瘡、搔癢症，自身免疫性卵巢功能早衰，由於自身免疫性病況的突發性聽力損失，IgE介導的疾病例如過敏反應以及過敏性和特發性鼻炎，腦炎例如Rasmussen腦炎以及邊緣和/或腦幹腦炎,葡萄膜炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、後葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和不具有腎病症候群的腎小球腎炎(GN)例如慢性或急性腎小球腎炎諸如原發性GN、免疫介導的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發性膜性GN或特發性膜性腎病、膜-或膜性增生性GN(MPGN)包括I型和II型和迅速進行性GN，增生性腎炎，自身免疫性多腺體內分泌衰竭，龜頭炎包括漿細胞性局限性龜頭炎、龜頭包皮炎，心性環狀紅斑，持久性色素異 常性紅斑，eythema multiform，環狀肉芽腫，光澤苔癬，硬化萎縮苔癬，單純慢性苔癬，小棘苔癬，扁平苔癬，層狀魚鱗病，表皮鬆解性角化過度，惡化前角化病，壞疽性膿皮病，變應性病況和反應，變應性反應，溼疹包括變應性或特發性溼疹、乾性溼疹、汗皰和水泡性掌蹠溼疹，哮喘例如哮喘支氣管炎、支氣管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T細胞浸潤和慢性炎症響應的病症，針對外來抗原的免疫反應例如妊娠期間胎兒的ABO血型，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白細胞粘附缺陷，狼瘡包括狼瘡性腎炎、狼瘡性腦炎、小兒狼瘡、非腎性狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡和盤狀紅斑狼瘡、脫髮性狼瘡、系統性紅斑狼瘡(SLE)例如表皮SLE或亞急性表皮SLE，新生兒狼瘡症候群(NLE)和播散性紅斑狼瘡，幼年發病型糖尿病(I型)包括小兒胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，成人發病型糖尿病(類型II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特發性尿崩症，糖尿病性視網膜病，糖尿病性腎病，糖尿病性大動脈紊亂，細胞因子和T淋巴細胞介導的與急性和遲發性超敏感性相關的免疫響應，結核，結節病，肉芽腫包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納肉芽腫，粒細胞缺乏，血管炎包括脈管炎、大血管血管炎(包括風溼性多肌痛和巨細胞(Takayasu)動脈炎)、中等血管血管炎(包括川崎病和結節性多動脈炎/結節性動脈周圍炎)、顯微鏡下多動脈炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚脈管炎、高敏感性脈管炎、壞死性血管炎例如系統性壞死性血管炎以及ANCA相關性血管炎例如C丘-施二氏血管炎或症候群(CSS)和ANCA相關性小血管血管炎，顳動脈炎，再生障礙性貧血，自身免疫性再生障礙性貧血，Coombs陽性貧血，戴-布二氏貧血，溶血性貧血或免疫溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血(anemia perniciosa),阿狄森氏病,純紅細胞性貧血或發育不良(PRCA),凝血因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性白血球減少症，全血細胞減少，白細胞減少，涉及白細胞血球滲出的疾病，CNS炎性疾病，阿爾茨海默氏病，帕金森病，多臟器損傷症候群例如敗血症、外傷或出血繼發的那些，抗原-抗體複合物介導的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體症候群，變應性神經炎，白塞病/症候群，Castleman症候群,古德帕斯丘症候群,雷諾症候群，乾燥症候群，斯-約二氏症候群，類天皰瘡例如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡，天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉性天皰瘡、天皰瘡黏膜性類天皰瘡和紅斑性天皰瘡)，自身免疫性多內分泌病，萊特病或症候群，熱損傷，先兆子癇，免疫複合物病症例如免疫複合物性腎炎，抗體介導的腎炎，多發性神經病，慢性神經病例如IgM型多發性神經病或IgM抗體介導的神經病變，血小板減少(例如如心肌梗死患者所發展的)包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、輸血後紫癜(PTP)、肝素誘發的血小板減少症和自身免疫或免疫介導的血小板減少症例如特發性血小板減少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，鞏膜炎例如特發性角膜鞏膜炎、鞏膜外層炎，睪丸和卵巢的自身免疫性疾病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發性甲狀腺功能減退，甲狀旁腺功能減退，自身免疫性內分泌疾病包括甲狀腺炎例如自身免疫性甲狀腺炎，橋本病，慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎，自身免疫性甲狀腺疾病，特發性甲狀腺功能減退，Grave' s病，多腺體症候群例如自身免疫性多腺體症候群(或多腺體內分泌症候群)，瘤外症候群包括神經系統瘤外症候群例如蘭伯特-伊頓肌無力症候群或伊頓-蘭伯特症候群，僵人或僵人症候群，腦脊髓炎例如變應性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或變應性腦脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)，重症肌無力例如胸腺瘤相關重症肌無力、小腦變性、神經性肌強直、眼陣攣或眼球陣攣肌陣攣症候群(OMS)和感覺神經病變，多灶性運動神經病，席漢症候群，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，類狼瘡肝炎，巨細胞性肝炎，慢性活動性肝炎或自身免疫性慢性活動性肝炎，淋巴間質性肺炎(LIP)，梗阻性細支氣管炎(非移植)對比NSIP，格-巴二氏症候群，貝格爾病(IgA腎病)，特發性型IgA腎病，線性IgA皮膚病，急性熱性嗜中性白細胞皮膚病，角質層下膿皰皮膚病，瞬時性棘層松解性皮膚病，肝硬化例如嗜原發性膽汁性肝硬變和肺硬變，自身免疫性腸病症候群，腹部或腹腔病，口炎性腹瀉(麩質腸病)，難治性口炎性腹灣(refractory sprue),特發性口炎性腹灣，冷球蛋白血症，肌萎縮側索硬化(ALS;Lou Gehrig病)，冠狀動脈疾病，自身免疫性耳病例如自身免疫性內耳病(AIED)、自身免疫性聽力損失，多軟骨炎例如難治癒的或復發的或復發性多軟骨炎，肺泡蛋白沉積症，柯根症候群/非梅毒性間質性角膜炎，貝耳麻痺，Sweet病/症候群，自身免疫性酒渣鼻，帶狀皰疹相關疼痛，澱粉樣變性，非癌性淋巴細胞增多，原發淋巴細胞增多包括單克隆的B細胞淋巴細胞增多(例如，良性單克隆性丙種球蛋白病和意義未定的單克隆丙種球蛋白病，MGUS)，周圍神經病變，瘤外症候群，離子通道病例如癲癇、偏頭痛、心律失常、肌肉失常、耳聾、失明、周期性麻痺和CNS的離子通道病，自閉症，炎性肌病，局灶性或節段性或局灶性節段性腎小球硬化(FS GS)，內分泌性眼病，葡萄膜視網膜炎，脈絡膜視網膜炎，自身免疫性肝臟疾病，纖維肌痛，多發性內分泌衰竭，施密特症候群，腎上腺炎，胃萎縮，早老性痴呆症，脫髓鞘性疾病例如自身免疫性脫髓鞘性疾病和慢性炎症性脫髓鞘性多神經病，德雷斯勒症候群，alopecia greata,全秀，CREST症候群(|丐質沉著、雷諾氏現象、食管運動功能障礙、指端硬化和毛細血管擴張症)，男性和女性的自身免疫性不育例如由於抗精子抗體，混合結締組織病，恰加斯病，風溼熱，習慣性流產，農民肺，多形性紅斑，心臟切開術後症候群，柯興氏症候群，養鳥人肺，變應性肉芽腫血管炎，良性淋巴細胞性血管炎，阿爾波特症候群，肺泡炎例如變應性肺泡炎和纖維化肺泡炎，間質性肺病，輸血反應，麻風病，寄生蟲病例如利什曼病、kypanosomiasis、血吸蟲病、蛔蟲病、麴黴病，Sampter症候群、卡普蘭症候群,登革熱，心內膜炎，心內膜纖維化，瀰漫性間質性肺纖維化，肺間質纖維化，肺纖維化，特發性肺纖維化，囊性纖維化，眼內炎，持久隆起性紅斑，胎兒溶血症，嗜酸性筋膜炎，舒爾曼症候群、費耳提症候群，絲蟲病，睫狀體炎例如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎(急性或慢性)或Fuch睫狀體炎，亨-舍二氏紫癜，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染SCID，獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)，埃可病毒感染，敗血症，內毒素血症，胰腺炎，甲狀腺毒症，細小病毒感染，風疹病毒感染，疫苗接種後症候群，先天性風疹感染，EB病毒感染，腮腺炎，埃文氏症候群，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆舞蹈病，鏈球菌感染後性腎炎，血栓閉塞性血管炎，甲狀腺毒症，脊髓癆，脈絡膜炎，巨細胞多肌痛，慢性過敏性肺炎，乾燥性角結膜炎，流行性角結膜炎，特發性腎炎症候群，微小病變性腎病，良性家族性和缺血再灌注損傷，移植器官再灌注，視網膜自身免疫，關節發炎，支氣管炎，慢性呼吸道梗阻/肺疾病，矽肺病，口瘡，口瘡性口炎，動脈硬化疾病，aspemiogenese,自身免疫性溶血，伯克氏病，冷球蛋白血症，杜普伊特倫攣縮，endophthalmia phacoanaphylactica, enteritis allergica,麻風結節性紅斑，特發性貝耳麻痺，慢性疲勞症候群，febris rheumatica, Hamman-Rich病,感覺神經性聽力損失，haemoglobinuria paroxysmatica,性腺機倉泛減退，ileitis regionalis,白細胞減少，傳染性單核細胞增多症，橫貫性脊髓炎，原發性特發性粘液性水腫，腎病，ophthalmiasymphatica,肉芽腫性睪丸炎,胰腺炎,多神經根炎,壞疽性膿皮症，Quervain甲狀腺炎,獲得性脾萎縮，非惡性胸腺瘤，白癜風，中毒性休克症候群，食物中毒，涉及T細胞浸潤的病況，白細胞粘附缺陷，細胞因子和丁淋巴細胞介導的急性和遲發超敏反應相關的免疫反應，涉及白細胞血細胞滲出的疾病，多器官損傷症候群，抗原抗體複合物介導的疾病，抗腎小球基底膜病，變應性神經炎，自身免疫性多內分泌病，卵巢炎，原發性粘液性水腫，自身免疫性萎縮性胃炎，交感性眼炎，風溼性疾病，混合性結締組織病，腎病症候群，胰島炎，多內分泌腺病衰竭，自身免疫性多腺體症候群I型，成年發作的特發性甲狀旁腺功能減退(AOIH)，心肌病例如擴張型心肌病，後天性大皰性表皮鬆解(EBA)，血色素沉積症，心肌炎，腎病症候群，原發性硬化性膽管炎，化膿性或非化膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩骨、額骨、上頜骨或蝴蝶骨鼻竇炎，嗜曙紅細胞相關疾病例如嗜曙紅細胞增多、肺浸潤嗜曙紅細胞增多、嗜酸細胞增多性肌痛症候群、呂弗勒症候群、慢性嗜酸性肺炎、熱帶肺嗜酸性粒細胞增多、支氣管肺麴黴病、麴黴腫或包含嗜酸性粒細胞的肉芽腫，過敏症，血清陰性脊椎關節炎，多內分泌自身免疫病，硬化性膽管炎，鞏膜，鞏膜外層，慢性皮膚黏膜念珠菌病，布魯頓症候群，嬰兒的瞬態低丙種球蛋白血症，維-奧二氏症候群，毛細血管擴張運動失調症候群，血管擴張，與膠原病相關的自身免疫 性疾病，風溼病，神經系統疾病,淋巴結炎，降低血壓反應,血管功能障礙，組織損傷，心血管局部缺血，痛覺過敏，腎缺血，腦缺血和疾病伴隨的血管形成，變應性超敏感症，腎小球腎炎，再灌注損傷，缺血性再灌注障礙，心肌或其他組織的再灌注損傷，淋巴瘤氣管支氣管炎，炎症性皮膚病，具有急性炎症元件的皮膚病，多器官功能衰竭，大皰性疾病，腎皮質壞死，急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經系統炎症性疾病，眼和眼眶炎性疾病，粒細胞輸血相關的症候群，細胞因子誘導的毒性，發作性睡病，急性嚴重的炎症，慢性頑固性炎症，腎盂炎，動脈內增生，消化性潰瘍，心瓣炎和子宮內膜異位症。本文描述的抗體可具有多種學術、醫藥和商業用途。所述抗體可被用於不同類型的診斷測試，例如體外或體內檢測各種各樣的疾病或者藥品(藥物)、毒素或其他蛋白包括激素的存在。本文描述的抗體可用於測試疾病，例如在患者的血清或血液中。所述疾病可包括0X40相關疾病或與0X40不相關的疾病或適應症，包括各種癌症、炎性或自身免疫性疾病。抗體也可用於癌症的放射免疫檢測和放射免疫治療而某些新的測試方法可使用所描述的抗體以僅靶向特定細胞類型即癌症的細胞膜。本文描述的抗體可被製成試劑盒或其他診斷包的一部分。像這樣，本文提供了製造用於與本文的預處理方法一起使用的診斷試劑盒或物品。診斷試劑盒可包含下列中的任一種或多種:拮抗物/抗體/藥物參照材料；正對照中和抗體(優選地獼猴的山羊)；蛋白A+G柱(例如蛋白A/G柱)；去脂試劑；免疫球蛋白親和純化緩衝劑(例如結合、洗脫和中和緩衝劑)；補體血清；細胞的測定稀釋劑；製造商說明書或文獻；小瓶冷凍細胞(例如WIL2細胞)；細胞標記試劑(例如CELL TITER GL0.RTM.)等。以實例的方式，診斷試劑盒可包括但不限於:(a)去脂試劑；(b)用於免疫球蛋白的親和純化的緩衝劑(例如結合和洗脫緩衝劑)和(c)製造商手冊，其指導診斷試劑盒的使用者在對來自自身免疫性疾病或癌症受治療者的生物學樣品進行細胞基礎的生物測定(例如中和抗體測定)之前使用試劑盒預處理所述樣品(例如以避免血清幹擾的問題)的。診斷試劑盒任選還包含下列中的任一種或多種:藥物參照材料、正對照中和抗體、補體血清，細胞的測定稀釋劑和細胞標記試劑等。本文描述的抗體和其他發現同樣提供了高通量的篩選方法。更特別地並如本領域技術人員所理解的，可能得到篩選與0X40受體結合併抑制Trl細胞生成和功能或促進Trl細胞的生成和功能的拮抗型或激動型單克隆抗體或小分子的高通量方法。在一個這樣的方法中，將具有生產IL-10的能力的人T細胞系(SU-DHL-1)用人0X40基因(SU0X40)轉染。將100，000個3加乂40細胞與100，000個小鼠的成纖維細胞(L細胞)或100，000個表達人0X40-配體(0X40-配體L細胞)的小鼠成纖維細胞在96孔板中一起培養。培養48小時後，收集培養上清液用以通過IL-10特異性ELISA測量IL-10。在代表性的實驗中，在0X40-配體不存在的情況下培養的100，000個SU0X40細胞生產高達6，000pg/ml IL-10。在0X40-配體存在的情況下，100, 000個SU0X40細胞產生少於1，000pg/ml IL-10。這一培養方法可被用於篩選，除了別的之外，阻斷0X40-配體抑制經由SU0X40細胞的IL-10生產的能力的拮抗型單克隆抗體或小分子。可選擇地，這一培養方法可通過用對0X40特異性的可能的激動型單克隆抗體或小分子替換表達0X40-配體的L細胞來修飾以確定，除了別的之夕卜，它們抑制經由SU0X40細胞的IL-10生產的能力。本文描述的 抗0X40抗體可被用作測定或在用於檢測或測量在有機體或有機樣品中發現的藥物或其他分子的活性的測定中使用。它們也可以用於定量測定以測量樣品中物質的量。生物測定和免疫測定是可使用這些抗體的許多不同專用生物化學測定之中。本文教導的抗0X40抗體可被用於其他測定中以測量過程例如酶活性、抗體捕獲、幹細胞活性和
競爭性蛋白結合。如本領域技術人員所理解的，表達人GITRl、0X40L、4-1BBL、ICOSL的L細胞通過逆轉錄病毒介導的轉導生成。簡單地說，人GITRl (Accession#NM_005092)、0X40L (Accession#NM_003326)、4-lBBL(Accession#NM_00381 1)、ICOSL(Accession#NM_015259)的全長編碼序列用從HSV-1刺激的PBMC製備的RNA通過RT-PCR擴增。隨後，將cDNA克隆至MSCV基礎的逆轉錄病毒載體pMIGW2中並且所得到的質粒通過限制性酶消化和DNA測序來證實。為了產生重組逆轉錄病毒，每個載體與包裝構建體pCL-gp (gag/pol)和pHCMV-VSVg(VSV糖蛋白被膜)在HEK293T細胞中共同轉染。兩天後，收集包含病毒的培養上清液並用於以moi 100感染⑶32L細胞。在這一條件下，有結果地轉導了 > 95%的細胞
如本領域技術人員所理解的，將分離的⑶14+單核細胞(純度> 94% )在IOOng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4 (均來自R&D)存在的情況下培養5天。如本領域技術人員所理解的，將獲得的不成熟的 DC 清洗並與 IFN-a (1000U/ml, PBLBiomedical Laboratories)、IL-10 (10ng/ml，R&D)和受輻照的CD40L轉染的L細胞(DC與L細胞的比例4: I) 一起培養24h以獲得成熟DC。如本領域技術人員所理解的,使用⑶4+T細胞分離試劑盒II (Miltenyi Biotec)將初始⑶4+T細胞和記憶⑶4+T細胞(每個純度> 99% )從PBMC分離並且之後劑型細胞分選(D4+CD45RA+CD45R0TD25-部分作為初始T細胞而CD4+CD45RAXD45R0+CD25-部分作為記憶T細胞)。如本領域技術人員所理解的，將4xl04個新鮮純化的同種異體的初始CD4+T細胞與不成熟或培養的DC(DC與T比例1: 10) —起在重組人0X40L(R&D，100ng/ml)存在或不存在的情況下在圓底96孔培養盤中共同培養7天。如本領域技術人員所理解的，將純化的 CD4+T 細胞也與 IL-12 (10ng/ml，R&D)、IL-4 (25ng/ml, R&D)或地塞米松(5xl(T8M，Life Technologies)和I α，25- 二羥維生素D3 (10_7Μ)的混合物在可溶抗CD28單克隆抗體(CD28.2，I μ g/ml)和IL-2 (50U/ml, R&D)存在的情況在48孔培養板中已經用抗CD3單克隆抗體預處理的受輻照的CD32/0X40L-L細胞、CD32/GITR1-L細胞、CD32/4-1BBL-L細胞或親本CD32-L細胞上培養7天。在某些實驗中，如本領域技術人員所理解的，將CD4+T細胞在48孔培養板中用⑶3單克隆抗體(0.2 μ g/ml)預孵育的⑶32-L細胞、⑶32-L細胞和CD32/IC0SL-L細胞的混合物(比例1:1)或CD32/IC0SL-L細胞和CD32/0X40L-L細胞的混合物(比例1:1)上培養7天。如本領域技術人員所理解的，將RPMI 1640用於培養基並補充10% FCS、2mM L-谷醯胺、ImM丙酮酸鈉、青黴素G和鏈黴素。

如本領域技術人員所理解的，收集並清洗所培養的T細胞並且之後用結合板的抗CD3 (5 μ g/ml)和溶解的抗CD28 (2 μ g/ml)以IxlO6個細胞/ml的濃度再刺激24h。如本領域技術人員所理解的，通過ELISA測量上清液中的IL-4、IL-10、TNF_a和IFN-α水平(所有試劑盒來自R&D)。對於細胞內細胞因子生產，將培養的T細胞用50ng/ml of PMA加上2 μ g/ml伊屋諾黴素再刺激6h。如本領域技術人員所理解的，在最後2h加入布雷菲德菌素A (10 μ g/ml)。如本領域技術人員所理解的，使用FIX和PERM試劑盒(CALTAG)將細胞用PE-標記的抗IL-4的單克隆抗體或TNF- a FITC-標記的抗IFN- α的單克隆抗體和APC-標記的抗IL-10 (所有都來自BD)染色。如本領域技術人員所理解的，收集T細胞並重懸在含有EDTA的培養基中以分離簇。如本領域技術人員所理解的，將有活力的細胞通過死細胞的錐蟲藍排除計數。如本領域技術人員所理解的，對於抑制性功能測定，在親本L細胞(B)或0X40L-L細胞(C)存在的情況下初始⑶4+T細胞(A)和通過抗⑶3單克隆抗體、抗⑶28單克隆抗體，IL-2、Dex和vitD3從初始⑶4+T細胞生成的Trl細胞，這三種細胞類型和它們1:1比例的混合物之後通過在5 μ g/ml抗⑶3單克隆抗體和I μ g/ml抗⑶28單克隆抗體存在的情況下培養來重刺激5天，之後通過[3H]胸腺嘧啶核苷摻入測定細胞增殖。抗人0X40特異性單克隆抗體的生成我們生成多種抗人0X40激動型小鼠單克隆抗體。抗體的抗原結合特異性通過流式細胞計數來證實(圖10-12)。抗體的激動劑活性通過功能測定來證實。我們發現20個0X40特異性抗體中的九個可阻斷維生素D3/地塞米松介導的來自⑶4+T細胞的Trl細胞生成(圖13)，增強CD4+T細胞增殖(圖14)並抑制IC0S+CD4+CD25高F0XP3+Treg的IL-1O生產(圖16)。我們滴定所述抗體並且發現五種在以低至4ng/ml的濃度抑制Trl細胞生成上具
有有力活性。0X40 抗體抑制 CD4+CD25 高 F0XP3+Treg 功能0X40單克隆抗體中的某些抑制F0XP3+Treg的抑制性功能(圖17)。有力抑制來自Trl細胞和CD4+CD25*CD127T0XP3+Treg的IL-10生產的五種抗體中三種(119-8B、119-43、119-122、119-173B 和 106-222)在阻斷 CD4+CD25 高CD127_F0XP3+Treg 功能上是有力的(圖17)。然而，11種抗體中的兩種(119-33和120-140A)無抗IL-10生產的活性但阻斷 CD4+CD25 高FOXP3+Treg 功能(圖18)。抗人0X40單克隆抗體通過例如將6-8周大的BALB/c小鼠與用人0X40按照已知程序轉染的小鼠細胞系免疫進行抗人0X40單克隆抗體的生成。建立並進一步分析了分泌特異性染色0X40+細胞的單克隆抗體的雜交瘤克隆。我們設計全面篩選以檢測通過抑制Trl細胞的生成和功能觸發0X40信號傳導的那些克隆(激動型抗體)。進一步純化這些克隆。抗h0X40的激動型抗體可被人源化並且單獨或與抗腫瘤疫苗或其他佐劑組合用於人類抗腫瘤治療的臨床程序。幾種不同的腫瘤類型可以作為這些抗體的靶，包括黑素瘤、淋巴瘤和乳腺癌。在另一個實施方案中，將6-8周大的BALB/c雌性小鼠用於足墊或皮下免疫。每個小鼠用由人0X40(L-0X40)轉染的5百萬個小鼠L細胞以3天的間隔注射6次。第六次注射之後三天，使用已有的程序將小鼠安樂死並且移除胭淋巴結(來自足墊免疫)或脾(來自皮下免疫)並且將細胞與SP2 .0骨髓瘤或NSO骨髓瘤細胞以I比I的比例融合以生成雜交瘤克隆。之後通過ELISA測定篩選分泌單克隆抗體的雜交瘤克隆的與L-h0X40細胞的結合特異性。通過流式細胞計數分析進一步確定與L-h0X40細胞結合但不與L親本細胞結合的雜交瘤在L-h0X40和SUPM2-h0X40細胞上的結合。在圖10的實驗中，通過ELISA篩選抗L_h0X40對比L親本細胞的h0X40雜交瘤上清液。選擇了二十種h0X40特異性單克隆抗體。通過將細胞與溶於PBS的0.01%氯化鎂鈣混合將表達人0X40 (L-h0X40)的兩千萬細胞包被在96孔板上並在層流罩中乾燥過夜。之後將板在使用前於-20°C冷凍至少一天。對於抗體結合測定，將冷凍的細胞用PBS再水化並用含有PBS加上0.05% Twen 20的清洗緩衝液清洗並且用溶於清洗緩衝液的2% BSA封閉。之後將調整的細胞用於結合0X40抗體上清液。之後用二級抗體抗小鼠IgG FC HRP檢測與細胞結合的抗體。h0X40特異性雜交瘤上清液識別表達0X40的L細胞但不識別親本L細胞。在圖11的實驗中，通過流式細胞計數分析篩選h0X40特異性單克隆抗體。相等數目(IOOk)的L細胞和L-h0X40在FACS緩衝液(I % FCS/2mM EDTA/PBS)中混合且與0.5 μ g的FPLC(Protein A HiTrap/Gentle Ag/Ab清洗緩衝液)純化抗體一起孵育。之後將細胞清洗並用二級抗體PE軛合的抗小鼠IgG染色。兩個峰指示抗h0X40單克隆抗體的陽性和陰性染色。單個峰表明沒有結合抗體或抗體的非特異性結合。通過流式細胞計數分析證實二十種h0X40特異性單克隆抗體。在圖12的實驗中，通過使用表達h0X40的SUPM2細胞(SUPM2_h0X40)證實h0X40單克隆抗體特異性。如圖11中將相等數目(look)的SUPM2和SUPM2-h0X40細胞在FACS緩衝液(l%FCS/2mM EDTA/PBS)中混合併用於h0X40單克隆抗體結合。通過流式細胞計數分析每種抗體的結合特異性。兩個峰指示抗h0X40單克隆抗體的陽性和陰性染色，而單個峰表明沒有結合抗體或抗體的非特異性結合。證實了二十種h0X40特異性單克隆抗體。在圖13的實驗中，我們尋求鑑定可抑制Trl細胞從由VitD3(10微摩爾mM)/Dex (50納M)、⑶32L/IC0SL和抗CD3/CD28 (0.2微克/ml)刺激的CD4+T細胞生成的人0X40特異性單克隆抗體。在細胞培養的第O天加入抗h0X40單克隆抗體並且在刺激7天後CD4+T細胞經歷IL-10細胞內染色以及之後的流式細胞計數分析。代表性的螢光活化細胞分選(FACS)數據示於A中而佔所有抗h0X40單克隆抗體處理的Trl細胞的百分比示於B。使用從這一實驗獲得的細胞，我們尋求鑑定刺激CD4+T細胞增殖(圖14，在刺激後第7天將細胞計數)並抑制Trl從CD4+生成(圖13)的h0X40特異性單克隆抗體。為了鑑定這些h0X40單克隆抗體抑制Trl細胞從⑶4+T細胞生成的能力，如上文圖13的實驗中所描述的生成並培養Trl細胞。代表性的FACS數據示於A而用九種抗h0X40單克隆抗體處理之後的Trl細胞的百分比示於B中。五種h0X40特異性單克隆抗體於4ng/ml濃度強烈抑制Trl細胞的生成(圖15)。在圖16A、16B和16C的實驗中，將新鮮分選的IC0S+CD4+CD127_CD25*T細胞用抗CD3 (0.2 μ g/ml)(在CD32L/IC0SL細胞和CD32L/h0X40L細胞存在的情況下)或抗h0X40單克隆抗體或對照抗體刺激5天。之後將細胞計數並將5xl04個細胞用抗CD3/CD28再刺激24h並用Elisa試劑盒檢測上清液的IL-10分泌。我們鑑定抑制Trl從⑶4+T細胞生成也抑制IL-10從天然的ICOS+⑶4+⑶25ST細胞產生的h0X40特異性單克隆抗體。將新鮮分選的IC0S+IC0S-CD4+CD127-CD25sTreg與CFSE標記的CD4+CD25低細胞在受輻照的單核細胞和抗⑶3 (0.3 μ g/ml)和抗h0X40mAb存在的情況下一起培養。培養3.5天之後，通過FACS通過細胞中CFSE的稀釋測定細胞增殖(圖16C)。圖17A和17B顯示抑制Trl細胞的生成並阻斷F0XP3+CD4+⑶25高Treg功能的抗h0X40單克隆抗體的鑑定。將新鮮分選的F0XP3+CD4+CD127-CD25高T細胞(3.5xl04)與CFSE標記的CD4+CD251ow細胞(7xl04) 一起在受輻照的單核細胞(7xl04,6000rad)和0.3 μ g/ml抗⑶3以及各種濃度的抗h0X40單克隆抗體存在的情況下培養。培養3至4天後，通過流式細胞計數分析通過測定細胞中CFSE的稀釋測定細胞增殖。表示分裂的細胞的百分比。代表性的流式細胞計數分析示於圖17A。6個單克隆抗體的數據示於圖17B。在圖18的實驗中，將新鮮分選的F0XP3+CD4+CD127-CD25高T細胞(3.5xl04)與CFSE標記的0)4+0)25<￡細胞(7xl04) 一起在受輻照的單核細胞(7xl04，6000rad)和0.3 μ g/ml抗⑶3以及各種濃度的0X40單克隆抗體存在的情況下培養。培養3至4天後，通過FACS通過測定細胞中CFSE的稀釋測定細胞增殖。數據代表兩個實驗。我們鑑定不抑制Trl生成但封閉F0XP3+CD4+CD25 sTreg功能的抗h0X40單克隆抗體。 在圖19A和19B的實驗中，將淋巴瘤來源的⑶4+⑶25ST細胞與從健康供體分離的CFSE標記的⑶4+⑶251ow細胞(7x104) —起在受輻照的同種異體單核細胞(7xl04，6000rad)和0.3微克/ml抗⑶3和25 μ g/ml的抗h0X40單克隆抗體存在情況下培養。培養3至4天後，通過FACS通過測定細胞中CFSE的稀釋測定細胞增殖。代表性的FACS分析數據示於19A中而佔所有實驗數據示於19B。我們發現h0X40激動型抗體阻斷淋巴瘤來源的 CD4+CD25 高Treg 功能。圖20顯示與人和恆河猴0X40特異性結合的激動型抗體的鑑定。恆河猴外周血單核細胞通過ficoll離心獲得。⑶4+T細胞通過⑶4微珠獲得。將⑶4+T細胞用10 μ g/ml的菜豆凝集素(PHA)刺激。刺激後兩天，將細胞用抗h0X40mAb染色之後用山羊抗小鼠IgG-APC和⑶69-PE染色。106-317作為陰性對照。顯示六種強烈活化T細胞增殖的抗h0X40 mAb可結合活化的恆河猴⑶4+T細胞。這些結果表明可在猴中測試這六種抗h0X40單克隆抗體的毒性。使用傳統融合程序獲得的500個抗人0X40陽性克隆中僅七個表現出促發0X40的特性，包括但不限於如表I中所公開的阻斷生成IL-10的Trl生成和nTreg抑制性功能的能力。表I List of 0X40特異性單克隆抗體的列表
權利要求
1.一種與0X40結合的分離的抗體，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:1的重鏈可變區⑶Rl ； (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:2的重鏈可變區⑶R2 ； (c)包含胺基酸序列SEQID N0.3的重鏈可變區⑶R3 ； (d)包含胺基酸序列SEQ ID N0.7的輕鏈可變區⑶Rl ； (e)包含胺基酸序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變區⑶R2和(f)包含胺基酸序列SEQ ID N0.9的輕鏈可變區⑶R3。
2.一種與0X40結合的分離的抗體，其包含(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:13的重鏈可變區⑶Rl ； (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:14的重鏈可變區⑶R2 ； (c)包含胺基酸序列SEQ ID N0.15的重鏈可變區CDR3 ； (d)包含胺基酸序列SEQ ID N0.19的輕鏈可變區CDRl ；(e)包含胺基酸序列SEQ ID N0.20的輕鏈可變區CDR2和(f)包含胺基酸序列SEQ ID N0.21的輕鏈可變區⑶R3。
3.一種與0X40結合的包含胺基酸序列SEQ ID N0.7或19的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:7或19的胺基酸序列具有90百分比同源性的胺基酸序列的抗體。
4.一種與0X40結合的包含胺基酸序列SEQ ID N0.8或20的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:8或20的氨基 酸序列具有90百分比同源性的胺基酸序列的抗體。
5.一種與0X40結合的包含胺基酸序列SEQ ID N0.9或21的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:9或21的胺基酸序列具有90百分比同源性的胺基酸序列的抗體。
6.一種與0X40結合的包含胺基酸序列SEQ ID N0.1或13的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:1或13的胺基酸序列具有90百分比同源性的胺基酸序列的抗體。
7.一種與0X40結合的包含胺基酸序列SEQ ID N0.2或14的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:2或14的胺基酸序列具有90百分比同源性的胺基酸序列的抗體。
8.一種與0X40結合的包含胺基酸序列SEQ ID N0.3或15的分離的抗體或一種包含與SEQ ID NO:3或15的胺基酸序列具有90百分比同源性的胺基酸序列的分離的抗體。
9.一種與0X40上的表位結合的分離的抗體，所述表位被具有包含SEQ ID N0.5或17的胺基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID N0.11或23的胺基酸序列的輕鏈可變區的抗體，或與其具有至少90百分比同源性的胺基酸序列的抗體識別。
10.一種與0X40結合的分離的抗體，其包括具有包含SEQ ID NO:7或19、SEQ ID NO:8或20、SEQ ID NO:9或21的胺基酸序列的⑶R的輕鏈可變區，或與其具有至少90百分比同源性的胺基酸序列的抗體。
11.一種與0X40結合的分離的抗體，其包括具有包含SEQ ID N0:1或13、SEQ ID NO:2或14、SEQ ID NO:3或15的胺基酸序列的⑶R的重鏈可變區，或與其具有至少90百分比同源性的胺基酸序列的抗體。
12.編碼如權利要求1至11中任一項所述的抗體的分離的核酸。
13.—種宿主細胞，其包含編碼如權利要求1至11中任一項所述的抗體的核酸。
14.一種生產抗體的步驟，其包含培養如權利要求13所述的宿主細胞的步驟。
15.如權利要求14所述的方法，其進一步包含從所述宿主細胞回收所述抗體的步驟。
16.如權利要求1至11中任一項所述的抗體用作藥物。
17.如權利要求1至11中任一項所述的抗體用於治療自身免疫性疾病。
18.如權利要求1至11中任一項所述的抗體用於治療癌症。
19.如權利要求1至11中任一項所述的抗體在藥物製備中的用途，其中所述藥物用於治療癌症或自身免 疫性疾病。
全文摘要
公開了與OX40特異性結合的人抗體，優選地重組的人抗體，人源化和嵌合的兩種。優選的抗體具有對OX40受體的高親和性並且體外和體內活化所述受體。所述抗體可以是全長抗體或其抗原結合部分。所述抗體或抗體部分被用於調節受體活性，例如在患有其中OX40活性是有害的病症的人類受治療者中。提供用於表達所述重組人抗體的核酸、載體和宿主細胞，以及還提供了合成重組人抗體的方法。
文檔編號C12N15/13GK103221427SQ201180051223
公開日2013年7月24日 申請日期2011年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者劉勇軍, 鄔揭新, 蘿拉·博韋爾, 鶴下直也, J·雲·曹, 尚卡爾·庫馬爾 申請人:德克薩斯州立大學董事會