菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht1-FEHII及其應用的製作方法

2023-06-08 13:51:06 1

菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht1-FEH II及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht1-FEH II及其應用。一種菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht1-FEH II，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其編碼的蛋白質，具有如SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列。所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因Ht1-FEH II可在菊芋水解菊粉生產果糖類物質中應用，也可在提高植物抗旱能力中應用。
【專利說明】菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 HtI-FEH I I及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於基因工程領域，涉及菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II及其 應用。

【背景技術】
[0002] 植物果聚糖是由蔗糖與一個或多個果糖基相連接的聚合物，主要分布在禾本科 (如小麥（Triticum aestivum)和大麥（Hordeum vulgare))、百合科（洋蔥（Allium cepa) 和大蒜（Allium sativum))以及菊科（菊苣（Cichorium intybus)和菊芋（Helianthus tuberosus))等植物中（Livingston III et al. 2009 ;Vijn and Smeekens 1999)。大約 15%的被子植物以果聚糖作為其主要的碳水化合物（Hendry 1993)。自然界中的果聚糖 可以分為五類：線性菊糖型果聚糖（Inulin)、梯牧草糖型果聚糖（Levan)、混合型果聚糖 (Branched)、菊糖型果聚糖新生系列（Inulin neoseries)和梯牧草糖型果聚糖新生系列 (Levan neoseries)。線性果聚糖是由果糖基僅通過β (2-1)鍵或者β (2-6)糖苷鍵連接 而成。從菊芋塊莖和菊苣主根中提取的菊粉（Inulin)就是線性果聚糖的一種，基本由果 糖基通過β (2-1)鍵連接，末端存在一個葡萄糖基（Van den Ende et al. 2004 ;Eskandari Nasab et al. 2009)。而雞腳草中以β (2-6)糖苷鍵連接而成的梯牧草糖型果聚糖（Levan) 就是線性果聚糖的另一種（成善漢et al. 2002)。分支類型的果聚糖是指果糖基同時以 β (2-1)鍵和β (2-6)糖苷鍵連接而成的果聚糖類型，小麥和大麥等植物中的果聚糖主要 就是這種類型。新生系列的果聚糖就是在葡萄糖殘基的兩側均連接果糖基的一種果聚糖 類型，此類果聚糖在洋蔥和黑麥草等植物中存在（Chalmers et al. 2005)。此外，果聚糖 作為一種功能性食品，是糖尿病、高血壓患者的良好食品和甜味劑，具有廣泛的應用前景 (Ritsema and Smeekens 2003b)〇
[0003] 菊芋（Helianthus tuberosus)塊莖中的線性菊糖型果聚糖含量佔塊莖乾重的 85%，聚合度較低，在 3 ?50 之間（Edelman and JEEE0RD 1968 ;Marx et ah 1997)。菊芋 中的果聚糖一般以鹿糖為前體，由鹿糖：鹿糖卜果糖基轉移酶（Sucrose:Sucrosel-Fruct osyltransferase，簡寫為1-SST)和果聚糖：果聚糖1-果糖基轉移酶（Fructan:Fructan 1-Fructosyltransferase，簡寫為1-FFT)催化合成。其他物種中結構更複雜的果聚糖 的合成，還需要例如果聚糖：果聚糖6G-果糖基轉移酶（Fructan:Fructan6G-F;ructosy ltransferase，簡寫為6G-FFT)和鹿糖：果聚糖6-果糖基轉移酶（Sucrose: Fructan 6-fructosyltransferase，簡寫為 6-SFT)等酶的參與（Lasseur et al. 2006 ;Sprenger et al. 1995)。
[0004] 植物中負責果聚糖降解的酶主要是果聚糖外切水解酶（fructan exohydrolase， 簡寫為FEH)。目前植物中至少有三種類型的FEH存在，果聚糖1-外切水解酶 (Fructanl-exohydrolases，簡寫為1-FEH)水解果聚糖的β (2-1)糖苷鍵，果聚糖6-外切 水解酶（Fructan6_exohydrolases，簡寫為 6-FEH)負責水解 β (2-6)糖苷鍵，而 6&1-FEH 能同時水解上述兩種糖苷鍵。另外，果聚糖的完全降解還需要轉化酶（Invertase，簡寫 為INV)的參與，因為FEH酶水解的最終產物是果糖和蔗糖（Verhaest et al.2007)，蔗糖 的進一步水解是通過轉化酶（INV)的作用生成果糖和葡萄糖而完成的（Sturm 1999)。隨 著植物中I-FEH在2000年第一次從菊苣中克隆得到I-FEH I，2001年再次從菊苣中克隆 到兩個 I-FEH II (1-FEH IIa and IIb)後（Van den Ende et al. 2000 ;Van den Ende et al. 2001)，到目前為止，1-FEH 在黑麥草（Lolium perenne)、斑鳩菊（Vernonia herbacea)、 牛蒡（Arctium lappa)、小麥和風鈴草（Campanula rapunculoides)等植物中的cDNA均已 報導（Asega et al. 2008 ;Le Roy et al. 2007b ;Lothier et al. 2007 ;Ueno et al. 2011 ; Van den Ende et al. 2003a)。6-FEH 在梯牧草（Phleum pratense)中被發現對果聚糖具 有很好的水解功能（Tamura et al. 2011)，同時6&1-FEH在小麥中被發現（Kawakami et al.2005)。兩個特定的優先水解鹿果三糖（6-kestose)的水解酶6-KEH在小麥中被確定 (Van den Ende et al. 2005)。有趣的是，FEHs也存在於一些非果聚糖植物中，例如6-FH1被 報導存在於甜菜（Beta Vulgaris)中，而I-FEHs存在於擬南芥中（De Coninck et al. 2005 ; Van den Ende et al. 2003b)。雖然早在1964年，Edelman和JefTord就在菊芋塊莖中發 現了至少有兩個水解線性果聚糖的水解酶（A和B) (Edelman and Jefford 1964) ,Stefan P. Marx也於1997年通過初步的蛋白提純SDS-PAGE已經發現菊芋中一個水解果聚糖的蛋白 組分，但是至今沒有該蛋白的胺基酸或核苷酸序列的公開報導。
[0005] 植物1-SSTs，I-FFTs和FEHs -般都認為是由植物INV轉化來的，這些蛋白質的一 級結構非常相似，它們同屬於植物糖苷水解酶家族（GH) 32 (Lammens et al. 2009 ;Van den Ende et al. 2009)。果聚糖的功能不僅是作為在植物中的儲備碳水化合物，而且在滲透調 節和非生物或生物脅迫應答中起重要作用。在風鈴草開花期間，果聚糖加速降解，FHl酶 活力也急劇增加，而這些變化都為風冷草的開花提供了用於滲透的調整的驅動力（Le Roy et al. 2007b)。在低溫條件下普遍存在的後期生長季節或長期存放，菊苣和菊芋果聚糖都 是由FEHs逐漸水解（Livingston III et al. 2009)。冷處理能夠提高小麥6&1-FEH wl 在冠部的轉錄水平，而1-FEH w2的轉錄水平沒有提高（Kawakami et al. 2005)，脫葉處 理造成 Ci 1-FEH II 的積累，而 Ci 1-FEH I 沒有（Kawakami et al. 2005 ;Van den Ende et al. 2001)，由此可見不同FEHs發揮著其獨特的作用。在某些情況下，FEHs甚至被發現涉及 到果聚糖的生物合成中而非果聚糖降解，因為它們充當了合成特殊類型的果聚糖的修飾酶 (Lothier et al. 2007)。 申請人:在CN102653769A中公開了一種菊芋果聚糖1-外切水解酶 基因 Ht 1-FEH，但僅公開了該基因具備耐鹽功能。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II。
[0007] 本發明的另一目的是提供該基因的應用。
[0008] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0009] 一種菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列。
[0010] 所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II優選以菊芋品種"南芋1 號" cDNA為模板，以picFEH II-F和picFEH II-R為引物，通過PCR擴增得到。
[0011] 所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II編碼的蛋白質，具有如SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。
[0012] 一種含有本發明所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II重組載體。
[0013] 所述的重組載體，優選將菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II插入表達載 體pPICZ a C的XhoI和XbaI酶切位點之間所得。
[0014] 一種含有所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II的畢赤酵母。
[0015] 所述的畢赤酵母優選將上述的重組載體經限制性內切酶SacI酶切線性化，將該 線性化的重組載體DNA電轉化Pichia pastoris Χ-33酵母，使線性化的重組載體DNA與宿 主基因組DNA進行同源重組整合而得到的。
[0016] 所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II在菊芋水解菊粉生產果糖類物 質中的應用。
[0017] 所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II在提高植物抗旱能力中的應 用。
[0018] 所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II在培育轉基因抗旱植物中的應 用。
[0019] 有益效果：
[0020] 本發明設計特異引物，在菊芋中成功克隆了一個果聚糖外切水解酶基因，命名為 Htl-FEH II，該基因的⑶S全長為1746bp，編碼581個胺基酸，等電點為4. 87。通過對該基 因的初步序列分析表明，Htl-FEH II是一個果聚糖外切水解酶，具有糖苷水解酶32 (GH32) 家族相同的三個保守基序（NDPN、RDP和EC)。胺基酸序列的信號肽和糖基化位點預測結果 表明，Htl-FEH II可能有一條包括25個胺基酸殘基的信號肽序列和4個糖基化位點。基 因表達模式分析結果表明，Htl-FEH II主要在剛剛萌發的塊莖中表達，參與菊芋塊莖萌發 過程中果聚糖降解代謝的轉錄調控。
[0021] Stefan P. Marx在1997年通過蛋白純化的手段，初步提純了一個菊芋I-FEH蛋 白，但該研究存在以下三個問題：1.該研究並沒有獲得該I-FEH的蛋白或者核苷酸序列，缺 少關鍵的核苷酸序列將不可能將該基因運用到農業生產實踐和工業化中。2.根據Stefan P. Marx和申請者本人的推測，目前菊芋中應該有2?3個I-FEH基因家族成員，各成員間核 苷酸序列和蛋白基本性質不盡相同。3.該作者並沒有對提純的I-FHl在植物鹽分反應中的 功能進行探討。
[0022] 本發明利用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris X-33)表達系統對菊芋果聚糖外 切水解酶基因 Htl-FEH II進行異源表達和功能驗證。I-FEH II表達產物重組蛋白具有菊 糖型果聚糖（inulin)水解酶活性，而對蔗糖和利雲型果聚糖（Ievan)幾乎沒有水解活性。 因此，初步推斷Htl-FEH II為水解β (2-1)型糖苷鍵的果聚糖外切水解酶基因，與預測的 結果相符。
[0023] 本發明研究在菊芋塊莖萌發期，乾旱逆境下在塊莖中Htl-FEH II的表達調控機制 和菊芋I-FEH酶活變化，結果表明在處理後第1天，Htl-FEH II轉錄水平有所上升，同時菊 芋中I-FHl酶活在乾旱脅迫下高於對照組。由此說明，乾旱脅迫下果聚糖水解酶Htl-FEH II基因在塊莖中的轉錄正調控和I-FEH酶活的提高可以促進果聚糖水解生成單糖或非還 原糖，而這些滲透調節物質的增加則有利於菊芋在乾旱脅迫下的生理防衛。因此，該基因可 用於培育轉基因抗旱植物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1、菊芋果聚糖外切水解酶I-FEH II基因的⑶S全長擴增結果；I :PCR結果，M : Marker，箭頭表示目的條帶。
[0025] 圖2、Htl-FEH II與已知的相近物種的胺基酸序列比對分析；方框內表示保守結 構域，橢圓內表示可能的糖基化位點。
[0026] 圖3、Htl-FEH II與相關蛋白序列的系統發育進化樹。
[0027] 圖4、純化後的Htl-FEH II重組蛋白的酶活的最適pH(A)和最適溫度（B)。
[0028] 圖5、全生育期內Htl-FEH II基因的實時定量表達。
[0029] 圖6、塊莖萌發期，乾旱脅迫下Htl-FEH II在菊芋塊莖中的實時定量表達。
[0030] 圖7、塊莖萌發期，乾旱脅迫下I-FHl在菊芋塊莖中酶活力測定。

【具體實施方式】
[0031] 實施例IHtl-FEH II基因的克隆
[0032] 取菊芋品種"南芋1號" 4葉期幼嫩的葉片，參照OMEGA plant RNA提取試劑盒說 明書提取植物總RNA，用TaKaRa反轉錄試劑盒兩步法反轉錄得到cDNA模板。
[0033] 利用其它物種已有的I-FEH基因編碼序列（coding sequence，⑶S)序列到菊芋 (NCBI)和向日葵EST資料庫（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html)中 Blast，篩選相似性高的EST序列用DNAstar軟體進行拼接，得到一條全長為2061bp的EST 序列，將該EST序列與已有的I-FEH基因⑶S序列比對發現，該EST序列與菊苣的Cil-FEH IIa(AJ295033)CDS 序列相似性達 80. 3%，與 Cil-FEH IIb(AJ295034)CDS 序列相似性達 79. 6 %，而且還有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。於是，以全長序列為模板，用Primer Premier 5.0設計特異引物用於擴增Ht I-FEH⑶S全長序列，引物序列如下：
[0034] FEH II-F:5'CTTAAAACTCACGGATACC 3'（SEQ ID NO. 3)
[0035] FEH II-R:5,AAAGCAACAAAGAATGACC 3,（SEQ ID NO. 4)
[0036] 以上步得到的"南芋1號"cDNA為模板，FEH II-F和FEH II-R為引物PCR擴增目的 基因片段，反應體系如下：10 X PCR Buffer 2 μ L，IOmM dNTP 0.4 μ L，FHl-F(IOyM) IyL, FEH-R(K) μ Μ) 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq 酶 0· 2 μ L，ddH20 14. 4 μ L，總體積
[0037] 20 μ L〇
[0038] 反應程序：
[0039]

【權利要求】
1. 一種菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II，其特徵在於具有如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
2. 權利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II編碼的蛋白質，其特 徵在於具有如SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。
3. -種含有權利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II重組載體。
4. 根據權利要求3所述的重組載體，其特徵在於將菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II插入表達載體pPICZ a C的Xhol和Xbal酶切位點之間所得。
5. -種含有權利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II的重組畢赤 酵母。
6. 根據權利要求5所述的重組畢赤酵母，其特徵在於將權利要求3或4所述的重組載 體經限制性內切酶SacI酶切線性化，將該線性化的重組載體DNA電轉化Pichia pastoris X-33酵母，使線性化的重組載體DNA與宿主基因組DNA進行同源重組整合而得到的。
7. 權利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II在菊芋水解菊粉生產 果糖類物質中的應用。
8. 權利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II在提高植物抗旱能力 中的應用。
9. 權利要求1所述的菊芋果聚糖1-外切水解酶基因 Htl-FEH II在培育轉基因抗旱植 物中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104293811SQ201410479643
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】梁明祥, 許歡歡 申請人:南京農業大學