一種哺乳類動物生雌性控方法

2023-04-24 01:53:56 1

專利名稱：一種哺乳類動物生雌性控方法
技術領域：
本發明屬於哺乳類動物性別比例控制技術領域，特別涉及在雌性哺乳類動物體內殺死雄性胚胎的方法。
在公知技術中，與本發明較為相關的技術是利用含有H-Y抗體的抗血清在動物體外鑑別胚胎的性別。在這方面，南朝鮮的Im等人(Anim.Biotech.Bull.34-37，1991)，國內許曉霽等人(東北農學院學報，2∶186-191，1990)近年來都曾用含有H-Y抗體的抗血清鑑定過小鼠和兔子胚胎的性別，其準確率達80%左右。但由於這種方法需要先將胚胚移到動物體外，經鑑定性別後，再移回動物體內，所以不僅技術複雜，操作麻煩，同時還降低了胚胎的活力，使其成活率下降，致使這種方法難以在生產中推廣應用。
本發明的目的在於提供一種在哺乳類動物體內能有效地殺死雄性胚胎並使之多生雌性後代的方法。
本發明所依據的理論是免疫學原理，即在雄性胚胎中存在有H-Y抗原，可與H-Y抗體發生反應，如有補體存在，則可介導補體參與反應，從而導致雄性胚胎溶解死亡。本發明的技術解決方案可以包括下述兩個方面1、在雌性動物受精後3-5天，胚胎發育至8細胞期至早期囊胚階段時，把H-Y單克隆抗體與補體同時輸入懷孕動物的子宮角，在懷孕動物體內殺死雄性胚胎。
2、一種用於在懷孕動物體內殺死雄性胚胎的H-Y單克隆抗體的製備方法，包括(1)用G57BL/6純系小鼠製取脾細胞;
(2)篩選並準備SP2/0骨髓瘤細胞;
(3)飼養細胞;
(4)將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合;
(5)篩選含有雜交瘤的陽性孔及克隆;
(6)收集H-Y單克隆抗體;
(6.1)血清DMEM培養上清液;
(6.2)無血清DMEM培養上清液;
(6.3)給C57BL/6雌性小鼠接種;
(7)對雜交瘤細胞及H-Y單克隆抗體進行鑑定，其主要特點是
(1.1)將雄性小鼠脾細胞注射給雌性小鼠的時間為連續56-91天，每7天注射一次，於第42-77天時進行眼眶採血，檢測血清抗體效價;
(5.1)用生物素化第二抗體和酶標記親合素代替常規ELISA的酶標記第二抗體，用含有BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸鹽緩衝液)作為衝洗液衝洗ELISA反應板;
(5.1.1)BSA的濃度為0.1%。
本發明具有以下積極效果1.本發明為哺乳類動物特別是家畜生雌性控技術的應用提供了一條新的途徑。通過對30隻小鼠和10隻家兔的試驗，在獲得的100多隻後代中，雌性後代的百分率平均為84%以上。
2、使用本發明無論多胎動物還是單胎動物均可多生雌性。在多胎動物中，如綿羊、山羊，用PMSG(孕馬血清促性腺激素)和HCG(人絨毛膜促進腺激素)使動物多排卵，然後再應用H-Y單克隆抗體。這樣在殺死雄性胚胎之後，所剩雌性胚胎的數目比自然排卵的總數還多，因此，在使動物多生雌性後代的同時，後代總數也有所增加。在單胎動物中，如奶牛，如果懷孕雌性胚胎，則在應用H-Y單克隆抗體之後，對其無任何不良影響;若懷孕雌性胚胎，則將其殺死。待過一個發情周期後，再行配種，其結果使奶牛多生雌性後代。
3、成本低。據計算，利用本發明使家兔、綿羊、奶牛每生一隻(頭)雌性後代的花費僅分別為0.5元、5元和10元人民幣，而產生的經濟效益則比自然生產提高一倍至幾十倍。
4、方法簡便，容易操作，便於推廣。應用本發明時，只需把H-Y單克隆抗體輸入子宮，故一般同行技術人員都可以熟練掌握操作。對H-Y單克隆抗體，只要具備所需的實驗室條件，按本發明的方法，步驟便可製取。
下面結合實施例對本發明作進一步闡述實施例1應用H-Y單克隆抗體可使小鼠多生雌性後代。具體做法是分別挑選30隻2月齡雌性和20隻3月齡體大，健康的雄性普通昆明小鼠(北京醫科大學實驗動物部提供)，雌鼠分10個籠子飼養，公鼠則一個籠子飼養一隻，自由採食顆粒飼料和飲水。試驗期間白天開日光燈增強光照，晚間關燈。試驗開始時，先對雌性小鼠進行超數排卵處理。超排處理的第一天，每隻小鼠腹腔注射PMSG(衛生部長春生物製品廠生產)3單位，第三天同法注入HCG(上海生物製品廠生產)3單位。第三天傍晚把按上述方法處理過的小鼠與公鼠合籠。次日檢查陰道栓，並作記錄。見栓後的第3天和第4天腹腔注入0.05毫升戊巴比妥鈉(33mg/ml)，隨後將一外徑為0.1-0.2毫米的塑料軟管通過陰道插入子宮，並通過該導管輸入單克隆抗體及補體各0.5毫升，提起後腿約1分鐘，放回籠內飼養。21天後生產。在小鼠生長至半月齡後可檢查雌雄比例。結果表明，後代中雌性佔85%。
實施例2應用H-Y單克隆抗體可使家兔多生雌性後代。具體做法是挑選10隻4月齡健康母兔和5隻6月齡公兔，單兔單籠飼養，自由採食配合飼料和飲水。試驗開始時，先對母兔給予超排處理。超排處理的第一天背部皮下注射PMSG 100單位，第3天同法射HCG80單位後，放入公兔交配。於交配後第3天和第4天，由一人固定母兔，一人將一外徑為0.5毫米的橡膠導管通過陰道，插入子宮約3釐米，並通過該管將2毫升單克隆抗體和2毫升1∶20倍稀釋的補體輸入子宮。然後提起後腿約1分鐘。試驗結果表明，後代中雌性佔83.3%。
實施例3應用H-Y單克隆抗體可使奶牛多生雌性。奶牛是單胎動物，因此不必作超排處理。於人工授精或交配後第3天和第5天，先直腸檢查診斷黃體在那一側卵巢，然後通過一市售的衝取胚胎所用的橡膠管，將H-Y單克隆抗體和1∶20倍稀釋的補體各10毫升，輸入黃體所在一側的子宮角，隨後用手通過直腸由後向前按摩子宮角1分鐘。如懷雌性，則在282天前後出生，若懷有雄性，則被殺死，一個發情周期後又發情，這時可再配種或授精，並需再次輸入H-Y單克隆抗體和補體。
實施例4H-Y單克隆抗體的製備1、脾細胞的準備選取10隻10周齡純系C57BL/6雌性小鼠，用同系雄性小鼠的脾細胞經腹腔進行免疫，每7天一次，每次劑量為2.8×10^P6細胞，連續注射56-91天，於第42-77天時進行眼眶採血，用精子細胞毒試驗檢測血清抗體效價(其方法由Goldbery)描述，見Nature雜誌232∶478，1971)。挑選4隻血清抗體效價好的小鼠於最後一次免疫注射的第3天，眼眶放血致死小鼠無菌取出脾臟，用無血清DMEM培養液衝洗後置培養皿中，用6號針頭在脾臟上扎數個小孔，用注射器通過4號針頭向脾臟內注射DMEM，以便衝出脾細胞，細胞懸液經100目不鏽鋼篩過濾除去小組織塊，取細胞樣品計數。
2、sp2/o骨髓瘤細胞的準備SP2/0骨髓瘤細胞，經快速解凍後，用無血清DMEM洗兩遍以除去其中的冷凍保護劑，換上血清DMEM，並移入培養瓶中，置5%CO^Q2，37℃條件下培養，待其生長良好時，換以8-氮雜鳥嘌呤-DMEM繼續培養3代，取部分細胞用HAT-DMEM選擇培養液培養，證明細胞不能在其中生長時，恢復血清DMEM培養，待其達到對數生長期，取樣計數，準備融合。
3、飼養細胞的準備於融合前和每次克隆前準備飼養細胞。選擇體格較大的C57BL/6雌性小鼠，斷頸法處死後，消毒皮膚，無菌條件下向腹腔注射無血清DMEM10-15毫升，輕按腹部1-2分鐘後，抽取腹水，離心棄上清液，換以含血清DMEM，分加在96孔培養板上，每孔0.1毫升，培養過夜。
4、細胞融合及培養把脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按7.5∶1的比例混合於50毫升離心管中，100rpm(約200g)離心8分鐘，儘量棄去上清液，用手指輕彈管底，使細胞混勻，置離心管於37℃水浴中，0.5毫升預溫的PEG(聚乙二醇)，緩慢滴入細胞懸液中邊加邊彈動管底，PEG於1分鐘內加完，37℃水浴中靜止90分鐘後，緩慢滴入預溫的無血清DMEM，前5分鐘加5毫升，輕輕混勻，防止衝散雜交瘤細胞，再於5分鐘內加入10毫升，最後5分鐘加入20毫升，輕輕轉動離心管後，700rpm離心5分鐘，棄去上清液，緩慢加入HAT-DMEM，用吸管輕輕混勻，移入已鋪有飼養細胞的96孔培養板中培養。每4天換一次培養液，第12天換以HT-DMEM，第16天換以含血清DMEM。
5、篩選含有雜交瘤的陽性孔及克隆以ELISA篩選陽性孔，其操作如下割下普通昆明小鼠尾巴，剝下皮膚，用壬氏液衝洗乾淨，放入1%胰酶溶液中，10-30分鐘後，取出皮膚，用壬氏液洗3遍，將皮膚平貼於培養皿底上，加入1毫升0.1%胰酶溶液，用一玻璃棒輕輕從皮膚上刮下表皮細胞，用吸管反覆吹打，直到細胞團散開。將細胞按每孔0.05毫升分加到96孔ELISA反應板上，每孔約10^P5細胞，放入4℃冰箱過夜。然後按下述步驟操作0.1%BSA--PH7.4,0.01MPBS洗3遍↓加0.05毫升H-Y單克隆抗體1小時↓振動BSA-PBS洗3遍加0.05毫升生物素化第二抗體(11000)1小時↓振動BSA-PBS洗3遍↓加0.05毫升酶標親合素(11000)0.5小時↓振動BSA-PBS洗5遍↓加0.05毫升底物溶液(聯苯二胺)10－20分鐘↓振動加入0.05毫升 2M硫酸終止反應↓酶聯儀上測定OD值那些OD值顯著高於陰性對照的孔為陽性孔。陰性對照孔只是不加入H-Y單克隆抗體，而加入雌性小鼠血清，其餘操作同上述步驟。
6、收集H-Y單克隆抗體(1)血清DMEM培養上清液將經過第三次克隆的雜交瘤細胞擴大培養，每隔2-3天收集一次上清液，上清液經2500rpm離心10分鐘，-30℃保存。
(2)無血清DMEM培養上清液收集對數生長期的雜交瘤細胞，800rpm離心10分鐘，將細胞重新懸浮在無血清DMEM中，調節至106細胞/毫升，繼續培養4-5天，2500rpm離心10分鐘，收集上清液，-30℃保存。
(3)動物接種選擇2月齡C57BL/6雌性小鼠10隻，每隻腹腔注射0.5毫升降植烷(英文名稱pristine)，約3周後，挑選腹部膨大的小鼠，每隻再注射生長期雜交瘤細胞1毫升(10^P6細胞)，10-15天後，小鼠腹部進一步增大，抽取腹水，18，000rpm離心15分鐘，取上清液經ELISA檢測效價後，-30℃保存。
7、雜交瘤細胞及H-Y單克隆抗體的鑑定(1)對雜交瘤細胞採用染色體計數來鑑定，方法如下取一瓶雜交瘤細胞，培養至生長旺盛期，在收穫前2.5小時加入秋水仙素，，使最終濃度為0.1微克/毫升。收穫細胞800rpm離心7分鐘，棄上清液，向管底的細胞加入5毫升0.75M的氯化鉀溶液，並在37℃水浴中放置15分鐘，再離心，棄去上清液，向管底細胞緩慢加入5毫升固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)，搖動5分鐘，棄去上清液，加入固定液。按上述方法再固定一次後，取少量細胞滴在載玻片上，吹乾，用姬姆薩染色溶液染色15-20分鐘。把載玻片放在顯微鏡下計算雜交瘤細胞的染色體數目。
通過對200個雜交瘤細胞的染色體分析，證明其染色體目為86-114條。在融合前，SP2/0細胞的染色體數目為72條，而融合後加入了一些脾細胞的染色體。因此，雜交瘤細胞染色體數目為86-114條，說明融合成功。
(2)H-Y單克隆抗體的鑑定H-Y單克隆抗體的鑑定包括確定其所屬類別，其對胚胎表面H-抗原的結合能力兩方面。
A、所屬類別以下述瓊脂雙擴散法來分析將用無血清DMEM培養液製備的H-Y單克隆抗體冷凍乾燥濃縮約20倍後，加入瓊脂板中間孔中，在周圍孔中分別加入IgG1，IgG2，IgG，(H+L)，IgM等免疫球蛋白。把瓊脂板在培養箱中放置24小時，然後觀察到在IgM孔與中間孔中間有反應線出現，從而說明H-Y單克隆抗體屬IgM亞類。
B、與胚胎H-Y抗原結合的能力用胚胎免疫螢光試驗證明，方法如下挑選8細胞期至早期囊胚期胚胎↓用PH7.4,0.01MPBS洗3遍加入124稀釋的單克隆抗體5％CO2,37℃↓45分鐘PBS洗3遍↓11000螢光標記第二抗體5％CO2 45分鐘37℃↓PBS洗兩遍↓置螢光顯微鏡下觀察對468枚胚胎分析表明，各有約50%的胚胎表現特異螢光和不表現特異螢光，分別代表雄胚胎和雌胚胎，符合自然性別比例，說明H-Y單克隆抗體能與胚胎H-Y抗原結合。
權利要求
1.一種哺乳類動物生雌性控方法，其特徵在於把H-Y單克隆抗體和補體輸入懷孕動物的子宮角，在懷孕動物體內殺死雄性胚胎。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於在向懷孕動物體內輸入H-Y單克隆抗體的同時輸入補體。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其特徵在於可以在雌性動物受精後3-5天，胚胎發育至8細胞期至早期囊胚階段時輸入單克隆抗體和補體。
4.一種用於在懷孕動物體內殺死雄性胚胎的H-Y單克隆抗體的製備方法，包括(1)用C57BL/6純系小鼠製取脾細胞;(2)篩選並準備SP2/0骨髓瘤細胞;(3)飼養細胞;(4)將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合;(5)篩選含有雜交瘤的陽性孔及克隆;(6)收集H-Y單克隆抗體;(6.1)血清DMEM培養上清液;(6.2)無血清DMEM培養上清液;(6.3)給C57BL/6雌性小鼠接種;(7)對雜交瘤細胞及H-Y單克隆抗體進行鑑定;其特徵在於(1.1)將雄性小鼠脾細胞注射給雌性小鼠的時間為連續56-91天，每7天注射一次，於第42-77天時進行眼眶採血，檢測血清抗體效價;(5.1)用生物素化第二抗體和酶標記親合素代替常規ELISA的酶標記第二抗體，用加有BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸鹽緩衝液)作為衝洗液衝洗ELISA反應板;(5.1.1)BSA的濃度為0.1%。
全文摘要
本發明屬於哺乳類動物性別比例控制技術領域，特別涉及在雌性哺乳類動物體內殺死雄性胚胎的方法。其特點是把H-Y單克隆抗體和補體輸入懷孕動物的子宮角，在懷孕動物體內殺死雄性胚胎。試驗表明，用該方法可以使後代雌性的百分率達84％以上。本方法操作簡便、安全可靠，適用於各種哺乳類動物特別是家畜的雌性擴繁生產。
文檔編號A61D19/00GK1062460SQ9210034
公開日1992年7月8日 申請日期1992年1月20日 優先權日1992年1月20日
發明者曹文廣, 董偉 申請人:北京農業大學