一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法
2023-06-09 05:15:01
專利名稱：：一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法
技術領域：
：本發明屬於微生物發酵
技術領域：
，具體涉及一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法。
背景技術：
：阿維菌素(Avermectins)是1976年美國Merck公司從日本北裡研究所提供的一株放線菌新種一-阿維鏈黴菌(Str印tomycesavermitilis，簡稱S.avermitilis)發酵中獲得一簇結構相似的新型化合物。它是一類新型大環內酯類抗生素，其分子由一個16元內酯環與兩個齊墩果糖糖苷配基構成。天然阿維菌素有八種組分，主要是在C5、C22-C23和C26等三個位置存在結構差異。八種組分中以Bla的殺蟲活性最高，其它異構體殺蟲活性較低且毒性較高。在通常情況下，菌株的發酵產物中Ala、A2a、Bla和B2a組分之和的比例在80%以上，而Alb、A2b、Blb和B2b組分之和的比例在20。/。以下。該簇結構相似的化合物被統稱為阿維菌素或稱阿弗菌素。阿維菌素對家畜的腸內寄生蟲具有極其有效的驅蟲活性，並具有作用機制獨特、有效劑量低、安全性高等特點，是一種有著良好市場應用前景的生物農藥；同時阿維菌素也是高效的殺蟲、殺蟎劑，其衍生物也可用於治療人類由於蟎蟲或線蟲引起的疾病。現有，對阿維鏈黴菌的培養主要採用菌絲接種培養和挖塊接種培養，這兩種接種方式接種量很難控制，發酵結果不穩定，效價增幅不明顯。
發明內容針對現有技術中存在的問題，本發明通過採用全孢子接種，設計提供一種生產阿維菌素的方法。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於包括以下工藝步驟(1)將阿維鏈黴菌接種至斜面培養基，在溫度27-29"C下，培養7-9天；(2)取上述的阿維鏈黴菌孢子斜面，用無菌水振蕩洗滌斜面製備成孢子懸浮液；(3)計算孢子懸浮液中孢子的數量，然後用移液管吸取孢子懸浮液至種子培養搖瓶中的種子培養基中，使每毫升種子培養基的孢子接種量為4X107-6X107個，種子培養搖瓶裝量為30-50ml種子培養基/250ml搖瓶；(4)將步驟(3)的孢子懸浮液進行搖床培養，在溫度27-29'C下，轉速為200-300r/mim的旋轉式搖床上培養40-48小時，得到全孢子液；(5)取上述的全孢子液，按培養基體積3%-7%的接種量，接種到發酵培養基中，進行搖床培養，發酵搖瓶裝量為20-40ml發酵培養基/250ml搖瓶，在溫度27-29。C下和溼度40%-50%下，轉速為200-300r/mim的旋轉式搖床上培養240-260小時，得到含有阿維菌素的發酵液。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於所述的斜面培養基組分重量百分比為酵母膏O.1%、麥芽糖O.1%、胰蛋白腖0.2%、葡萄糖0.4%、瓊脂粉2%，餘量為蒸餾水，並使pH值調至7.2。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於種子培養基含有玉米澱粉30g/L、玉米漿5g/L、酵母膏15g/L、KH2P044g/L、MgSO4*7H200.2g/L，並調pH為7.0-7.2。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於發酵培養基含有玉米澱粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生餅粉5g/L、KH2P040.5g/L，並調pH為7.0-7.2。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(3)中用採用血球記數板計算孢子懸浮液中孢子的數量，每毫升種子培養基的孢子接種量為4X107-5X17個，種子培養搖瓶裝量為30-40ml種子培養基/250ml搖瓶。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(3)中每毫升種子培養基的孢子接種量為5X107-6X17個，種子培養搖瓶裝量為40-50ml種子培養基/250ml搖瓶。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(4)中搖床培養條件為溫度為27-28°C，搖床轉速為230-270r/mim，培養時間為42-46小時。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(4)中搖床培養條件為溫度為28-29°C，搖床轉速為240-260r/mim，培養時間為43-45小時。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(5)中搖床培養條件為種子搖瓶裝量為25-35ml發酵培養基/250ml搖瓶，接種量為3%_5%，溫度為27-28。C，搖床轉速為230-270r/mim，培養時間為245-255小時。所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(5)中搖床培養條件為種子搖瓶裝量為28-32ml發酵培養基/250ml搖瓶，接種量為5-7%，溫度為28-29。C，搖床轉速為240-260r/mim，培養時間為247-253小時。本發明通過對阿維鏈黴菌通過純化培養、種子培養和發酵培養，最後得到阿維菌素，此方法設計合理，簡單易行。通過確定孢子的接種量和孢子接種到發酵培養基的時機，確定了最優條件，本發明與挖塊接種和菌絲接種相比，孢子接種方式不僅在接種量上易控制，發酵結果較穩定，效價增幅上比挖塊接種及菌絲接種有優勢，最大的效價達到4600ug/ml以上。採用全孢子接種方式，連續進行5批搖瓶發酵，並以常規的挖塊接種和菌絲接種培養作為對照。每批實驗採用6個發酵搖瓶，260h放瓶測效價並計算平均值，孢子接種阿維菌素的最終效價遠高於挖塊接種和菌絲接種，其5批實驗平均效價均處於4600ug/ml以上，批次實驗之間效價結果較為穩定，這是因為而孢子接種可以保持一個較為穩定的接種量，同時又由於孢子接種時孢子分散性好、懸浮液較為均勻，所以批實驗重複性相對較好。而挖塊接種和菌絲接種方式的效價較低，5批均低於4000txg/ml，而且批次實驗重複性不好，效價變化幅度比較大。圖1孢子接種與挖塊接種的阿維菌素效價增幅趨勢；圖2採用不同接種方式的發酵過程中總糖的變化趨勢；圖3採用不同接種方式的發酵過程中還原糖的變化趨勢；圖4採用不同接種方式的發酵過程中氨基氮的變化趨勢；圖5採用不同接種方式的發酵過程中pH的變化趨勢；圖6採用不同接種方式的發酵過程中效價變化趨勢。具體實施例方式本發明所用的阿維鏈黴菌(Str印tomycesavermitilis)，由浙江升華拜克生物股份有限公司提供。配置培養基斜面培養基酵母膏O.1%、麥芽糖O.1%、胰蛋白腖0.2%、葡萄糖0.4%、瓊脂粉2%、餘量為蒸餾水，並使pH值調至7.2。種子培養基玉米澱粉30g、玉米漿5g、酵母膏15g、KH2P044g、MgS04'7H200.2g和蒸餾水1000ml,並調PH為7.0-7.2。發酵培養基玉米澱粉120g、酵母粉15g、豆粕粉5g、花生餅粉5g、KH2P(X0.5g和蒸餾水1000ml，並i周pH為7.0-7.2。並調PH為7.0-7.2。實施例(1)將阿維鏈黴菌接種至斜面培養基，在溫度28。C下，培養8天；(2)取上述的阿維鏈黴菌孢子斜面，用無菌水振蕩洗滌斜面製備成孢子懸浮液；(3)採用血球記數板計算孢子懸浮液中孢子的數量，然後用移液管吸取孢子懸浮液至種子培養搖瓶中的種子培養基中，使每毫升種子培養基的孢子接種量為5X107個，種子培養搖瓶裝量為40ml種子培養基/250ml搖瓶；(4)將步驟(3)的孢子懸浮液進行搖床培養，在溫度28。C下，轉速為250r/mim的旋轉式搖床上培養46小時，得到全孢子液；(5)取上述的全孢子液，按培養基體積5%的接種量，接種到發酵培養基中，進行搖床培養，發酵搖瓶裝量為30ml發酵培養基/250ml搖瓶，在溫度28。C下和溼度45%下，轉速為250r/mim的旋轉式搖床上培養250小時，得到含有阿維菌素的發酵液。大量試驗表明，步驟(1)中採用溫度27。C、28.5°C、29°C，培養7、9天；步驟(3)中採用每毫升種子培養基的孢子接種量為4X107個，種子培養搖瓶裝量為30ml種子培養基/250ml搖瓶，或每毫升種子培養基的孢子接種量為6X107個，種子培養搖瓶裝量為50ml種子培養基/250ml搖瓶，或接種量4.5X17個/ml，步驟(4)中採用溫度27°C，轉速300r/mim，培養時間為40小時，或溫度29°C，轉速200r/mim，培養時間為48小時，或溫度28.5。C，轉速230r/mim，培養時間為45小時，步驟(5)採用接種量3%，6%，7%，發酵種瓶裝量為20ml/250ml、40ml/250ml，溫度為27°C、27.5。C、29°C，轉速為200r/mim、230r/mim、270r/mim，時間為240小時、245小時、255小時、260小時，其他條件均與實施例相同，最後也能達到與實施例相同的技術效果。一阿維菌素效價測定阿維菌素含量測定採用HPLC，HP1100色譜系統。色譜柱HypersilODSC-18，5um，250咖X4.Omm;流動相CH30H/H2O90/10;流速1.0mL/min;柱溫25°C;檢測波長246nm。分析方法取發酵液2.5mL，取發酵液2.5rnl，加入甲醇定容至50ml，充分振蕩超聲20min，過0.22m濾膜，濾液用微量進樣器準確吸取20UL樣品濾液注入色譜儀，根據積分面積，利用外標法計算出發酵效價(發酵效價僅指BIa的濃度)。二孢子接種量的確定及其對效價的影響選取一支成熟豐滿的阿維鏈黴菌孢子斜面製備孢子懸浮液，採用一定量的孢子懸浮液接種培養，並與挖塊接種對照比較差異。如圖1顯示，在發酵前期與挖塊接種對比，孢子接種(sporeinoculation)的起步效價低，在48h時效價單位為0，且效價增幅較慢，但在中後期孢子接種效價增幅高於對照的挖塊接種(ck)，且效價在200h左右己超過挖塊接種，說明孢子接種的後勁較大。這可能跟孢子本身的優勢有關，孢子一般是單核的，發酵過程中易保持純種和不退化，同時孢子後勁可能較大。推測可能還與兩種接種方式的不同接種量有關，接種量影響了菌體的生長速度和菌絲形態，菌絲形態在發酵中是一極其重要的參數，從而導致斜面孢子接種量的多少直接影響菌體的整個生長與發酵過程。孢子接種簡單的量化實驗的結果表明不同的接種量對孢子接種的優勢有一定的影響，當每ml種子培養基的孢子接種數量處於4X107和6X107個範圍內，效價變化幅度不大，但是隨著孢子接種量高於107或低於107效價下降的趨勢較為明顯，最適孢子接種量處於4X107ml和6X107個/ml左右。因孢子接種可以保持一個較穩定的接種量，而挖塊接種的接種量比較難以控制，從而也導致挖塊接種的批內重複性實驗不穩定，孢子接種由於孢子分散性好、懸浮液較為均勻導致批內實驗重複性比較好。同時孢子接種的好壞與斜面孢子生長的好壞密切相關，因此孢子接種必需要首先保證孢子培養比較穩定，採用的孢子應是生長成熟豐滿的略呈灰色凸起的阿維鏈黴菌孢子。表l:不同接種量對阿維菌素效價的影響tableseeoriginaldocumentpage10三孢子接種到發酵培養基中時機的確定孢子接種方法因孢子要經過吸水膨脹、萌發到生長成菌絲過程，採用全孢子接種需要確定其接種到培養基中的時機。根據試驗結果，斜面孢子、培養基與培養條件等因素的不同均可能導致移種時間的差異，當每ml種子培養基的孢子接種量處於4乂107禾卩6X107個範圍內時，移種至發酵培養基中時間大約為36h一48h左右，此時，孢子基本已萌發，但菌絲還未出現。此時接種到發酵培養基的孢子即為全孢子接種。四不同接種方式的阿維鏈黴菌種子生長過程的差異為挖掘孢子接種的優勢存在的內因，進一步比較了幾種不同接種方式(孢子接禾中(sporeinoculation)、挖塊接禾中(CK)、菌絲接禾中(myceliainoculation)的阿維鏈黴菌發酵生長與發酵的差異，具體比較了阿維鏈黴菌生長與發酵過程中的營養消耗、過程pH變化、效價增長以及菌絲形態的差異。1.不同接種方式的阿維鏈黴菌種子生長過程的差異對種瓶中26h時不同接種方式的菌絲形態差異比較，可以得到挖塊接種的搖瓶種子生長較快，油鏡下觀察孢子接種與菌絲接種26h時在視野範圍內均只有少量菌絲，而挖塊接種已有大量菌絲繁殖。這是因為挖塊接種的菌塊中含有孢子和菌絲，生長較快；孢子接種由於孢子要經過吸水膨脹、發芽到生長成菌絲的過程，菌絲接成網狀到成團時間明顯晚於挖塊接種；菌絲接種挖的菌絲屬於水洗後的不帶孢子的菌落，接種量相對較少，少量的菌絲要繁殖成大量菌絲並接成網狀結構的過程晚於挖塊接種，但早於孢子接種。移種的時間大概為挖塊接種41h、菌絲接種44h、孢子接種48h。從pH的變化狀況來看，三種接種方式對pH的整個變化趨勢並無影響。一般來說，阿維素產生菌的種子培養前期PH是穩定的，到10h左右開始上升，再下降再上升再緩慢下降，最佳的移種時機可能是第二次上升的最高點，一般此時大概處於種子的對數生長期，此時pH值為6.7-6.8。因為接種量，消毒過程的操作，培養條件的影響出現該轉折點的時刻稍有偏差。基本上三種不同的接種方式的種子生長過程中PH的變化都是遵行這種先升後降再升再緩慢下降的過程。但是具體的變化範圍有所區別，挖塊接種PH變化的峰值最高，變化的幅度最大，菌絲接種的pH變化的峰值最抵，變化幅度最小，孢子接種界於兩者之間，這可能與整個種子生長過程中的底物代謝有關。2.接種方式對阿維鏈黴菌發酵過程的影響實驗結果表明不同接種方式的阿維鏈黴菌發酵過程中的營養消耗、過程pH變化以及菌絲形態均有差異。如圖2所示，在120h前，菌絲接種的總糖消耗速率最快，孢子接種的消耗速率最慢，144h後發酵過程中挖塊接種與菌絲接種的糖耗速率相當，孢子接種的糖耗速率最快；如圖3所示，挖塊接種在前中期(200h前)還原糖濃度一直處於上升時期，峰值最高，孢子接種在前期上升，中期(100h後)的早期開始緩慢下降，中間有一短暫的平穩期，菌絲接種在前期還原糖濃度上升最慢，峰值與孢子接種相當，但上升期比孢子接種長。如圖4表明在前期氨基氮的消耗速率挖塊接種稍快於孢子接種，但在165h左右，挖塊接種與菌絲接種的氨基氮濃度已開始回升，此時孢子接種的氨基氮濃度仍處於下降期，216h後孢子接種方式的氨基氮也開始回升。如圖5所示pH變化趨勢基本相同，但變化幅度各有差異，孢子接種不僅在早早期PH回升速度較快，在後面的pH的穩步下降過程中的下降速度也比其它兩種接種方式要快，這與菌體的碳氮源消耗與代謝有關。在220h小時左右，pH均大幅度開始回升，菌絲接種的PH回升最快，推測菌絲接種方式在後期最先開始自溶。挖塊接種因延遲期較短，菌體生長很快，總糖和氨基氮前中期消耗速率均比孢子接種快，發酵周期較短；而用孢子接種時，延遲期相對較長，生長達到尖峰時間推遲，總糖和氨基氮開始消耗較慢，但孢子接種後勁大，中後期總糖消耗速率最快，糖的利用率也相對要更高，如圖6表明採用孢子接種方式阿維菌素的最終效價比對照挖塊接種提高了10%以上，比菌絲接種提高了20%以上。菌絲接種在生長快慢上介於挖塊接種與菌絲接種之間，效價增長最慢，糖的利用率最低，到發酵終點時效價最低。因此與挖塊接種和菌絲接種相比，孢子接種方式不僅在接種量上易控制，發酵結果較穩定，效價增幅上比挖塊接種及菌絲接種有優勢。權利要求1.一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於包括以下工藝步驟(1)將阿維鏈黴菌接種至斜面培養基，在溫度27-29℃下，培養7-9天；(2)取上述的阿維鏈黴菌孢子斜面，用無菌水振蕩洗滌斜面製備成孢子懸浮液；(3)計算孢子懸浮液中孢子的數量，然後用移液管吸取孢子懸浮液至種子培養搖瓶中的種子培養基中，使每毫升種子培養基的孢子接種量為4×107-6×107個，種子培養搖瓶裝量為30-50ml種子培養基/250ml搖瓶；(4)將步驟(3)的孢子懸浮液進行搖床培養，在溫度27-29℃下，轉速為200-300r/mim的旋轉式搖床上培養40-48小時，得到全孢子液；(5)取上述的全孢子液，按培養基體積3％-7％的接種量，接種到發酵培養基中，進行搖床培養，發酵搖瓶裝量為20-40ml發酵培養基/250ml搖瓶，在溫度27-29℃下和溼度40％-50％下，轉速為200-300r/mim的旋轉式搖床上培養240-260小時，得到含有阿維菌素的發酵液。2.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於所述的斜面培養基組分重量百分比為酵母膏O.1%、麥芽糖0.1%、胰蛋白腖0.2%、葡萄糖0.4%、瓊脂粉2%，餘量為蒸餾水，並使pH值調至7.2。3.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於種子培養基含有玉米澱粉30g/L、玉米漿5g/L、酵母膏15g/L、KH2P044g/L、MgS047H200.2g/L，並i周pH為7.0-7.2。4.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於發酵培養基含有玉米澱粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生餅粉5g/L、KH2P040.5g/L，並調pH為7.0-7.2。5.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(3)中用採用血球記數板計算孢子懸浮液中孢子的數量，每毫升種子培養基的孢子接種量為4X107-5X107個，種子培養搖瓶裝量為30-40ml種子培養基/250ml搖瓶。6.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(3)中每毫升種子培養基的孢子接種量為5X107-6X107個，種子培養搖瓶裝量為40-50ml種子培養基/250ml搖瓶。7.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(4)中搖床培養條件為溫度為27-28°C，搖床轉速為230-270r/mim，培養時間為42-46小時。8.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(4)中搖床培養條件為溫度為28-29°C，搖床轉速為240-260r/mim，培養時間為43-45小時。9.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(5)中搖床培養條件為種子搖瓶裝量為25-35ml發酵培養基/250ml搖瓶，接種量為3%-5%，溫度為27-28"C，搖床轉速為230_270r/mim，培養時間為245-255小時。10.如權利要求1所述的一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，其特徵在於步驟(5)中搖床培養條件為種子搖瓶裝量為28-32ml發酵培養基/250ml搖瓶，接種量為5%-7%，溫度為28-29°C，搖床轉速為240-260r/mim，培養時間為247-253小時。全文摘要一種採用全孢子接種工藝生產阿維菌素的方法，屬於微生物發酵
技術領域：
。其工藝步驟包括阿維鏈黴菌的斜面培養；製成孢子懸浮液；確定接種量；進行種子搖瓶培養；最後進行發酵培養，得到含有阿維菌素的發酵液。本發明通過對阿維鏈黴菌通過純化培養、種子培養和發酵培養，最後得到阿維菌素，此方法設計合理，簡單易行。通過確定孢子的接種量和孢子接種到發酵培養基的時機，確定了最優條件，本發明與挖塊接種和菌絲接種相比，孢子接種方式不僅在接種量上易控制，發酵結果較穩定，效價增幅上比挖塊接種及菌絲接種有優勢，最大的效價達到4600μg/ml以上。文檔編號C12R1/465GK101429536SQ20081016305公開日2009年5月13日申請日期2008年12月15日優先權日2008年12月15日發明者炬儲,儲消和,姚小員,莊英萍,張嗣良,梁劍光,王永紅申請人:浙江升華拜克生物股份有限公司