小麥禾穀孢囊線蟲特異性scar標記及其快速pcr檢測方法

2023-06-09 09:01:31 1

專利名稱：小麥禾穀孢囊線蟲特異性scar標記及其快速pcr檢測方法
小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記及其快速PCR檢測方法技術領域
本發明屬生物技術領域，涉及小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記全序列、特異性 SCAR標記引物序列及小麥禾穀孢囊線蟲SACR特異性標記快速PCR檢測方法。
背景技術：
小麥禾穀孢囊線蟲(Heterodera avenae ；俗名 Cereal Cyst Nematode,CCN)是溫帶禾穀作物上的世界性重要病原線蟲，自1874年在德國被發現以來，隨後在英國、俄羅斯、 挪威、澳大利亞、加拿大、美國、中國等40多個國家均發生不同程度的危害，嚴重影響禾穀作物尤其是麥類作物的產量和質量。我國自1989年彭德良等首次在湖北省天門縣發現小麥禾穀孢囊線蟲為害小麥後，目前已發現在湖北、河南、河北、北京、山東、山西、內蒙古、青海、江蘇、安徽、甘肅、陝西、寧夏等13省市都有禾穀孢囊線蟲的分布。因此，該線蟲已成為嚴重威脅我國小麥生產的主要病害。
在為害小麥的孢囊線蟲中，主要有禾穀孢囊線蟲(H. avenae)，菲利普孢囊線蟲 (H. filipjevi)，大麥孢囊線蟲(H. Iatipons)三個種，它們具有很相似的形態學結構，形態學特徵差異較小。目前孢囊線蟲的鑑定大部分依賴於傳統的形態學鑑定方法，耗時較多且需要很熟練的專業技術，通常需要專門從事分類的人員來完成，從而給危害小麥的孢囊線蟲鑑定增加了難度。
以PCR為基礎的分子生物學手段為解決線蟲快速鑑定中存在的問題提供了工具。隨著PCR檢測技術的發展，線蟲的分子診斷取得重要進展。Mulholland等(1996)分別構建了基於rDNA-ITS的馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲 (G. pallida)的特異性引物，描述了這兩種線蟲的特異性多重PCR檢測技術，能快速鑑定馬鈴薯白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其複合種群。與標準的PCR途徑不同，這一技術在每個PCR反應中應用了 3個引物，通用引物5. 8S rRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物ITSl-Gr和馬鈴薯白線蟲的特異性引物ITSl-Gp。通過一次PCR測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種。Bulman和Marshall (1997)在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的rDNA-ITS的序列結構基礎上，構建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSrf 和白線蟲的特異性引物PITSp4，應用多重PCR技術可以快速診斷馬鈴薯孢囊線蟲。通用引物ITS5與PITSr3可以擴增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，通用引物ITS5與PITSp4 可以擴增出265bp馬鈴薯白線蟲的特異性片段。在一個PCR反應中，即使複合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從複合種群檢測出金線蟲。
Amiri和Subbotin等Q002)構建了基於rDNA-ITS的甜菜孢囊線蟲 (H. schachtii)特異性引物SHF6.特異性引物SHF6與通用引物AB28引物結合，同時與通用引物D2A和D!3B放在一個PCR反應體系中進行一步雙重PCR，從58個孢囊線蟲群體中成功地鑑定出甜菜孢囊線蟲，甜菜孢囊線蟲群體中可以擴增200bp特異性片段，而非甜菜孢囊線蟲中不能擴增出200bp的片段。
彭德良和SiAbotin等Q001)構建了基於rDNA-ITS區域上的大豆孢囊線蟲特異性引物GlyFl，應用兩組引物D3A和D!3B及大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl和引物rDNA2 成功地對大豆孢囊線蟲進行了分子診斷研究。內標引物D3A和D!3B是保證DNA的有效性， 第二對引物GlyFI和rDNA2是特異性檢測大豆孢囊線蟲。用這兩對引物進行的雙重PCR擴增，從所有52個大豆孢囊線蟲群體都能擴增ISlbp的大豆孢囊線蟲的特異性DNA片段，而在所有測試的其他8種孢囊線蟲22個群體不能擴增出ISlbp的特異性片段。大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl靈敏性非常高，能從單條幼蟲的微量DNA中擴增出大豆谷孢囊線蟲種特異性片段。
此外，國外有一些基於基因組DNA的SCAR標記用於植物線蟲特異性檢測的報導。 在馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的快速分子診斷中，Fullanodo等(1999)用RAPD隨機引物0PG5分別擴增出馬鈴薯金線蟲特異性片段826bp，馬鈴薯白線蟲特異性片段llOObp。對擴增出的片段進行全序列分析，將RAPD標記轉化成SCAR標記，設計馬鈴薯金線蟲的SCAR 標記特異性引物FullGrf和FullGn ，擴增出了 315bp的特異性片段；設計馬鈴薯白線蟲的 SCAR特異性標記引物FullGpf和FullGpr，擴增出79^ρ的特異性片段，從而可以快速檢測馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲。
Ou, S. Q. Peng D. L.(歐師琪彭德良等2008)採用RAPD技術，獲得了基於大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標記，構建了大豆孢囊線蟲特異性SCAR標記的特異性引物SCNFI和SCNRI，可擴增出473bp大豆孢囊線蟲的特異性SCAR標記片段，選用核糖體引物D2A和D!3B作為內標與上述特異性引物SCNFl和SCNRl相結合，發明了一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲，PCR產物可獲得47!3bp的特異性片段和SOObp的內標片段，在PCR擴增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 473bp的特異性SCAR標記片段和SOObp片段。
國內外關於小麥禾穀孢囊線蟲核糖體DNA的ITS區域有一些研究。主要集中在 ITS序列特徵、利用限制性內切酶分析ITS區酶切片段的長度多態性等方面，但未見基於基因組DNA的SCAR標記引物特異性檢測小麥禾穀孢囊線蟲的報導。因此，開發小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記，建立快速PCR檢測方法，對於快速準確鑑定小麥禾穀孢囊線蟲的種類，明確其發生與分布特徵，制定相應的防控措施等具有重要意義。發明內容
針對上述技術領域的空白，本發明提供小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記的全長序列，同時提供了 SCAR標記的特異性引物。
本發明還提供小麥禾穀孢囊線蟲特異性SACR快速PCR檢測方法，將為制定線蟲的快速分子檢測方法，開展小麥禾穀孢囊線蟲病的早期診斷，制定其綜合治理對策提供理論依據。
小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段，其特徵在於具有如SEQ ID NOl 所示的核苷酸序列。
根據小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段設計的特異性引物。
優選為HaFl和HaRl，其序列為
HaFl :5』 -TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3，
HaRl :5，-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3，
小麥禾穀孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，其特徵在於PCR反應體系中含有上述特異性引物。
優選所述PCR反應體系中含有特異性引物HaFl和HaRl。
本發明利用RAPD技術，獲得了基於小麥禾穀孢囊線蟲基因組DNA的特異性RAPD 標記，將RAPD標記轉換成SCAR標記，經克隆、測序後獲得了特異性SCAR標記的全長序列 SEQ ID N01，利用該SCAR標記的保守序列可以設計出其特異性引物，用於PCR檢測出目標線蟲。
本發明構建了特異性SCAR標記的特異性引物HaFl和HaRl (即SEQ ID N02和SEQ ID N03)。利用小麥禾穀孢囊線蟲特異性引物HaFl和HaRl，在PCR擴增條件下，所有小麥禾穀孢囊線蟲群體都獲得了 IOlObp的特異性SCAR標記片段，而其它線蟲類則沒有IOlObp的特異性SCAR標記片段。本發明構建的特異性引物HaFl和HaRl，特異性強，準確性好，靈敏度尚。
本發明應用特異性SCAR標記PCR技術檢測目標線蟲，與隨機擴增多態性DNA技術 (RAPD-PCR)、核糖體DNA限制性片段長度多態性技術(RFLP-PCR)檢測方法相比，更省時、更準確、更靈敏，能夠更加快速、準確地檢測小麥禾穀孢囊線蟲。該技術可應用於攜帶小麥禾穀孢囊線蟲的田間土壤樣品及植株的早期快速分子檢測，具有較高的實用價值。


圖1 用隨機引物0PD13擴增的小麥禾穀孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲大麥孢囊線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲的RAPD的多態性結果。
M為標準的DNA分子質量標記(DNA markerDL 2,000) ； 1_6為小麥禾穀孢囊線蟲群體(編碼為HaOl，Ha03, Ha07, Hal2, Hal7, Ha 18) ；7-8為菲利普孢囊線蟲群體(編碼為 HfOl, Hf04) ；9為大豆孢囊線蟲群體(編碼為HgOl) ； 10為旱稻孢囊線蟲(編碼為HeOl)； 11為大麥孢囊線蟲群體(編碼為H101) 12為馬鈴薯腐爛莖線蟲群體(編碼為DdOl) ；13為陰性對照(群體代碼及來源見表1和表2)
圖2 小麥禾穀孢囊線蟲SCAR標記特異性引物擴增檢測的特異性DNA片段M為標準的DNA分子質量標記(DNA markerDL 2，000) ； 1_8分別為小麥禾穀孢囊線蟲8個不同群體(編碼為HaOl, Ha03, Ha07, Ha08, HalO, Hall, Hal2，Ha 17) ；9為菲利普孢囊線蟲群體 (編碼為HfOl) ；10為大豆孢囊線蟲群體(編碼為HgOl) ；11為旱稻孢囊線蟲群體(編碼為HeOl) ；12為為大麥孢囊線蟲群體(編碼為H101) 13為馬鈴薯腐爛莖線蟲群體(編碼為 DdOl) ；14為陰性對照(群體代碼及來源見表1和表2)
圖3 小麥禾穀孢囊線蟲SCAR標記特異性引物的靈敏度檢測
M 為標準的 DNA 分子質量標記(DNA marker DL 2,000) ； 1-7 分別為 1，10、IOO"2, 0_3，IO-4, IO-5, IO-6μ 1小麥禾穀孢囊線蟲單個孢囊的DNA ；8為陰性對照。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
本發明的實驗選用的材料
16個小麥禾穀孢囊線蟲群體為本實驗室長期從山東省、青海省、河南省、甘肅省、 安徽等地收集且在小麥上進行繁殖的孢囊線蟲種群，11個菲利普孢囊線蟲群體為本實驗室從河南等省市收集保存，2個小麥禾穀孢囊線蟲國外群體，3個菲利普孢囊線蟲國外群體以 及其他線蟲群體為本實驗室工作人員收集(表1、表2〉。上述樣本本實驗室均有保存，可以 對公眾發放。
〔0030〕 表1供試小麥禾穀孢囊線蟲及其它線蟲樣品代碼及群體來源 〔0031〕
權利要求
1.小麥禾穀孢囊線蟲特異SCAR標記的DNA片段，其特徵在於該DNA片段具有SEQIDNOl所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段的保守序列設計的特異性引物。
3.權利要求2所述的特異性引物，其為HaFl和HaRl，其序列為HaFl :5』 -TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3』，HaRl :5』 -GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3，。
4.小麥禾穀孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，其特徵在於PCR反應體系中含有權利要求2或3所述的特異性引物。
全文摘要
本發明為「小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記及其快速PCR檢測方法」，屬生物技術領域。小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段，其特徵在於該DNA片段具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。根據小麥禾穀孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段設計的特異性引物HaF1和HaR1，在PCR快速檢測小麥禾穀孢囊線蟲的方法中，可擴增出1010bp的特異性片段。本發明提高了分子檢測靈敏度並且快速準確，在小麥禾穀孢囊線蟲檢測和小麥孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應用價值。
文檔編號C12N15/11GK102559669SQ201210032018
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月13日 優先權日2012年2月13日
發明者亓曉莉, 彭德良, 彭煥, 賀文婷, 黃文坤 申請人:中國農業科學院植物保護研究所